發(fā)表文獻(xiàn)中小鼠安死術(shù)方法的分析研究(2015—2016)

岳東旭，池宏偉，鹿雙雙，王昕肪，孫德明，劉曉宇*，盧選成*

(1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，北京 102206； 2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

發(fā)表文獻(xiàn)中小鼠安死術(shù)方法的分析研究(2015—2016)

岳東旭1，池宏偉1，鹿雙雙1，王昕肪1，孫德明2，劉曉宇1*，盧選成1*

(1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，北京 102206； 2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081)

目的了解國(guó)內(nèi)小鼠處死方法使用的情況，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理部門掌握“安死術(shù)”在國(guó)內(nèi)執(zhí)行情況、制定政策提供參考和依據(jù)。方法萬方數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2015年至2016年間正文中含有檢索詞“小鼠”和“處死”的文獻(xiàn)，對(duì)符合納入條件的文章進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果890篇文獻(xiàn)符合納入標(biāo)準(zhǔn)，其中明確提出小鼠處死方法的有351篇，僅占39.44%。處死方法涉及頸椎脫臼、斷頭、麻醉后放血取材、過量麻醉劑、腹主動(dòng)脈放血和二氧化碳窒息六種，其中頸椎脫臼法使用率最高，占75.78%。結(jié)論目前小鼠“安死術(shù)”實(shí)施狀況不容樂觀，且小鼠處死方法在論文撰寫中被忽視，且其描述存在不規(guī)范現(xiàn)象。促進(jìn)“安死術(shù)”相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的切實(shí)執(zhí)行，還需加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)的研究和人員的培訓(xùn)。

小鼠；安死術(shù)；麻醉

隨著社會(huì)文明的進(jìn)步和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死問題受到越來越廣泛的關(guān)注。安樂死(euthanasia)詞源于古希臘語，eu意思是好的，thanatos意思是死亡，是指公眾認(rèn)可的、以人道主義的方法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的過程，即采用一種降低或消除痛苦和焦慮的方法來結(jié)束單個(gè)動(dòng)物的生命，好的死亡相當(dāng)于仁慈地結(jié)束動(dòng)物生命。

我國(guó)現(xiàn)有法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)將“安樂死”稱為“安死術(shù)”，2006年，科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中就提出處死動(dòng)物需使用安死術(shù)[1]?！秾?shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)質(zhì)量和能力的通用要求》(GB/T 27416-2014)對(duì)安死術(shù)提出具體要求[2]。我國(guó)孫嘉康等2007年做過調(diào)查，90.0%受調(diào)查人認(rèn)為有必要對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施安樂死，但僅有不到8%的人熟知安死術(shù)技術(shù)，一些國(guó)際上禁止的方法也被誤認(rèn)為是安死術(shù)[3]。鑒于法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)要求與實(shí)際工作，實(shí)驗(yàn)人員主觀上的意愿與客觀上的技能之間的差距，本研究期望通過對(duì)2015—2016年萬方數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的文獻(xiàn)做一研究，了解目前我國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)際開展過程中小鼠處死常用方法，掌握“安死術(shù)”執(zhí)行狀況。

1 方法

在萬方數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“小鼠”和“處死”為檢索詞，檢索2015年至2016年間正文中含有檢索詞的文獻(xiàn)。按照納入條件，篩選符合要求的文獻(xiàn)。納入條件為：論文涉及的研究開展了小鼠實(shí)驗(yàn)，并對(duì)小鼠進(jìn)行了處死操作。本研究針對(duì)小鼠處死方法、處死時(shí)是否麻醉等內(nèi)容對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行了整理，并對(duì)處死方法和麻醉情況做了進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2013軟件。

2 結(jié)果

2.1檢索結(jié)果

按照方法中描述的檢索策略，檢索到1044篇文獻(xiàn)，其中154篇未獲得全文，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)為890篇。

2.2處死方法

890篇文獻(xiàn)中有353篇提到小鼠處死方法，其中2篇文獻(xiàn)對(duì)處死方法描述不準(zhǔn)確無法辨別處死的方法，分別為“氣管窒息法處死”和“窒息法處死”。

明確寫出處死方法的文獻(xiàn)有351篇，占所有文獻(xiàn)的39.44%(351/890)，涉及頸椎脫臼、斷頭、麻醉下放血取材、過量麻醉劑、腹主動(dòng)脈放血和二氧化碳窒息共六種方法(見表1)。其中使用比例最高的是頸椎脫臼處死，占75.78%。文中描述頸椎脫臼處死方法的術(shù)語有背椎脫臼、背椎斷裂法、斷脊髓處死、斷椎法處死、引頸處死和脫頸活殺。

采用過量麻醉劑方法的占4.27%，提到所用麻醉劑的僅有8篇，占53.33%(8/15)，使用的麻醉劑有戊巴比妥鈉(3篇)、乙醚(2篇)、苯巴比妥鈉(1篇)、三溴乙醇(1篇)和水合氯醛(1篇)。

2.3處死時(shí)麻醉方法的使用

斷頭處死使用麻醉的有6篇，占斷頭處死的15%(6/40)，用的麻醉劑有乙醚、水合氯醛和戊巴比妥鈉。腹主動(dòng)脈放血處死使用麻醉的有1篇，占33.33%(1/3)，使用的麻醉劑為氯胺酮和賽拉嗪混合劑。頸椎脫臼法使用麻醉的有14篇，占5.26%(14/266)，使用的麻醉劑有乙醚、鹽酸氯胺酮、戊巴比妥鈉和水合氯醛。

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的重要組成部分，實(shí)施安樂死是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的重要內(nèi)容之一。如前所述，我國(guó)也已對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死提出明確要求。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死在實(shí)施層面還存在欠缺，現(xiàn)就調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行討論并提出相應(yīng)建議。

表1 小鼠處死方法統(tǒng)計(jì)

3.1安死術(shù)在論文撰寫和發(fā)表層面被忽視

本研究納入的890篇文獻(xiàn)中僅有2篇文章提到“安死術(shù)”和“安樂死”，占0.22%(2/890)；僅有39.44%的文章明確提到小鼠處死方法。提到處死方法的文獻(xiàn)對(duì)小鼠處死方法的描述也不夠嚴(yán)謹(jǐn)，如窒息法處死、引頸處死、脫頸活殺等。麻醉劑種類對(duì)過量麻醉處死小鼠技術(shù)是核心內(nèi)容，但提到麻醉劑種類的只占53.33%。作者認(rèn)為各學(xué)術(shù)雜志應(yīng)通過加強(qiáng)論文發(fā)表環(huán)節(jié)福利倫理要求，以規(guī)范動(dòng)物實(shí)驗(yàn)論文撰寫，進(jìn)而促進(jìn)我國(guó)科學(xué)安樂死在實(shí)際工作的實(shí)施。

3.2頸椎脫臼和斷頭是使用率較高的兩種方法

這兩種方法都屬于物理方法，當(dāng)有動(dòng)物體重限制并且由有經(jīng)驗(yàn)和操作熟練的人實(shí)施時(shí)使用物理方法是人道的[4]。歐盟指令2010/63/EU提出，在無其他方法的前提下可接受斷頭處死嚙齒類動(dòng)物[5]。美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)(American Veterinary Medical Association,AVMA)指南指出“頸椎脫臼和斷頭”一定條件下對(duì)大鼠(體重< 200 g)和小鼠是可以接受的。所指條件集中在操作層面，包括(1)人員需經(jīng)過培訓(xùn)；(2)由技術(shù)熟練和過關(guān)的人員實(shí)施；(3)相關(guān)設(shè)備(主要針對(duì)斷頭法)必須合適[6]。英國(guó)《動(dòng)物法案》要求頸椎脫臼處死前，需進(jìn)行鎮(zhèn)靜或麻醉[7]。頸椎脫臼法的缺點(diǎn)為不是每次操作都會(huì)使動(dòng)物迅速死亡，有時(shí)動(dòng)物會(huì)恢復(fù)呼吸/意識(shí)，還存在意識(shí)和感覺，而這正是動(dòng)物痛苦的根源。Carbone等的研究，使用三種造成頸椎脫臼的方法即(1)操作者一手固定尾部，另一手按住動(dòng)物頸部做扭轉(zhuǎn)動(dòng)作；(2)用止血鉗輔助；(3)胸椎部脫臼(實(shí)施頸椎脫臼時(shí)可能發(fā)生這種意外情況)，結(jié)果顯示成功率最高的第一種方法，尚有10%(2/22)的動(dòng)物在實(shí)施頸椎脫臼后持續(xù)呼吸180 s以上[8]。綜上所述，頸椎脫臼方法處死小鼠是可以的，但操作者技能必須合格，實(shí)施后必須確認(rèn)動(dòng)物的死亡。

3.3使用過量麻醉劑進(jìn)行安樂死

調(diào)查中使用較多的戊巴比妥鈉和苯巴比妥鈉屬于巴比妥類藥物。該類藥物抑制呼吸中樞，過量深度麻醉可導(dǎo)致窒息并伴有心臟驟停，能使動(dòng)物安靜死去，產(chǎn)生的不適感輕。腹腔注射戊巴比妥鈉會(huì)因腹膜刺激反應(yīng)而引起疼痛，故由技術(shù)熟練的人員靜脈注射效果該類藥物效果最好。三溴乙醇屬于醇類物質(zhì)，通過抑制神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)引起麻醉和缺氧，最終導(dǎo)致死亡。三溴乙醇可用于小鼠安樂死，但如用于更大動(dòng)物安樂死，所需用量過大、不易實(shí)現(xiàn)。水合氯醛通過抑制呼吸中樞進(jìn)而血氧不足而引起死亡，動(dòng)物會(huì)伴有喘息、肌肉痙攣并發(fā)出聲音。因其不良反應(yīng)嚴(yán)重，美國(guó)AVMA不推薦用于安樂死藥物。乙醚具有刺激性、易燃易爆的特性，也不推薦用于安樂死。使用該方法安樂死時(shí)需強(qiáng)調(diào)的是：針對(duì)不同物種，選用合適的麻醉劑、劑量濃度和給藥途徑。

3.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中存在動(dòng)物麻醉后進(jìn)行解剖取材的情況，動(dòng)物由于失去組織、臟器或大量失血而死亡

實(shí)驗(yàn)期間需密切觀察動(dòng)物反應(yīng)，確保動(dòng)物在手術(shù)中瀕死期免遭痛苦：(1)確保動(dòng)物進(jìn)入深度麻醉后再進(jìn)行操作；(2)操作者技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)熟練；(3)手術(shù)前制定麻醉方案，避免術(shù)中動(dòng)物遭受更多的痛苦；(4)觀察動(dòng)物的狀態(tài)，避免動(dòng)物有知覺時(shí)進(jìn)行手術(shù)。

3.5二氧化碳窒息法

盡管此次調(diào)查僅有2篇文章使用該方法處死小鼠，但鑒于二氧化碳窒息法處死動(dòng)物的效率高，操作者的心理負(fù)擔(dān)較小，近年來有大量介紹和推薦使用二氧化碳窒息法的文章，現(xiàn)實(shí)中二氧化碳窒息法的使用也有擴(kuò)大的趨勢(shì)。但新研究表明，嚙齒類動(dòng)物對(duì)二氧化碳有明顯的厭惡感，高于一定濃度的二氧化碳會(huì)造成動(dòng)物的疼痛[6]。國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利權(quán)威組織也認(rèn)同這一看法，故要求執(zhí)行二氧化碳窒息法，須嚴(yán)格控制氣體濃度升高的速率。AVMA要求二氧化碳置換率為每分鐘10%～30%容器體積[6]，以保證在引起疼痛之前，動(dòng)物已失去意識(shí)。而目前市面部分二氧化碳窒息機(jī)不能精確控制進(jìn)氣量，一些自制儀器也存在這一問題。故作者建議，應(yīng)嚴(yán)格選用可控制氣體流速的二氧化碳窒息設(shè)備實(shí)施安樂死，條件不滿足時(shí)不應(yīng)使用。

3.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安死術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員心理健康的影響

對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)陌矘匪?，也是?duì)實(shí)驗(yàn)人員的一種保護(hù)，特別是心理上的。當(dāng)某些工作人員要較高頻率地處死動(dòng)物或作為旁觀人員面臨處死動(dòng)物的場(chǎng)景時(shí)，經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生消極、厭惡情緒，影響心理健康。而當(dāng)采用認(rèn)可的安樂死方法處死動(dòng)物時(shí)，能顯著降低這種消極、負(fù)面的心理影響。

3.7小結(jié)

綜上所述，簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)某種處死方法是否為安死術(shù)是困難的，也是不科學(xué)的。選擇適合的安死術(shù)需從動(dòng)物種類、動(dòng)物遭受的疼痛和痛苦、人員安全性、成功率、藥物獲得方式、對(duì)操作者情緒影響等多方面考慮。實(shí)際工作中，選擇適合的安死術(shù)還需由獸醫(yī)結(jié)合現(xiàn)實(shí)情況從專業(yè)角度做出判斷[9]。選定方法后，由掌握技術(shù)要點(diǎn)、操作熟練的人員實(shí)施安死術(shù)也至關(guān)重要[10]，包括動(dòng)物的抓取與保定、靜脈穿刺、麻醉劑劑量以及二氧化碳流速、安樂死箱的用法等。故全面提高我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利，真正仁慈地結(jié)束實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生命，制定政策法規(guī)僅為第一步，還需要加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)的研究和培訓(xùn)，讓實(shí)驗(yàn)人員切實(shí)掌握安死術(shù)。

[1] 國(guó)科發(fā)財(cái)字 [2006] 398號(hào), 關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見.

[2] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu) 質(zhì)量和能力的通用要求[S].GB/T 27416.2-2014.

[3] 孫嘉康, 錢鑫, 慎慧, 等. 淺談我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死的實(shí)施 [G]. 第六屆生命科學(xué)研究與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代法國(guó)際大會(huì)(北京衛(wèi)星會(huì)議)暨第三屆北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)國(guó)際論壇論文匯編. 北京: 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì), 2008: 12-15.

[4] Hawkins P, Prescott MJ, Carbone L, et al. A good death? Report of the Second Newcastle Meeting on Laboratory Animal Euthanasia[J]. Animals (Basel), 2016, 6(9): 50-78.

[5] European Commission. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the Protection of Animals Used for Scientific Purposes. Available online: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:en:PDF (accessed on December 2015).

[6] AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. American Veterinary Medical Association: 26.

[7] Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations. 2012.

[8] Carbone L, Carbone ET, Yi EM, et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice [J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2012, 51(3): 352-356.

[9] 劉云波. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死若干問題 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 18(2): 76-78.

[10] 朱玉峰, 王元占, 楊培梁, 等. 淺談實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死 [J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)倫理學(xué), 2011, 24(2): 260-261, 264.

AnalysisofcurrentstatusofmouseeuthanasiamethodsbasedonthepublicationsinChina(2015-2016)

YUE Dong-xu1， CHI Hong-wei1， LU Shuang-shuang1， WANG Xin-fang1， SUN De-ming2， LIU Xiao-yu1 *， LU Xuan-cheng1 *

(1.Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China；2.Institute of Science and Technology, National Health and Family Planning Commission of P. R. C, Beijing 100081)

ObjectiveTo investigate the current status of mouse euthanasia methods in China, and to provide the reference and basis for the administrative authorities of laboratory animal management to master the implementation of “euthanasia” and formulate related policies.MethodsResearch papers containing the terms of “mouse” and “execution” in Chinese characters during the period from 2015 to 2016 were searched in Wanfang database, and statistical analysis was performed with the articles meeting the searching criteria.ResultsA total of 890 research articles met the searching criteria, of which 351 articles clearly described the killing method, accounting for only 39.44%. The mouse-killing methods included cervical dislocation, decapitation, exsanguination and sampling after anesthesia, excessive anesthesia, abdominal aorta bleeding and carbon dioxide asphyxiation, among them cervical dislocation accounted for the highest rate, 75.78%.ConclusionsThe current implementation of mouse euthanasia methods in our country has been far from optimistic. The mouse euthanasis methods have often been ignored in scientific articles and the description of the methods is not standardized. In order to promote the effective implementation of the regulations related to mouse euthanasia, it is needed to promote the study of related techniques and to strengthen personnel training.

Mice; Euthanasia; Anesthesia

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心青年科研基金(編號(hào)：2016A106)。

岳東旭(1988 -)，女，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)。E-mail: yuedx@chinacdc.cn

劉曉宇(1979 -)，女，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，E-mail: liuxyl@chinacdc.cn；盧選成(1977 -)，男，副研究員，研究方向：生物安全，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，E-mail: luxch@chinacdc.cn * 共同通訊

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0091-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.019

2017-04-26