芍藥苷對增殖性瘢痕成纖維細胞增殖抑制作用及機制研究

王 雷，馬園園，李亞玲，周粵閩

(河南大學附屬淮河醫(yī)院整形外科，河南 開封 475001)

芍藥苷對增殖性瘢痕成纖維細胞增殖抑制作用及機制研究

王 雷，馬園園，李亞玲，周粵閩

(河南大學附屬淮河醫(yī)院整形外科，河南 開封 475001)

目的探索芍藥苷對增殖性瘢痕(HS)成纖維細胞增殖抑制作用及機制研究。方法0(對照組)，200，400，800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞24、48、72 h后，MTT法檢測細胞活力，Hoechst染色法檢測細胞凋亡，流式細胞術(shù)檢測細胞周期，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞Ⅰ型膠原(COL Ⅰ)和Ⅲ型膠原(COL Ⅲ)含量，Western blot檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路相關(guān)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、MMP13表達。結(jié)果200，400，800 μmol/L芍藥苷能顯著降低HS成纖維細胞活力(P< 0.01)，使細胞核發(fā)白，皺染，使細胞周期阻滯在G1期(P< 0.01)，能顯著降低細胞中COLⅠ、COLⅢ含量(P< 0.01)，下調(diào)MMP1、MMP13、TGF-β1、p-Smad2及p-Smad3表達(P< 0.01)。結(jié)論芍藥苷能明顯抑制HS成纖維細胞增殖及膠原合成，可能是通過抑制TGF-β1/Smad信號通路實現(xiàn)的。

芍藥苷；增生性瘢痕；成纖維細胞；增殖；膠原合成

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是皮膚嚴重創(chuàng)傷、燒傷或者感染后，創(chuàng)面異常修復的必然結(jié)果，臨床主要表現(xiàn)為創(chuàng)面皮膚增厚，高于正常皮膚，瘢痕攣縮并有瘙癢感，甚至影響患者外觀，引起關(guān)節(jié)功能障礙，給患者造成巨大心理負擔[1]。目前研究認為HS的發(fā)生機制是皮膚受損后，成纖維細胞被激活后大量增殖，進而促進細胞外基質(zhì)膠原的大量合成及過度沉積[2, 3]。TGF-β1是一種具有多種功能的細胞因子，在創(chuàng)傷愈合過程中起著重要作用，不僅能夠調(diào)控促進成纖維細胞增殖，凋亡及遷移，還能夠促進成纖維細胞大量合成膠原，抑制細胞外基質(zhì)蛋白酶(MMPs)的分泌及膠原的降解[4]。芍藥苷是傳統(tǒng)中藥芍藥的干燥根提取物，研究表明芍藥苷能夠通過抑制TGF-β1的表達及分泌，進而抑制膠原及細胞外基質(zhì)的合成，從而抑制大鼠、小鼠肝、腎及肺纖維化[5-7]。進而提示芍藥苷可能通過TGF-β1信號通路抑制HS的發(fā)生發(fā)展，成為HS的有效治療藥物，但相關(guān)報道較少，因此本研究將對此展開探討。

1 材料和方法

1.1增生性瘢痕成纖維細胞的制備

本研究所需要的增生性瘢痕組織塊由某整形科提供。所有研究對象均征得患者或者其家屬同意并簽署知情同意書，并由我院的倫理委員會通過。在無菌條件下用眼科剪剪去附著于組織塊上的脂肪組織及表皮，接著用含有100 μg/mL的青霉素及鏈霉素的PBS洗滌組織塊3次，接著用眼科剪繼續(xù)將組織塊剪成1 mm3左右的組織塊，后將組織塊平鋪于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第3天用PBS將浮在培養(yǎng)基中的組織塊洗去，并加入少量新鮮培養(yǎng)基，同時觀察組織塊中細胞游離出來的的情況，當培養(yǎng)瓶中細胞密度達到80%的時候，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，以1∶2的比例進行傳代，取第3～5代細胞用于后續(xù)實驗研究[8, 9]。

1.2主要試劑與儀器

芍藥苷購自中國食品藥品檢定研究院；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，Ⅱ型膠原酶均購自美國Gibco公司；胰蛋白酶，細胞周期檢測試劑盒，Hoechst染色試劑盒均南京凱基生物技術(shù)有限公司；COLⅠ、COL Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗人TGF-β1、Sma2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、MMP1、MMP13、GAPDH多克隆抗體均購自美國Abcam公司。

MK3酶標儀購自美國Thermo公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；TS100倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3實驗方法

1.3.1 MTT法檢測HS成纖維細胞活力

將6 × 103個HS成纖維細胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞24、48、72 h后，每孔加入終濃度為5 mg/mL的MTT并孵育4 h后，棄上清液，再另外每孔加入150 μL的二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物溶解，于酶標儀波長560 nm處測A560值。

1.3.2 Hoechst染色檢測HS成纖維細胞形態(tài)

將9 × 103個HS成纖維細胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，加入終濃度為10 μg/mL的Hoechst染色液，染色5 min，PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡的細胞熒光更強，細胞核發(fā)白，呈現(xiàn)皺染。

1.3.3 流式細胞術(shù)檢測HS成纖維細胞周期

將9 × 103個HS成纖維細胞接種到6孔板，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，每組收集1 × 105個/mL細胞，再加入5 μL終濃度為10 mg/mL的RNase，吹打混勻后，37℃孵育1 h，繼續(xù)加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，1 h內(nèi)在流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。

1.3.4 ELISA法檢測HS成纖維細胞中COLⅠ、COLⅢ含量

將8 × 103個HS成纖維細胞接種到6孔板，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，利用0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，接著分別按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞中COLⅠ、COL Ⅲ含量。

1.3.5 Western blot檢測HS成纖維細胞中TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白及MMP1、MMP13蛋白的表達

將9 × 103個HS成纖維細胞接種到6孔板，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，在4℃條件下刮下6孔板中細胞，離心并收集細胞，加入細胞裂解液，裂解30 min，離心收集上清液即是總蛋白。接著采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。制作濃縮膠及分離膠，并水封靜置30 min。蛋白樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人TGF-β1、Sma2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、MMP1、MMP13、GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗溶液室溫孵育1～2 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.4統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1芍藥苷對HS成纖維細胞活力的影響

如表1所示，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞24、48、72 h后，經(jīng)MTT實驗發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度的增加，細胞活力逐漸降低(P< 0.01)。

2.2芍藥苷對HS成纖維細胞凋亡的影響

如圖1所示，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，與對照組細胞凋亡率(3.25±0.32)%比較，200、400、800 μmol/L芍藥苷組細胞凋亡率分別為(13.47±1.35)%、(26.69±2.67)%、(39.36±4.00)%，說明芍藥苷能使細胞核皺縮，濃染，細胞凋亡顯著。

2.3芍藥苷對HS成纖維細胞周期的影響

如表2所示，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，經(jīng)流式細胞實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，200、400、800 μmol/L芍藥苷能使HS成纖維細胞周期阻滯在G期(P< 0.01)。

2.4芍藥苷對HS成纖維細胞中COLⅠ、COLⅢ含量的影響

如表3所示，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，經(jīng)ELISA實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，200、400、800 μmol/L芍藥苷能降低HS成纖維細胞中COLⅠ、COL Ⅲ含量(P< 0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系。

Tab.1Effect of paeoniflorin at different doses on cell viability of the HS fibroblasts

組別Groups24h48h72h對照組Controlgroup0.543±0.0500.645±0.0610.732±0.071200μmol/L芍藥苷組200μmol/Lpaeonifloringroup0.473±0.043**0.532±0.053**0.562±0.058**400μmol/L芍藥苷組400μmol/Lpaeonifloringroup0.408±0.041**0.451±0.052**0.464±0.042**800μmol/L芍藥苷組800μmol/Lpaeonifloringroup0.334±0.030**0.364±0.036**0.368±0.016**

注：與對照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

Tab.2Effect of paeoniflorin on cell cycle of the HS fibroblasts

組別GroupsG1期/%G1phaseS期/%SphaseG2期/%G2phase對照組Controlgroup41.53±4.1523.48±2.2435.99±3.60200μmol/L芍藥苷組200μmol/Lpaeonifloringroup48.18±4.82**19.42±2.20**33.40±3.34**400μmol/L芍藥苷組400μmol/Lpaeonifloringroup55.69±5.57**18.38±1.83**25.93±2.59**800μmol/L芍藥苷組800μmol/Lpaeonifloringroup67.86±6.79**14.65±1.45**17.49±1.75**

注：與對照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

Tab.3Effect of paeoniflorin on the levels of COL I and COL III in HS fibroblasts

組別GroupsCOLI含量/ng/mLCOLIlevelCOLIII含量/ng/mLCOLIIIlevel對照組Controlgroup213.47±2.2325.70±0.58200μmol/L芍藥苷組200μmol/Lpaeonifloringroup182.45±1.65**19.89±1.08**400μmol/L芍藥苷組400μmol/Lpaeonifloringroup143.22±1.43**14.51±0.53**800μmol/L芍藥苷組800μmol/Lpaeonifloringroup128.71±1.29**8.74±0.82**

注：與對照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：對照組；B：200 μmol/L芍藥苷組；C：400 μmol/L芍藥苷組；D：800 μmol/L芍藥苷組。圖1 芍藥苷對HS成纖維細胞凋亡的影響(× 200)Note. A: Control group； B: 200 μmol/L paeoniflorin group； C: 400 μmol/L paeoniflorin group； D: 800 μmol/L paeoniflorin group.Fig.1 Effect of paeoniflorin on cell apoptosis of the HS fibroblasts

2.5芍藥苷對HS成纖維細胞中MMPs含量的影響

如圖2所示，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，經(jīng)Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，200、400、800 μmol/L芍藥苷能降低HS成纖維細胞中MMP1及MMP13表達量(P< 0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系。

注：A：對照組；B：200 μmol/L芍藥苷組；C：400 μmol/L芍藥苷組；D：800 μmol/L芍藥苷組。與對照組比較，** P< 0.01。圖2 芍藥苷對HS成纖維細胞中MMPs表達量的影響Note. A: Control group; B: 200 μmol/L paeoniflorin group; C: 400 μmol/L paeoniflorin group; D: 800 μmol/L paeoniflorin group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.2 Effect of paeoniflorin on the expression levels of MMPs in HS fibroblasts

2.6芍藥苷對HS成纖維細胞中TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

如圖2所示，0(對照組)、200、400、800 μmol/L的芍藥苷作用HS成纖維細胞48 h后，經(jīng)Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，200、400、800 μmol/L芍藥苷能降低HS成纖維細胞中TGF-β1、p-Smad2及p-Smad3表達(P< 0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系。

注：A：對照組；B：200 μmol/L芍藥苷組；C：400 μmol/L芍藥苷組；D：800 μmol/L芍藥苷組。與對照組比較，** P< 0.01。圖3 芍藥苷對HS成纖維細胞中TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Note. A: Control group; B: 200 μmol/L paeoniflorin group; C: 400 μmol/L paeoniflorin group; D: 800 μmol/L paeoniflorin group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.3 Effect of paeoniflorin on the expression levels of TGF-β/Smad signaling pathway related proteins in HS fibroblasts

3 討論

TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，是創(chuàng)傷愈合過程中重要的細胞因子，其中TGF-β1研究最為廣泛。Smad蛋白是TGF-β受體作用的唯一信使分子，包括受體型(Smad2、Smad3、Smad5等)、輔助型(Smad4)及抑制型(Smad6和Smad7)。TGF-β將外界信號傳遞給Smad2/3，使Smad2/Smad3磷酸化，接著與Smad4結(jié)合進入細胞核中調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。而Smad6/7可以競爭性結(jié)合TGF-β受體抑制Smad2/Smad3的磷酸化。研究表明燒傷患者在康復以后常常出現(xiàn)瘢痕組織的增生，而且患者此時瘢痕組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的表達量顯著高于正常人[10]。而且臨床試驗證實抗TGF-β抗體對糖尿病腎纖維化作用顯著，且副作用小[11]。另外Wang等[12]研究證實TGF-β多肽拮抗劑能顯著的減輕HS成纖維細胞表型。這些研究研究說明通過拮抗TGF-β信號通路對HS的治療具有顯著的理論指導意義。

芍藥屬于毛莨科植物，具有止攣，活血化瘀等功效，被廣泛應用于類風濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、自身能免疫性疾病、心腦血管疾病等疾病的治療中[13]。芍藥苷是芍藥主要的單體活性成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁等作用[14]。近些年研究還發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有抗纖維化作用，如胡宗濤等[5]研究表明芍藥苷能下調(diào)TGF-β1、p-Smad3、p-Smad4及p-Smad7表達抑制大鼠放射性肝纖維化。Zeng等[6]研究證實芍藥苷能夠減輕腎間質(zhì)纖維化模型小鼠的肺組織及腎間質(zhì)纖維化作用，與通過下調(diào)p-Smad2及p-Smad3表達有關(guān)。Ji等[7]研究證實芍藥苷能通過Smad通路抑制TGF-β誘導的A549細胞的纖維化。從而提示芍藥苷可能能夠通過調(diào)控TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達抑制HS成纖維細胞的增殖與膠原沉積。

因此本研究首先參考相關(guān)文獻并根據(jù)預實驗[14]，采用0、200、400、800 μmol/L芍藥苷作用HS成纖維細胞24、48、72 h，MTT結(jié)果表明200、400、800 μmol/L芍藥苷能顯著降低細胞活力，并呈時間及劑量依賴關(guān)系。接著Hoechst染色法進一步證實200、400、800 μmol/L芍藥苷能使HS細胞核發(fā)白，皺染，說明細胞凋亡顯著。然后利用流式細胞術(shù)檢測芍藥苷對HS細胞周期的影響，結(jié)果表明200、400、800 μmol/L芍藥苷能使細胞周期阻滯于G1期，從而說明芍藥苷能使細胞復制阻斷于DNA復制前期，繼而誘導細胞凋亡，最終抑制細胞凋亡。

細胞外基質(zhì)的膠原不斷合成及沉積是HS形成的重要原因之一，是源自于細胞外細胞降解酶的分泌不足所致的[2, 3]。細胞外基質(zhì)主要成分是Ⅰ型膠原(ColⅠ)和Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)，這些膠原在HS形成過程不斷合成并沉積加劇病情[11]。而MMPs是降解細胞外基質(zhì)最為重要的蛋白水解酶，MMP1及MMP13是能夠降解包括ColⅠ及Col Ⅲ在內(nèi)幾乎所有纖維類膠原的間質(zhì)膠原酶。且通過抑制TGF-β/Smad信號通路能顯著的下調(diào)MMP1及MMP13蛋白表達，進而抑制ColⅠ及Col Ⅲ合成，最終減輕小鼠心肌纖維化[9, 15]。所以本研究繼續(xù)利用Western blot及ELISA實驗檢測芍藥苷對HS成纖維細胞中MMP1，MMP13表達及ColⅠ、Col Ⅲ含量。結(jié)果表明芍藥苷能顯著的下調(diào)MMP1及MMP13蛋白表達，減少ColⅠ及Col Ⅲ的合成，最終抑制膠原的沉積。最后本研究探討芍藥苷對TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白表達的影響，結(jié)果表明芍藥苷能顯著的下調(diào)TGF-β1、p-Smad2及p-Smad3表達。

綜上所述，200、400、800 μmol/L的芍藥苷能顯著的降低HS成纖維細胞活力，誘導細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G1期，同時下調(diào)MMP1及MMP13蛋表達，減少ColⅠ及Col Ⅲ的合成，此過程與芍藥苷抑制TGF-β/Smad信號通路有關(guān)。

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Inhibitoryeffectandmechanismofpaeoniflorinonproliferationofhypertrophicscarfibroblasts

WANG Lei， Ma Yuan-yuan， Li Ya-ling， Zhou Yue-min

(Department of Orthopedic Surgery, Huaihe Hospital Affiliated to Henan University, Kaifeng 475001, China)

ObjectiveTo explore the inhibitory effect and related mechanism of paeoniflorin on proliferation of hypertrophic scar (HS) fibroblasts.MethodsHS fibroblasts were cultured with 0 (control), 200, 400, 800 μmol/L of paeoniflorin for 24, 48, and 72 h. Cell viability was detected by MTT assay. Cell apoptosis was detected using Hoechst staining. Cell cycle was measured by flow cytometry. The levels of type I collagen (COL I) and type III collagen (COL III) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of transforming growth factor-β (TGF-β)/Smad signaling pathway related proteins, as well as matrix metalloproteinase 1 (MMP1) and MMP13 were detected by Western blot.Results200, 400, 800 μmol/L of paeoniflorin reduced the cell viability of HS fibroblasts significantly (P< 0.01), with the nuclei turning pale and shrunken, and caused cell cycle arrest at G1 phase (P< 0.01). Moreover, the levels of COL I and COL III in the cells were decreased significantly (P< 0.01), and the expressions of MMP1, MMP13, TGF-β1, p-Smad2 and p-Smad3 were down-regulated significantly (P< 0.01).ConclusionsPaeoniflorin can obviously inhibit the proliferation and collagen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts, probably through inhibition of the TGF-β1/Smad signaling pathway.

Paeoniflorin; Hypertrophic scar, HS; Fibroblasts; Proliferation; Collagen synthesis

河南省省部共建課題項目：自體細胞培養(yǎng)復合型人工真皮的構(gòu)建及臨床應用研究(編號：201401014)。

王雷(1982 -)，男，本科，研究方向：瘢痕的預防及治療。E-mail: 54206653@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0038-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.008

2017-05-26