卡介苗對膀胱腫瘤細胞及代謝產(chǎn)物的作用影響

吳金生，鄭傳秋，王清明，紀 萌，孫立江*

(1.青島大學(xué)，山東 青島 266071； 2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

卡介苗對膀胱腫瘤細胞及代謝產(chǎn)物的作用影響

吳金生1，鄭傳秋2，王清明2，紀 萌2，孫立江1*

(1.青島大學(xué)，山東 青島 266071； 2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

目的探究 卡介苗對膀胱腫瘤細胞及代謝產(chǎn)物的作用和影響，對卡介苗治療膀胱腫瘤細胞的可能機制進行初步的探索。方法通過膀胱灌注N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)并建立大鼠的膀胱腫瘤模型，將膀胱腫瘤細胞和正常移行上皮細胞進行原代培養(yǎng)。按照培養(yǎng)液的不同成分將其分為5組，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各組細胞上清液中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-10(IL-10)的濃度。利用噻唑藍(MTT)法測定卡介苗抑制腫瘤細胞生長的藥物濃度。利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡情況。結(jié)果在灌注的15只大鼠中，2只大鼠在灌注2次后死亡，3只大鼠灌注3次后死亡，解剖死亡大鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤。再對其余10只大鼠完成膀胱灌注后，其中8只大鼠解剖后發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤。MTT結(jié)果顯示：卡介苗對膀胱腫瘤細胞的生長具有抑制作用，其抑制率與卡介苗的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。ELISA檢測各組細胞上清液中TNF-α濃度在B組為(160.654±5.775) ng/L，D組為(124.443±4.972) ng/L的濃度，與其他三組相比差異有顯著性；IL-10濃度在B組為(16.973±3.428) ng/L，E組為(20.327±2.721) ng/L，蛋白水平明顯高于其他三組。各組細胞均未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡。對原代膀胱腫瘤細胞的鑒定顯示：利用HE染色可發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的細胞核體積增大，核漿比增高，有的可發(fā)現(xiàn)細胞核仁數(shù)目增加，有的細胞核呈現(xiàn)墨水滴樣，核仁比較明顯。結(jié)論卡介苗對大鼠膀胱腫瘤細胞的增長具有抑制作用，沒有發(fā)生細胞凋亡，且腫瘤細胞自身分泌的IL-10、TNF-α可以參與調(diào)節(jié)。

卡介苗；膀胱腫瘤細胞；IL-10；TNF-α

膀胱癌發(fā)病率在全部腫瘤發(fā)病率中占到第八位，是位居第二的男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，僅次于前列腺癌，占全部惡性腫瘤的3.2%。在我國，膀胱癌在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率和死亡率均居首位，嚴重威脅我國人民的生命身體健康[1],且膀胱腫瘤具有高復(fù)發(fā)性。大量研究證實膀胱惡性腫瘤術(shù)后給予藥物膀胱灌注治療可以有效降低膀胱惡性腫瘤的復(fù)發(fā)率；而卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)在目前所有的膀胱癌灌注藥物中被認為是術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)的最佳藥物之一?？ń槊缈梢允鼓[瘤復(fù)發(fā)率降低20% ～ 65%，平均可達40%左右。國際上的一些專家將卡介苗膀胱灌注治療稱為原位癌灌注治療中的“金標準”，但是卡介苗對腫瘤細胞的作用機制尚不明確[2]。本實驗?zāi)康木褪且骄靠ń槊鐚Π螂啄[瘤細胞及其代謝產(chǎn)物的作用影響。通過N-甲基亞硝基脲(MNU)誘導(dǎo)并建立了大鼠膀胱腫瘤模型，將膀胱腫瘤細胞和正常移行上皮細胞進行原代培養(yǎng)，按照培養(yǎng)液的不同成分將其分為5組，然后運用各種檢測方法測定各種指標的濃度，以此來了解卡介苗對腫瘤細胞及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的作用和影響，從而進一步探索卡介苗對治療腫瘤細胞的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級SD雄性8周齡大鼠15只，體重190 ～ 210 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供 [SCXK (魯) 2014-0007]，按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

卡介苗(BCG)(賽諾菲巴斯德，法國)；N-甲基亞硝基脲(MNU)(Sigma，美國)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，美國)；噻唑藍(MTT)(Sigma，美國)；Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶(Sigma，美國)；1640培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone，美國)；PBS(北京索萊寶科技有限公司，中國)；大鼠TNF-α ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司，中國)；大鼠IL-10 ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司，中國)。

大鼠膀胱癌細胞株BIU-87(購自上海細胞庫)、0.25%胰蛋白酶、MTT溶液(5 mL/mL)，封閉液、固定液、通透液和工作液等，需新鮮配制。

倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus，日本)；超凈工作臺(大連瑞欣公司，中國)；細胞培養(yǎng)箱(Blnder，德國)；酶標儀(Bio-Rad，美國)；低溫離心機(Eppendorf，德國)；電子天平(Sartorius，德國)。

1.3實驗方法

將大鼠固定在手術(shù)臺，在常規(guī)麻醉、消毒和導(dǎo)尿后，對大鼠進行膀胱灌注濃度為20 mg/mL的MNU溶液，每只大鼠每次灌注2 mg MNU溶液，每兩周進行一次，一共四次[3]。對腫瘤細胞進行分離獲取和原代培養(yǎng)，并按照其培養(yǎng)液的成分分為5組。使用含10%胎牛血清的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤細胞為A組，使用含有卡介苗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的腫瘤細胞為B組，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)正常移行上皮細胞后的上清液培養(yǎng)的腫瘤細胞為C組，使用含卡介苗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)正常移行上皮細胞后的上清液培養(yǎng)的腫瘤細胞為D組，使用含卡介苗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)腫瘤細胞后的上清液培養(yǎng)的腫瘤細胞為E組(陰性對照組為A組和C組)。利用MTT法測定不同濃度卡介苗影響大鼠膀胱腫瘤細胞的生長情況，利用ELISA法[4]檢測細胞培養(yǎng)液中的TNF-α和IL-10的濃度，最后利用TUNEL法進行細胞凋亡檢測[5]。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

Tab.1Concentrations of IL-10 and TNF-α in the supernatant of each group

組別GroupsIL-10濃度ConcentrationofIL-10TNF-α濃度ConcentrationofTNF-αA組GroupA10.486±1.623*△△29.653±2.676B組GroupB16.973±3.428160.654±5.775△△▲▲※※C組GroupC10.479±1.807*△△25.687±2.143D組GroupD10.975±2.749*△△124.443±4.972△△▲▲※※E組GroupE20.327±2.72150.119±3.317▲▲※※

注：與B組相比，*P< 0.05；與E組相比，△△P< 0.01；與A組相比，▲▲P< 0.01；與C組相比，※※P< 0.01。

Note. Compared with group B,*P< 0.05; Compared with group E,△△P< 0.01; Compared with group A,▲▲P< 0.01; Compared with group C,※※P< 0.01.

2 結(jié)果

2.1建立大鼠膀胱腫瘤細胞模型，原代細胞培養(yǎng)

在灌注的15只大鼠中，2只大鼠在灌注2次后死亡，3只大鼠灌注3次后死亡，解剖死亡大鼠均未發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤。對其余10只大鼠完成膀胱灌注后，其中有8只大鼠在解剖后發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤，肉眼可見膀胱壁黏膜充血，局部有米粒樣或乳頭樣腫物；顯微鏡下可見膀胱上皮細胞層次增多，排列紊亂。

2.2MTT檢測卡介苗對膀胱腫瘤細胞生長的抑制作用

由各孔的吸光度來計算腫瘤細胞的生長抑制率(見圖1)。MTT檢測的結(jié)果顯示，卡介苗可以有效地抑制膀胱腫瘤細胞的生長，且其抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。在低濃度時(0.0625 mg/L)時抑制能力較弱，當藥物濃度≥ 0.5 mg/L時呈現(xiàn)明顯的抑制作用(P< 0.01)。

圖1 卡介苗不同濃度對膀胱腫瘤細胞生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of BCG at different concentrations on the growth of bladder cancer cells

2.3利用ELISA法檢測IL-10和TNF-α的濃度

在IL-10濃度的比較中，B組與A、C、D組相比差異有顯著性(P< 0.05)，E組與A、C、D組相比差異有顯著性(P< 0.01)。見表1。

在TNF-α濃度的比較中，含有卡介苗的組(B、D、E組)和不含卡介苗的組(A、C組)間的比較，其差異有顯著性(P< 0.01)；不含卡介苗的A組和C組相比，差異無顯著性(P> 0.05)。此外，TNF-α濃度在B組為(160.654 ± 5.775) ng/L，D組為(124.443 ± 4.972) ng/L的濃度，與A、C、E組相比差異有顯著性(P< 0.01)。見表1。

2.4顯微鏡下觀察細胞情況

顯微鏡下觀察細胞培養(yǎng)情況顯示，原代培養(yǎng)的大鼠正常移行上皮細胞貼壁，呈上皮細胞樣多形性生長；原代培養(yǎng)的大鼠腫瘤細胞體積大，呈鋪路石樣，細胞核仁明顯；卡介苗作用后的腫瘤細胞體積縮小，胞漿有空泡；TUNEL法檢測細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)細胞體積縮小，細胞出現(xiàn)核碎裂、溶解，呈凋亡現(xiàn)象。見圖2。實驗結(jié)果顯示，卡介苗作用后膀胱腫瘤細胞增殖速度減慢。

注：A：大鼠原代培養(yǎng)正常移行上皮細胞(× 100)；B：大鼠原代培養(yǎng)腫瘤細胞(× 200); C：卡介苗作用后的腫瘤細胞(× 200)；D：TUNEL法檢測細胞凋亡(× 400)。圖2 細胞培養(yǎng)圖Note. A: Primarily cultured normal transitional epithelial cells of rats (× 100); B: Primarily cultured tumor cells of rats (× 200); C: Tumor cells after BCG treatment (× 200); D: TUNEL detection of apoptosis (× 400).Fig.2 Images of cultured cells

3 討論

目前，膀胱腫瘤手術(shù)后輔助以膀胱灌注的治療方法成為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的主要措施?？ń槊缭谀壳八械陌螂装┕嘧⒒熕幬镏斜徽J為是術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)的最佳藥物之一，它在淺表性膀胱腫瘤免疫治療中的應(yīng)用取得了重大的成功[6-10]。但是，膀胱腫瘤的發(fā)病機制和膀胱灌注治療的作用機制尚不明確實驗證明，利用MNU膀胱灌注誘發(fā)膀胱腫瘤建立動物模型，方法較為簡單。在前期研究中具有可操作性和實用性，且成癌率較高[4,11]。目前普遍認為卡介苗作用于膀胱腫瘤細胞的作用機制主要在于其自身的結(jié)構(gòu)，還有它對樹突狀細胞的獨特作用?？ń槊缤ㄟ^激發(fā)機體免疫力來達到抵抗腫瘤的作用，至今醫(yī)學(xué)界一致認為是通過CD4+T細胞介導(dǎo)的細胞免疫發(fā)揮了它抵抗腫瘤細胞的作用。

MMT結(jié)果顯示，卡介苗對膀胱腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，且和它的濃度呈正相關(guān)。在對細胞培養(yǎng)后的上清液的檢測中可以發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IF-10均發(fā)生改變，這說明了卡介苗不僅激發(fā)了機體的免疫細胞因子，調(diào)節(jié)了免疫能力，而且還使自身產(chǎn)生細胞因子避免了進一步的傷害。在卡介苗初次刺激膀胱腫瘤細胞之后，IL-10的濃度明顯增大(B組)。再一次卡介苗刺激后，E組的IL-10濃度比B組增高。但是，當含有卡介苗成分的細胞培養(yǎng)后的上清液再次刺激腫瘤細胞時，其IL-10濃度卻沒有發(fā)生改變。這說明卡介苗初次作用于腫瘤細胞時，可以產(chǎn)生IL-10。如果使用其代謝產(chǎn)物再次刺激腫瘤細胞，則能夠產(chǎn)生更多的IL-10。在TNF-α的濃度變化方面，當卡介苗初次刺激腫瘤細胞時能產(chǎn)生大量的TNF-α，而再次刺激腫瘤細胞卻不能產(chǎn)生TNF-α，這可能是其代謝產(chǎn)物抑制了TNF-α的產(chǎn)生，甚至抵消第一次產(chǎn)生的TNF-α。本次實驗結(jié)果顯示，在單一因素卡介苗條件下，腫瘤細胞自身會通過分泌不同的細胞因子，避開免疫細胞的傷害。

綜上所述，卡介苗對膀胱腫瘤細胞的生長具有抑制作用，通過抑制增殖活躍的腫瘤細胞，使其發(fā)生病理性壞死，且隨卡介苗藥物濃度的增加，其抑制作用也越來越強，可能打破腫瘤生長平衡的體液環(huán)境，使腫瘤細胞縮小或延緩腫瘤生長，從而達到治療腫瘤的目的。

[1] 韓蘇軍, 張思維, 陳萬青, 等. 中國膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢分析 [J]. 癌癥進展, 2013, 11(1): 89-95.

[2] 李彩霞, 曾星, 黃羽, 等. 豬苓及豬苓多糖協(xié)同卡介苗對膀胱癌大鼠模型腹腔巨噬細胞功能的影響 [J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2011, 27(6): 514-517.

[3] 吳金生, 王清明, 鄭傳秋, 等. 姜黃素對N-甲基亞硝基脲誘發(fā)膀胱癌大鼠化學(xué)干預(yù)作用及機制分析 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2017, 25(5): 567-571.

[4] 秦桂芳. 豬苓湯干預(yù)BCG防治MNU致大鼠膀胱癌作用研究 [D]. 河北大學(xué), 2016.

[5] 田斌強, 趙應(yīng)梅, 王德貴, 等. 姜黃素對大鼠膀胱腫瘤的預(yù)防與治療作用 [J]. 腫瘤, 2011, 31(11): 1004-1009.

[6] 趙雷佐. 卡介苗對大鼠膀胱腫瘤細胞作用機制的探討 [D]. 青島大學(xué), 2013.

[7] 劉晶, 韓國梁, 楊曉峰, 等. Ag85A和Ag85B DNA疫苗對大鼠膀胱癌免疫治療的效果 [J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2008, 15(2): 144-149.

[8] 田平貴, 韓國梁, 楊曉峰, 等. 試驗劑量Ag85A與Ag85B DNA疫苗對膀胱癌大鼠血液系統(tǒng)及肝腎功能的影響 [J]. 中國藥物與臨床, 2009, 9(5): 384-387.

[9] Langle YV, Belgorosky D, Prack McCormick B, et al. FGFR3 down-regulation is involved in bacillus Calmette-Guérin induced bladder tumor growth inhibition [J]. J Urol, 2016, 195(1): 188-197.

[10] Liu X, Dowell AC, Patel P, et al. Cytokines as effectors and predictors of responses in the treatment of bladder cancer by bacillus Calmette-Guérin [J]. Future Oncol, 2014, 10(8): 1443-1456.

[11] Svatek RS, Zhao XR, Morales EE, et al. Sequential intravesical mitomycin plus bacillus Calmette-Guérin for non-muscle-invasive urothelial bladder carcinoma: translational and phase I clinical trial [J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(2): 303-311.

EffectofBCGonbladdercancercellsandtheirmetabolitesinrats

WU Jin-sheng1， ZHENG Chuan-qiu2， WANG Qing-ming2， JI Meng2， SUN Li-jiang1 *

(Qingdao University, Qingdao 266071, China； 2. Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo investigate the effect of bacillus Calmette-Guérin (BCG) on bladder cancer cells and their metabolites, and to preliminarily explore the possible mechanisms of BCG in the treatment of bladder cancer.MethodsThe rat model of bladder cancer was induced by intravesical instillation with N-methylnitrosourea (MNU). Bladder cancer cells and normal transitional epithelial cells were isolated and primarily cultured, and were divided into 5 groups according to the different components of the culture medium. The concentration of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10) in the supernatant of each group was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The concentration of BCG to inhibit the cancer cell growth was determined by MTT assay. Apoptosis of bladder cancer cells was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL).ResultsAmong the 15 rats, 2 rats died after 2 times of instillation, and 3 rats died after 3 times of instillation, without obvious tumors found at autopsy. The other 10 rats were killed after completion of the intravesically instillation of MNU, and obvious tumors were found in 8 of them after dissection. The results of MTT assay showed that BCG had an inhibitory effect on the growth of bladder cancer cells, and the inhibitory rate was positively correlated with the concentration of BCG. The results of ELISA showed that the concentrations of TNF-α in the supernatant of groups B and D were (160.654±5.775) ng/L and (124.443±4.972) ng/L, respectively, with significant differences from those of the other three groups. The concentrations of IL-10 in the groups B and E were (16.973±3.428) ng/L and (20.327±2.721) ng/L, significantly higher than those of the other three groups. Apoptosis of cancer cells was not found in all groups. HE staining of the primary bladder cancer cells showed that the volume of cell nucleus was increased, and the nucleo-cytoplasmic ratio was increased. The number of nucleoli in some cells was increased and some nuclei appeared like ink drops with prominent nucleoli.ConclusionsBCG has an inhibitory effect on the growth of rat bladder cancer cells. IL-10 and TNF-α secreted by the tumor cells might be involved in this regulatory process. However, apoptosis does not show an obvious effect on this inhibitory process.

Bacillus Calmette-Guérin, BCG; Bladder cancer cells; IL-10; TNF-α

吳金生(1975 -)，男，副教授，青島大學(xué)在職博士研究生。E-mail: wjswfmc@163.com

孫立江(1963 -)，男，教授。E-mail: slijiangqd@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0056-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.011

2017-05-10