• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR方法的建立及應(yīng)用

    2017-11-29 08:04:44李曉波王淑菁王莎莎岳秉飛賀爭鳴
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    王 吉,付 瑞,李曉波,王淑菁,王莎莎,李 威,秦 驍,鞏 薇,岳秉飛,賀爭鳴

    (中國食品藥品檢定研究院,國家實(shí)驗(yàn)動物微生物遺傳檢測中心,北京 100050)

    牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR方法的建立及應(yīng)用

    王 吉,付 瑞,李曉波,王淑菁,王莎莎,李 威,秦 驍,鞏 薇,岳秉飛*,賀爭鳴

    (中國食品藥品檢定研究院,國家實(shí)驗(yàn)動物微生物遺傳檢測中心,北京 100050)

    目的建立用于牛源樣本中牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)雙重RT-PCR檢測方法。方法選擇已發(fā)表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5’ UTR區(qū)高保守區(qū)域基因作為靶基因,分別設(shè)計合成引物,建立雙重BVDV RT-PCR方法,并對方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性等進(jìn)行方法學(xué)評價。同時用建立的RT-PCR方法檢測了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性樣本和64份牛血漿樣本。牛源樣本和64份牛臨床樣本。結(jié)果建立的BVDV RT-PCR檢測方法與牛副流感病毒III型(BPIV3)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)均無交叉反應(yīng);檢測BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低濃度分別為每微升8.87 × 102拷貝和6.31 × 102拷貝,BVDV 1型和2型cDNA在-30℃冰箱放置12個月仍可檢測出目的條帶。應(yīng)用建立的BVDV RT-PCR方法檢測41批次牛源樣本和64份牛血漿樣本,核酸陽性率分別為14.6%和29.7%。結(jié)論建立的BVDV RT-PCR檢測方法具有快速、特異、敏感及穩(wěn)定的特點(diǎn),可用于牛源樣本攜帶BVDV核酸的檢測。

    牛病毒性腹瀉病毒;RT-PCR;牛源樣本

    牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)又稱黏膜病病毒(mucosal disease virus,MDV),屬黃病毒科(flaviviridae)瘟病毒屬(pestivirus)。病毒粒子大小為40~60 nm,為有囊膜單股正鏈RNA病毒[1-2]。BVDV可引起許多臨床癥狀及疾病,包括繁殖障礙、呼吸綜合征、先天性缺陷、腸炎、持續(xù)感染(PI)和黏膜病(MD)等,患牛表現(xiàn)發(fā)熱、白細(xì)胞減少、腹瀉、流產(chǎn)、黏膜糜爛潰瘍等急性感染癥狀及小牛先天持續(xù)性感染等癥狀。除牛以外,易感動物還包括駱駝、綿羊、山羊、豬、鹿及多種野生反芻動物。該病毒呈世界性分布,廣泛分布于美國、澳大利亞、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度及非洲和歐洲許多養(yǎng)牛發(fā)達(dá)國家,是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要病原之一[2],給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

    隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,動物源性生物制品的開發(fā)利用日益增多,尤其是牛源性生物制品的開發(fā)利用越來越廣泛。同時伴隨著科技及對藥品生物制品質(zhì)量發(fā)展的要求,人們對牛源性制品是否攜帶或潛在病毒污染,攜帶或潛在病毒是否會通過直接或間接途徑對人造成危害或者傳染病的擴(kuò)散也越來越關(guān)注。為保障人民用藥安全及避免傳染病的擴(kuò)散,最大限度地降低使用牛源性生物制品傳播牛攜帶相關(guān)病毒的風(fēng)險,本實(shí)驗(yàn)建立了快速、特異、敏感的BVDV雙重RT-PCR方法,用于對牛及人用牛源性生物制品及原材料可能攜帶或潛在BVDV的檢測,對保證牛源材料及牛源生物制品的使用安全性、保障人民用藥安全具有重要意義。

    1 材料和方法

    1.1病毒與樣品

    牛病毒性腹瀉病毒1型(bovine viral diarrhea virus type 1,BVDV1)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)(編號分別為VR-1422、VR-281):購自美國ATCC公司;牛病毒性腹瀉病毒2型(bovine viral diarrhea virus type 2,BVDV2)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV):本室凍存;乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV):由本院病毒一室提供;BVDV1和BVDV2 pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品:委托寶生物工程(大連)有限公司合成;BVDV1和BVDV2引物:由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;41批次人用牛源樣本(編號:Ny1~Ny41):國內(nèi)8省市12個廠家和國外2個廠家提供;64份牛肛拭子樣本(編號:g1~g64):國內(nèi)某單位提供。

    1.2主要試劑與儀器

    RNA快速提取試劑盒購自Qiagen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司;Taq DNA聚合酶和100 bp DNA ladder marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀:美國Bio-Rad公司;核酸瓊脂糖凝膠電泳儀:美國Bio-Rad公司PowerPac Basic;凝膠成像分析儀:美國Kodak公司GL212 Pro。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 引物設(shè)計

    分析已報道的BVDV基因組序列,將不同株進(jìn)行比對,根據(jù)GenBank中登錄的BVDV 1型和2型毒株基因序列(序列號:M31182.1、AF502399.1)選擇包含5’ UTR區(qū)高保守區(qū)域基因作為靶基因,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2組引物,建立雙重RT-PCR檢測方法。

    表1 用于擴(kuò)增5’ UTR區(qū)高保守區(qū)域2組引物序列及位置

    1.3.2 病毒RNA提取

    對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)、正常BT細(xì)胞按照RNA/DNA快速提取試劑盒操作方法進(jìn)行RNA/DNA提取。提取后的RNA立即進(jìn)行cDNA的合成,剩余的RNA及DNA凍存于-70℃冰箱備用。

    1.3.3 反轉(zhuǎn)錄

    通過對隨機(jī)引物及AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定反轉(zhuǎn)錄體系為:5× RNA PCR buffer 2.5 μL,dNTPs mixture 2.5 μL,RNase Free ddH2O 9.5 μL,隨機(jī)引物1 μL,RNase Inhibitor 1 μL,AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL,病毒RNA 8 μL。反應(yīng)條件為:37℃,90 min;42℃,15 min;95℃,5 min。獲得cDNA,保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4 RT-PCR檢測方法的建立

    以獲得的BVDV1和BVDV2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對2組引物PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、10×buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,通過對正常BT細(xì)胞、BVDV1、BVDV2進(jìn)行PCR擴(kuò)增來確定RT-PCR反應(yīng)的最佳模式[6]。

    1.3.5 RT-PCR產(chǎn)物的檢測

    取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)進(jìn)行電泳鑒定。電泳緩沖液為1× TAE buffer(0.04 mol/L Tris-乙酸,0.001 mol/L EDTA,pH 8.0),110 V電泳30 min,在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置,以100 bp DNA ladder marker為參照物,判定結(jié)果。RT-PCR陽性擴(kuò)增片段進(jìn)行測序,通過與GenBank中BVDV1和BVDV2序列進(jìn)行比對以確定PCR檢測的準(zhǔn)確性[6]。

    1.3.6 特異性試驗(yàn)

    用2組引物分別以正常BT細(xì)胞、BVDV1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、BVDV2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、牛副流感病毒3型(BPIV3)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)cDNA為模板,用所建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定[6]。

    1.3.7 敏感性試驗(yàn)

    將起始濃度為每微升8.87 × 1010拷貝和6.31 × 1010拷貝的BVDV1和BVDV2質(zhì)粒樣本做系列倍比稀釋,分設(shè)10-3到10-9共7個濃度梯度進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,判斷所能擴(kuò)增的最小DNA質(zhì)粒模板濃度[6]。

    1.3.8 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    BVDV1和BVDV2質(zhì)粒及同一批PCR檢測試劑于-30℃冰箱放置3個月、6個月、12個月時,進(jìn)行PCR檢測。3次試驗(yàn)各做3個重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[5]。

    1.3.9 方法的應(yīng)用及驗(yàn)證

    BVDV1、BVDV2、正常BT細(xì)胞、2份已知BVDV陰性對照牛血清、64份牛肛拭子樣本(編號:g1~g64)、41批次人用牛源生物制品及原材料樣本(編號:Ny1~Ny41),具體信息見表2。同時提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,用2組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

    擴(kuò)增到的陽性樣品,需要對可見的特異性目的條帶進(jìn)行純化測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析,與GenBank中BVDV1和BVDV2核酸序列進(jìn)行比對,驗(yàn)證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果

    2.1PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

    通過對2組引物PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化,確定了PCR最佳反應(yīng)體系為:10× Ex Taq buffer(含Mg2+)2 μL,dNTPs mixture(10 mmol/L)2 μL,Taq HS酶(5 U/μL)0.5 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL,DNA 2 μL,補(bǔ)水至20 μL;PCR最佳反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán);72℃再延伸5 min。

    2.2PCR產(chǎn)物的檢測及特異性實(shí)驗(yàn)

    2組引物特異性實(shí)驗(yàn)顯示,以BVDV1質(zhì)粒和BVDV2質(zhì)粒為模版有明顯目的條帶出現(xiàn),以BPIV3、CSFV、JEV及正常BT細(xì)胞的cDNA為模版,均無目的條帶出現(xiàn)(見圖1)。結(jié)果顯示特異性可以達(dá)到100%。

    2.3檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

    選擇引物1和引物2,PCR擴(kuò)增BVDV 1型和BVDV 2型陽性片段進(jìn)行測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析,與GenBank中BVDV 1型和BVDV 2型核酸序列同源性均為99%,說明該方法檢測準(zhǔn)確性較好。

    2.4敏感性試驗(yàn)

    圖2結(jié)果顯示2組引物檢測病毒DNA濃度均可以達(dá)到每微升102拷貝。

    表2 41批次牛源樣本信息

    注:M:100 bp DNA ladder marker;1:BVDV;2:BT細(xì)胞對照;3:BPIV3;4:CSFV;5:JEV。圖1 引物特異性驗(yàn)證Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1: BVDV; 2: BT cells for control; 3: BPIV3; 4: CSFV; 5: JEV.Fig.1 Specificity validation of the primers

    注:M:100 bp DNA ladder marker;1~7:10-3~10-9稀釋。圖2 通過BVDV質(zhì)粒濃度梯度測定2對引物PCR檢測敏感性Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1-7: 10-3-10-9 dilution.Fig.2 Sensitivity of 2 pairs of primers determined by BVDV plasmid in gradient concentration

    2.5穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    電泳結(jié)果顯示,BVDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在-30℃冰箱放置3個月、6個月、12個月時,用2組引物進(jìn)行檢測,分別能擴(kuò)增出約151 bp和303 bp可見目的條帶(圖3)。

    注:M:100 bp DNA ladder marker;1~3:-30℃冰箱放置3個月的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品;4~6:-30℃冰箱放置6個月的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品;7~9:-30℃冰箱放置12個月的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。圖3 2組引物PCR檢測穩(wěn)定性Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1-3: Plasmid standard sample stored at -30℃ for 3 months; 4-6: Plasmid standard sample stored at -30℃ for 6 months; 7-9: Plasmid standard sample stored at -30℃ for 12 months.Fig.3 Stability of the 2 pairs of primers

    注:M:100 bp DNA ladder marker;1,46:BVDV;2,47:BT細(xì)胞;3~23:g1~g21;24~45:g22~g43;48~68:g44~g64。圖4 PCR檢測64份牛肛拭子樣本(g1~g64)電泳結(jié)果Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1, 46: BVDV; 2, 47: BT cells; 3-23: g1-g21 bovine anal swab samples; 24-45: g22-g43 bovine anal swab samples; 48-68: g44-g64 bovine anal swab samples.Fig.4 Results of electrophoresis of 64 bovine anal swab samples (g1-g64) detected by the PCR method

    2.6對牛肛拭子樣本檢測

    對64份牛肛拭子樣本(編號:g1~g64)進(jìn)行檢測,電泳結(jié)果顯示有19份肛拭子樣本(編號:g1、g4、g9、g15、g17、g34、g35、g43、g48、g51、g54~g61、g63)擴(kuò)增出約303 bp的可見目的條帶,正常BT細(xì)胞和其他45份牛肛拭子本未擴(kuò)增出可見目的條帶。樣本電泳結(jié)果見圖4。

    2.7對牛源性樣本進(jìn)行病毒檢測

    對41批次牛源樣本進(jìn)行BVDV1和BVDV2病毒檢測,有5批次牛源樣本(編號:Ny16、Ny29、Ny32、Ny35、Ny41)擴(kuò)增出約303 bp的可見目的條帶,有1批次牛源樣本(編號:Ny26)擴(kuò)增出約151 bp的可見目的條帶,其他35批次牛源樣本未擴(kuò)增到可見目的條帶。樣本電泳結(jié)果見圖5。

    注:M:100 bp DNA ladder marker;1,44∶2型BVDV;2,25,43:BT細(xì)胞;3~4:陰性牛血清對照;5~23:Ny1~Ny19牛源樣本;24:1型BVDV;26~33:Ny20~Ny27;34~42:Ny28~Ny36;45~49:Ny37~Ny41。圖5 PCR檢測41批次牛源樣本(Ny1~Ny41)1型和2型BVDV病毒的電泳結(jié)果Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1, 44: BVDV2; 2, 25, 43: BT cells; 3-4: Negative bovine serum control; 5-23: Ny1-Ny19 bovine-derived samples; 24: BVDV1; 26-33: Ny20-Ny27 bovine-derived samples; 34-42: Ny28-Ny36 bovine-derived samples; 45-49: Ny37-Ny41 bovine-derived samples.Fig.5 Results of electrophoresis of BVDV1 and BVDV2 in 41 bovine-derived samples (Ny1-Ny41) detected by the PCR method

    2.8檢測結(jié)果的驗(yàn)證

    將1型BVDV和2型BVDV與GenBank中BVDV1和BVDV2標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對,其同源性均為99%;BVDV2核酸陽性樣本g1、g4、g9、g15、g17、g34、g35、g43、g48、g51、g54~g61、g63、Ny16、Ny29、Ny32、Ny35、Ny41擴(kuò)增產(chǎn)物純化測序,與GenBank中BVDV2標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對,其同源性均在95%以上;BVDV1核酸陽性樣本Ny26擴(kuò)增產(chǎn)物純化測序,與GenBank中BVDV1標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對,其同源性為98%。檢測結(jié)果顯示牛肛拭子樣本陽性率為29.69%(19/64),牛源樣本陽性率為14.6%(6/41)。

    3 討論

    BVDV是牛感染率較高、危害性較大的傳染病病原之一,國內(nèi)外已建立了多種檢測方法,包括血清學(xué)及PCR檢測方法等[2, 3,7-9]。但未見有針對牛源制品及牛源制品原輔材料外源BVDV檢測的報道,中華人民共和國藥典亦沒有關(guān)于牛源制品及原輔材料檢測的規(guī)定[10]。藥典在“新生小牛血清檢測”中雖然有關(guān)于新生牛血清用細(xì)胞接種法和免疫熒光法檢測病毒的規(guī)定[10],但沒有更為敏感特異的分子生物學(xué)檢測方法,針對人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的檢測還是空白。

    本研究檢測了國內(nèi)外4個廠家人用生物制品成品(包括小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液、重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子滴眼液等)11批次,結(jié)果均為陰性;檢測國內(nèi)外10個廠家用于生產(chǎn)人用牛源性生物制品的原料小牛血清及實(shí)驗(yàn)用小牛血清(包括胎牛血清)30批次,陽性率為20%(6/30)。6批次BVDV核酸陽性小牛血清分別屬于5個省市的5個廠家,BVDV檢出率為50%。檢測的64份牛肛拭子樣本又來源另一省市,由此可見BVDV分布范圍之廣及對人用牛源性生物制品存在的潛在危險。

    我們建立的BVDV RT-PCR檢測方法,其目的主要是用于牛及人用牛源性生物制品、及人用牛源性生物制品原材料攜帶或潛在污染BVDV的檢測,如小牛血清去蛋白注射液、牛肉浸液、牛膽膏、牛骨粉、牛骨源性明膠;以及用于生產(chǎn)牛源制品的原材料,如牛血漿、牛組織、牛源細(xì)胞等。張淑琴等[4]從送檢的牛腎細(xì)胞(MDBK細(xì)胞)中分離到BVDV病毒,本實(shí)驗(yàn)也在用于生產(chǎn)牛源生物制品的牛血漿中檢測到BVDV。說明用于牛源生物制品生產(chǎn)的原材料確實(shí)存在BVDV的污染。

    為了保障人民用藥的安全,最大限度地降低使用牛源性生物制品傳播牛攜帶相關(guān)病毒的風(fēng)險,我們建立了特異、敏感、操作簡單的RT-PCR方法,用于牛及牛源性生物制品及其原輔材料攜帶外源病毒的檢測,完善了BVDV的檢測技術(shù),為研發(fā)BVDV RT-PCR檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ),也為今后制定相關(guān)技術(shù)的國家標(biāo)準(zhǔn),在全國范圍內(nèi)推動牛源制品生產(chǎn)企業(yè)開展牛源制品及原輔材料BVDV檢測提供了技術(shù)支撐。

    [1] 殷震, 劉景華. 動物病毒學(xué) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 645-652.

    [2] 李兆華. RT-PCR技術(shù)在BVDV檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2010, 31(2): 50-51.

    [3] 郭銳, 陳平, 田永祥, 等. 快速檢測牛病毒性腹瀉病毒實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)建立及應(yīng)用 [J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 50(8): 1640-1643.

    [4] 張淑琴, 譚斌, 程世鵬. 牛病毒性腹瀉病毒基因2型毒株的分離與鑒定 [J]. 中國動物傳染病學(xué)報, 2016, 24(3): 83-86.

    [5] Bazzucchi M, Bertolotti L, Giammarioli M, et al. Complete genome sequence of a bovine viral diarrhea virus subgenotype 1h strain isolated in Italy [J]. Genome Announc, 2017, 5(8): e01697-16.

    [6] 王吉, 付瑞, 衛(wèi)禮, 等. 腦心肌炎病毒(EMCV)RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(7): 44-49.

    [7] Baillargeon P, Arango-Sabogal JC, Wellemans V, et al. Determining bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis infections in dairy cattle using precolostral blood [J]. Can Vet J, 2017, 58(4): 360-364.

    [8] Toohey-Kurth K, Sibley SD, Goldberg TL. Metagenomic assessment of adventitious viruses in commercial bovine sera [J]. Biologicals, 2017, 47: 64-68.

    [9] Zoccola R, Mazzei M, Carrozza ML, et al. A newly developed BVDV-1 RT-qPCR Taqman assay based on Italian isolates: evaluation as a diagnostic tool [J]. Folia Microbiol (Praha), 2017, 62(4): 279-286.

    [10] 陳竺, 邵明立, 吳湞, 等. 中華人民共和國藥典 [S]. 2015年版, 三部(通則), 新生牛血清檢測要求, 通則: 144.

    EstablishmentandapplicationofaRT-PCRdetectionmethodforbovineviraldiarrheavirus

    WANG Ji, FU Rui, LI Xiao-bo, WANG Shu-jing, WANG Sha-sha, LI Wei, QIN Xiao, GONG Wei, YUE Bing-fei*, HE Zheng-ming

    (National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animal, Beijing 102629, China)

    ObjectiveTo establish a dual RT-PCR detection method for bovine viral diarrhea virus (BVDV) in bovine-derived samples.MethodsThe primers were designed and synthesized according to the published BVDV1 and BVDV2 genes containing highly conservative sequences in the 5’ untranslated regions (5’ UTR) to establish the dual RT-PCR method. The specificity, sensitivity, stability of this method were evaluated. Then 41 bovine-derived samples and 64 bovine plasma samples including bovine calf serum, deproteinized calf serum extract and one lienal polypeptide injection were detected with this method.ResultsThere was no cross reaction with bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3), classical swine fever virus (CSFV) and Japanese encephalitis virus (JEV) when samples were detected with the established dual RT-PCR method. The lowest concentration of template DNA for detection of BVDV1 and BVDV2 was 8.87 × 102copies and 6.31 × 102copies per microliter, respectively. Electrophoresis bands of about 151 bp and 303 bp were still amplified and detected after the BVDV1 and BVDV2 cDNA was stored at -30℃ for 12 months. The BVDV positive rate of 41 bovine-derived samples and 64 bovine plasma samples detected with this dual RT-PCR method was 14.6% and 29.7%, respectively.ConclusionsThe established dual RT-PCR method has the advantages of high efficiency, specificity, sensitivity and stability, and can be used for the detection of BVDV in bovine-derived samples.

    Bovine viral diarrhea virus; RT-PCR; Bovine-derived samples

    中國食品藥品檢定研究院學(xué)科帶頭人培養(yǎng)基金項(xiàng)目(編號:2015X5)。

    王吉(1974 -),女,副研究員,研究方向:微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail: wj_nd_jds@sina.com

    岳秉飛(1960 -),研究員,研究方向:實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。E-mail: y6784@126.com

    R-33

    A

    1671-7856(2017) 11-0068-07

    10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.014

    2017-05-11

    猜你喜歡
    檢測方法
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    學(xué)習(xí)方法
    可能是方法不對
    小波變換在PCB缺陷檢測中的應(yīng)用
    用對方法才能瘦
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
    四大方法 教你不再“坐以待病”!
    Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
    中文字幕人妻丝袜一区二区 | 亚洲综合精品二区| av国产精品久久久久影院| 久久青草综合色| 免费观看性生交大片5| 国产99久久九九免费精品| 观看美女的网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线观看三级黄色| 欧美另类一区| 2018国产大陆天天弄谢| 综合色丁香网| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲图色成人| 丝袜喷水一区| 一区福利在线观看| 蜜桃在线观看..| 蜜桃在线观看..| 免费在线观看完整版高清| 十八禁网站网址无遮挡| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日本色播在线视频| 国产成人91sexporn| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产熟女欧美一区二区| 色网站视频免费| 国产精品av久久久久免费| 国产黄频视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 黄色怎么调成土黄色| 丰满少妇做爰视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久国产欧美日韩av| 免费黄网站久久成人精品| 丁香六月天网| 搡老岳熟女国产| 久久久国产欧美日韩av| 99久久人妻综合| 男女午夜视频在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品久久久av美女十八| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 韩国精品一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 悠悠久久av| 嫩草影视91久久| 日本欧美视频一区| 久久亚洲国产成人精品v| 久久毛片免费看一区二区三区| 桃花免费在线播放| 又大又黄又爽视频免费| 国产成人91sexporn| 最新在线观看一区二区三区 | www.av在线官网国产| 看免费成人av毛片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产一区二区 视频在线| 国产极品天堂在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 涩涩av久久男人的天堂| 一级毛片我不卡| 国产精品一区二区在线不卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 青草久久国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 少妇人妻 视频| 在线观看免费午夜福利视频| 操出白浆在线播放| 日韩伦理黄色片| 亚洲欧洲国产日韩| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产成人欧美在线观看 | 青春草视频在线免费观看| 国产淫语在线视频| 国产在线免费精品| 成年人免费黄色播放视频| 捣出白浆h1v1| 亚洲七黄色美女视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 狂野欧美激情性xxxx| xxxhd国产人妻xxx| av电影中文网址| 午夜福利影视在线免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 老司机在亚洲福利影院| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产成人系列免费观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产成人系列免费观看| avwww免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 97在线人人人人妻| 亚洲精品一区蜜桃| 另类精品久久| 韩国精品一区二区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| av视频免费观看在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲一区二区三区欧美精品| 两性夫妻黄色片| 亚洲精品,欧美精品| 只有这里有精品99| 18在线观看网站| 一级片免费观看大全| 男女免费视频国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 岛国毛片在线播放| 亚洲在久久综合| 久久亚洲国产成人精品v| h视频一区二区三区| 波多野结衣av一区二区av| 老熟女久久久| 老熟女久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 悠悠久久av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 成人黄色视频免费在线看| 亚洲美女视频黄频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 少妇人妻久久综合中文| 777米奇影视久久| 搡老乐熟女国产| 国产成人a∨麻豆精品| 五月天丁香电影| 热re99久久精品国产66热6| 老司机靠b影院| 啦啦啦啦在线视频资源| 青春草国产在线视频| 婷婷色av中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 一个人免费看片子| 高清在线视频一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 成年动漫av网址| 午夜福利,免费看| 亚洲成色77777| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久久久国产电影| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品国产区一区二| 日本91视频免费播放| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲国产精品999| 国产深夜福利视频在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 午夜福利视频精品| 丝袜美足系列| 国产视频首页在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲国产av新网站| 各种免费的搞黄视频| 午夜久久久在线观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲国产欧美网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 人妻一区二区av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 岛国毛片在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 69精品国产乱码久久久| 色吧在线观看| 国产亚洲最大av| 两个人看的免费小视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产成人a∨麻豆精品| 一本久久精品| 五月天丁香电影| a 毛片基地| 亚洲欧美激情在线| 18禁动态无遮挡网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 精品亚洲成国产av| 日韩电影二区| 国产不卡av网站在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费观看人在逋| 午夜日本视频在线| 国产一区二区三区av在线| 日日撸夜夜添| 2018国产大陆天天弄谢| 天堂8中文在线网| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 女性被躁到高潮视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一个人免费看片子| 蜜桃在线观看..| 国产精品.久久久| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品视频女| 看非洲黑人一级黄片| av网站在线播放免费| 亚洲情色 制服丝袜| 我的亚洲天堂| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美人与性动交α欧美软件| 妹子高潮喷水视频| 精品人妻在线不人妻| 国产熟女欧美一区二区| 午夜av观看不卡| 国产精品三级大全| 亚洲综合精品二区| 中文字幕亚洲精品专区| 欧美av亚洲av综合av国产av | 麻豆av在线久日| 成人手机av| 亚洲av福利一区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲成人一二三区av| 国产野战对白在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品.久久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成人三级做爰电影| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 丰满乱子伦码专区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲三区欧美一区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美最新免费一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 免费观看av网站的网址| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美激情高清一区二区三区 | 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲图色成人| 国产精品.久久久| 哪个播放器可以免费观看大片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 91国产中文字幕| 欧美另类一区| 黄色视频在线播放观看不卡| 无遮挡黄片免费观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久精品亚洲av国产电影网| 爱豆传媒免费全集在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 美女国产高潮福利片在线看| 悠悠久久av| 久久狼人影院| 五月开心婷婷网| 欧美精品一区二区免费开放| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久久久精品精品| 下体分泌物呈黄色| 亚洲国产精品国产精品| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 99香蕉大伊视频| av一本久久久久| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲精品在线美女| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久av网站| 人成视频在线观看免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 人妻 亚洲 视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产人伦9x9x在线观看| 好男人视频免费观看在线| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 最近2019中文字幕mv第一页| 久久精品国产a三级三级三级| 18禁国产床啪视频网站| 在线天堂最新版资源| av福利片在线| 久久影院123| 97人妻天天添夜夜摸| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 伦理电影大哥的女人| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 九草在线视频观看| 99精品久久久久人妻精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 在线观看免费视频网站a站| 国产熟女欧美一区二区| 日本wwww免费看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 免费少妇av软件| 日韩av在线免费看完整版不卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产成人系列免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲成人一二三区av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产一区二区在线观看av| 一本大道久久a久久精品| 久久久精品免费免费高清| 十八禁人妻一区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 黄色 视频免费看| 女性生殖器流出的白浆| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 国产又爽黄色视频| 捣出白浆h1v1| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲免费av在线视频| 国产av国产精品国产| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品国产av蜜桃| avwww免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲图色成人| 在线看a的网站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久热爱精品视频在线9| 国产探花极品一区二区| 久久这里只有精品19| 咕卡用的链子| 久久婷婷青草| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中文字幕av电影在线播放| 日韩一区二区三区影片| 国产精品国产av在线观看| 久久99一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线精品无人区一区二区三| 国产免费福利视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久国产av精品国产电影| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品av久久久久免费| 日韩精品有码人妻一区| 我的亚洲天堂| 亚洲av综合色区一区| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久人妻精品一区果冻| 99热全是精品| www.自偷自拍.com| 99国产精品免费福利视频| 美女主播在线视频| 一本大道久久a久久精品| 精品一区二区三卡| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲欧洲日产国产| 一区二区三区激情视频| 不卡视频在线观看欧美| 一区二区av电影网| 毛片一级片免费看久久久久| 精品视频人人做人人爽| 日本av免费视频播放| 热99国产精品久久久久久7| 秋霞伦理黄片| 69精品国产乱码久久久| 国产在视频线精品| 国产色婷婷99| av网站免费在线观看视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 九九爱精品视频在线观看| 满18在线观看网站| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天天影视国产精品| 香蕉国产在线看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产一区二区激情短视频 | 久久久久久人妻| 最近中文字幕2019免费版| 搡老乐熟女国产| 精品亚洲成国产av| 波多野结衣一区麻豆| 婷婷色综合www| 91成人精品电影| 青草久久国产| 丰满少妇做爰视频| avwww免费| 69精品国产乱码久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美最新免费一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 曰老女人黄片| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品久久久久成人av| h视频一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日本av手机在线免费观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 免费观看人在逋| 一级毛片电影观看| 黄色 视频免费看| 黑丝袜美女国产一区| 一本色道久久久久久精品综合| 97人妻天天添夜夜摸| 宅男免费午夜| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产最新在线播放| 久久婷婷青草| 欧美精品一区二区免费开放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产色婷婷99| 只有这里有精品99| av在线播放精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 伊人亚洲综合成人网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 久久97久久精品| 天天影视国产精品| 只有这里有精品99| 色播在线永久视频| 久久婷婷青草| 99精品久久久久人妻精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 精品国产一区二区久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 免费在线观看完整版高清| 日本一区二区免费在线视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 麻豆乱淫一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 天堂中文最新版在线下载| av在线播放精品| 国产xxxxx性猛交| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产在视频线精品| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久久久久久久久久久大奶| 男人添女人高潮全过程视频| 黄频高清免费视频| 国产一区二区 视频在线| av在线app专区| 一区二区三区精品91| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品国产av在线观看| 久久这里只有精品19| 97人妻天天添夜夜摸| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费av中文字幕在线| 亚洲图色成人| a级毛片在线看网站| 亚洲国产欧美网| 国产又色又爽无遮挡免| 精品一区二区免费观看| 国产精品免费视频内射| 国产精品一区二区在线观看99| 久久热在线av| avwww免费| 中文字幕人妻熟女乱码| a级毛片黄视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 人人澡人人妻人| 亚洲第一av免费看| 婷婷色综合大香蕉| 成年人午夜在线观看视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 夫妻午夜视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av免费观看日本| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产免费现黄频在线看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品二区激情视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜精品国产一区二区电影| 久久免费观看电影| 美国免费a级毛片| 亚洲在久久综合| 国产成人啪精品午夜网站| 男女午夜视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 五月天丁香电影| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 伦理电影免费视频| 天天影视国产精品| 午夜老司机福利片| 亚洲五月色婷婷综合| 满18在线观看网站| 大片免费播放器 马上看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一级片'在线观看视频| 韩国精品一区二区三区| 成人手机av| 最近的中文字幕免费完整| 欧美日韩综合久久久久久| 国精品久久久久久国模美| 两个人免费观看高清视频| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品久久久久成人av| 国产免费现黄频在线看| 综合色丁香网| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩免费高清中文字幕av| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品一国产av| 97人妻天天添夜夜摸| 99国产综合亚洲精品| 久久久久视频综合| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 午夜福利,免费看| 男女国产视频网站| 美女午夜性视频免费| 日日撸夜夜添| 欧美成人精品欧美一级黄| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av女优亚洲男人天堂| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品卡一卡二卡四卡免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄片播放在线免费| 1024香蕉在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品视频人人做人人爽| 日韩中文字幕视频在线看片| av在线app专区| 亚洲国产av新网站| 18禁观看日本| 日韩伦理黄色片| 欧美日韩亚洲高清精品| 香蕉国产在线看| 国产亚洲一区二区精品| 国产黄色免费在线视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲综合精品二区| 国产有黄有色有爽视频| 美国免费a级毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美激情极品国产一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲精品久久午夜乱码| 不卡视频在线观看欧美| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情 高清一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 人妻 亚洲 视频| 精品一区在线观看国产| 免费看不卡的av| 久久影院123| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 国产高清国产精品国产三级| 考比视频在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 永久免费av网站大全| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人精品无人区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 丰满少妇做爰视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲人成77777在线视频| 99九九在线精品视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜91福利影院| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品av久久久久免费| 婷婷色综合www| 亚洲一码二码三码区别大吗| www日本在线高清视频|