不同免疫方案建立實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型的分析與評價

閆紅梅，李 覃，周 欣

不同免疫方案建立實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型的分析與評價

閆紅梅1，2，李 覃3，周 欣2，4，趙季紅2，4

目的探討不同免疫方案建立Balb/c小鼠實驗性自身免疫性心肌炎模型的優(yōu)劣。方法取6周齡雄性Balb/c小鼠，設(shè)計三種造模方案，并均設(shè)正常對照組和模型組。經(jīng)不同方案免疫動物后行動物超聲影像系統(tǒng)檢測心功能，病理形態(tài)觀察心肌炎癥和纖維化，并計算心指數(shù)和脾指數(shù)，qRT-PCR檢測小鼠心臟和脾臟組織TLR2、TLR4基因的表達水平。結(jié)果與正常對照組相比，方案一中模型組小鼠心指數(shù)和脾指數(shù)無明顯差異，超聲檢測中射血分數(shù)(EF)及各室壁厚度均無明顯差異，心肌炎癥改變不明顯，纖維化不明顯，TLR2、TLR4 mRNA的表達量無明顯變化；方案二中模型組EF、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)以及左室收縮末內(nèi)徑(LVEDs)明顯降低，但舒張期室間隔厚度(IVSd)及收縮期室間隔厚度(IVSs)與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義；病理形態(tài)觀察可見心肌出現(xiàn)少量單核細胞浸潤，心肌細胞腫脹，心肌間質(zhì)及外膜可見少量的纖維化，同時脾指數(shù)明顯增加，心臟與脾臟組織TLR2、TLR4的mRNA表達量無明顯變化；方案三中模型組EF、LVEDd、LVEDs均明顯降低，而IVSd及 IVSs未見顯著改變，病理學(xué)檢測可見心肌大量炎細胞浸潤，心肌細胞腫脹，心肌間質(zhì)及外膜可見少量的纖維化，伴有脾指數(shù)的顯著增加，心臟與脾臟組織TLR2 mRNA的表達量升高，而TLR4的mRNA表達量無明顯變化。結(jié)論與方案一模型組和方案二模型組相比，方案三模型組的造模效果更好，其免疫方案可用于自身免疫性心肌炎相關(guān)研究，具有較好的參考價值。

自身免疫性心肌炎；小鼠模型；TLR；心臟功能

心肌炎是指心肌的炎癥性疾病，是導(dǎo)致擴張性心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)的首要原因[1]。病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是臨床上最常見的類型，自身免疫在其發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。實驗性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis，EAM)在組織學(xué)上與VMC類似，因此，建立合理的EAM模型，可以為臨床研究VMC及其預(yù)后評價和藥物研發(fā)等方面提供基礎(chǔ)。目前，EAM動物模型的建立方法差異較大，哪種方法能夠達到更好的免疫效果尚待進一步發(fā)掘。本研究探索建立小鼠EAM模型的最佳方案，希望為臨床上VMC的相關(guān)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Balb/c小鼠，6周齡，體重18 g～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)條件為室溫22°C～24°C，相對濕度45%～55%，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后投入實驗。鼠源性心肌肌球蛋白重鏈16肽段，購自吉爾生化(上海)有限公司；完全弗氏佐劑(CFA)購自sigma公司；異氟烷購自河北一品制藥有限公司； Trizol 試劑盒、DNA marker、PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品；Vevo 2100高頻小動物超聲影像系統(tǒng)為Visualsonics公司產(chǎn)品；Leica石蠟切片機購自萊卡公司。

1.2 建立動物模型 36只Balb/c小鼠隨機分為正常組(n=6)和模型組(n=6)。將心肌肌球蛋白重鏈16肽段溶于0.15 mol/L磷酸鉀緩沖液，調(diào)濃度為1.0 mg/mL，并與等體積CFA充分乳化混勻。方案一：模型組小鼠分別于即刻、7 d背部多點皮下注射0.2 mL心肌肌球蛋白(100 μg)；方案二：模型組小鼠即刻背部多點皮下注射0.3 mL心肌肌球蛋白(150 μg)。方案三：模型組小鼠分別于即刻、7 d背部多點皮下注射0.3 mL心肌肌球蛋白(150 μg)。三種造模方案均設(shè)置相應(yīng)的正常對照組，按相應(yīng)方案注射等量PBS緩沖液。以上三種方案均于第21天處死小鼠，心臟與脾臟稱重，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 高頻小動物超聲影像系統(tǒng)檢測小鼠心功能 第21天用Vevo 2100小動物超聲影像系統(tǒng)和40 MHz高頻探頭測定小鼠心功能。20 mL/min異氟烷麻醉小鼠，仰臥位固定，控制心律400次/min。分別取胸骨旁左室長軸(parasternal long axis，PSLAX)和胸骨旁乳頭肌水平左室短軸切面(parasternal short axis，PSSAX)。M型超聲模式記錄反映心室收縮功能和舒張功能的射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end- diastolic dimension，LVEDd)、左室收縮末內(nèi)徑(ieft ventricular end- systolic dimension，LVEDs)、舒張期室間隔厚度(interventricular septumdiastolic，IVSd)、收縮期室間隔厚度(interventricular septum systolic，IVSs)等指標。將PSLAX與PSSAX的值求平均值，進行分析比較。

1.4 蘇木精-伊紅(Hamp;E)染色 在第21天處死小鼠后取心臟組織，從心尖部橫切，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片(5 μm)，常規(guī)Hamp;E染色，中性樹膠封片，普通光鏡下觀察心臟組織形態(tài)學(xué)變化。每張切片隨機選取5個視野，計算每個視野中炎癥細胞浸潤情況。心肌炎癥程度根據(jù)Eriksson分級法分為0級～4級：0 無明顯炎性細胞浸潤；1級少量炎性細胞局灶性浸潤；2級局灶性炎性細胞浸潤(炎性細胞數(shù)gt;100個)；3級浸潤炎性細胞gt;10%；4級浸潤炎性細胞gt;30%。

1.5 Masson染色 第21天處死小鼠后取心臟組織，從心尖部橫切，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片(5 μm)，予以常規(guī)Masson 三色染色，在200倍普通光鏡視野下，分別對心內(nèi)膜、心外膜以及間質(zhì)進行觀察，隨機選取10個視野，進行圖像采集。用Image Pro Plus 4.5軟件進行圖像分析，選出陽性區(qū)域，得到陽性區(qū)域面積(μm2)，計算出陽性區(qū)域占總區(qū)域的百分比，求均值作為該標本心肌膠原容積分數(shù)(collage volume fraction，CVF)，以此評估心肌纖維化程度。

1.6 實時定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)檢測 按照Trizol 試劑盒說明書操作，取1.5 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物由北京中美泰和有限公司合成：β-actin(5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3，5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’)，TLR2(5’-TCTCTGGAGCATCCGAATTG-3’，5’-CCTGAGCAGAACAGCGTTTG-3’)，TLR4(5’-ACCTGGCTGGTTTACACGTC-3’，5’-CTGCCAGAGACATTGCAGAA-3’)，NLRP3(5’-CCCTTggAgACACAggACTC-3’，5’-gAggCTgCAgTTgTCTAATTCC-3’)，qRT-PCR條件為：預(yù)變性94 ℃，5 min，變性94 ℃，1 min，退火60 ℃，30 s，延 伸72 ℃，1 min，40個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。重復(fù)3次。設(shè)雙復(fù)孔。β-actin作為內(nèi)參。采用2-△△Ct方法計算目的基因的表達水平，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.7 臟器指數(shù) 免疫后第21天稱取小鼠體重，取材前稱取心臟重量，脾臟重量，分別計算心臟的重量(mg)/體重(g)，脾臟的重量(mg)/體重(g)，即心指數(shù)和脾指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠心功能變化 方案一中模型組與對照組相比各項指標均無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。方案二中模型組EF、LVEDd及LVEDs與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)；而IVSd及 IVSs與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。方案三中，模型組EF、LVEDd、LVEDs較對照組明顯下降(Plt;0.05)；而IVSd及 IVSs與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。 方案三中模型組 LVEDd降低程度較方案一模型組更顯(Plt;0.05)，較方案二的EF值降低更顯著(Plt;0.05)。詳見圖1、表1。

注：A為方案一對照組；B為方案一模型組；C為方案二對照組；D為方案二模型組；E為方案三對照組；F為方案三模型組。

圖1小鼠超聲心動圖

免疫方案組別nEF(%)LVEDd(mm)LVEDs(mm)IVSd(mm)IVSs(mm)方案一對照組658.52±7.483.62±0.302.70±0.230.80±0.171.06±0.25模型組652.65±5.743.21±0.552.52±0.650.95±0.141.28±0.22方案二對照組658.66±5.653.65±0.143.00±0.180.77±0.081.04±0.10模型組651.53±2.161)3.31±0.341)2.53±0.171)0.81±0.091.10±0.11方案三對照組654.59±4.564.37±0.383.12±0.360.86±0.011.03±0.18模型組636.37±4.581)3.86±0.141)2.06±0.201)0.89±0.051.17±0.11 與相同方案對照組比較,1)Plt;0.05。

2.2 心肌組織病理學(xué)變化

2.2.1 HE染色結(jié)果 方案一、方案二以及方案三中模型組心臟外觀與對照組相比，未見明顯改變，未見明顯心室擴大及室壁增厚或變薄。方案一、方案二以及方案三中對照組小鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)基本正常，心肌纖維排列整齊，胞漿均勻豐富，橫紋清晰，間質(zhì)無水腫，無炎癥細胞浸潤。方案一中模型組于光鏡下幾乎未見炎癥細胞浸潤以及心肌細胞腫脹，其心肌炎癥評分與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。方案二與方案三中模型組小鼠可見不同程度的炎癥改變。方案二中模型組于光鏡下可見心肌細胞腫脹，有少量單核細胞浸潤，并可見少量淋巴細胞和中性粒細胞，炎癥細胞浸潤主要集中于心外膜及間質(zhì)，方案三中模型組于光鏡下可見心肌細胞腫脹，有大量單核細胞浸潤，并可見少量的淋巴細胞和中性粒細胞，炎癥細胞浸潤主要集中于心外膜及間質(zhì)。方案二以及方案三中模型組心肌炎癥評分與相應(yīng)對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)，方案二模型組心肌炎癥評分與方案一模型組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)，方案三模型組心肌炎癥評分與方案二模型組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)。詳見圖2、表2。

A B C D E F

2.2.2 Masson三色染色 采用三種不同免疫方案免疫小鼠后，兩組小鼠心肌Masson染色示膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。 方案一中模型組小鼠未見明顯纖維化，其模型組的CVF與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。方案二以及方案三中模型組于心肌間質(zhì)及外膜均可見少量的纖維化。方案二以及方案三中模型組 CVF與其對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。詳見圖3、表2。

A B C D E F

注：A為方案一對照組；B為方案一模型組；C為方案二對照組；D為方案二模型組；E為方案三對照組；F為方案三模型組。

圖3心肌組織Masson染色(×200)

免疫方案組別n心肌炎癥評分(分)CVF(%)方案一對照組60.37±0.030.22±0.06模型組60.38±0.020.25±0.11方案二對照組60.33±0.030.13±0.06模型組61.11±0.211)1.29±0.961)方案三對照組60.34±0.030.10±0.06模型組62.34±0.051)2.28±0.021) 與相同方案對照組比較,1)Plt;0.05。

2.3 臟器指數(shù) 方案一、方案二以及方案三中第21天心指數(shù)與對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。方案一中模型組脾指數(shù)與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；方案二中模型組脾指數(shù)與其對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。詳見表3。方案三中模型組脾指數(shù)與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)。

免疫方案組別n心指數(shù)(mg/g)脾指數(shù)(mg/g)方案一對照組66.34±0.694.42±0.68模型組66.60±0.454.84±1.04方案二對照組65.65±0.814.97±0.93模型組66.26±0.787.01±1.441)方案三對照組65.44±1.094.25±1.11模型組65.17±0.509.18±1.532) 與相同方案對照組比較,1)Plt;0.05,2)Plt;0.01。

2.4 qRT-PCR

2.4.1 心臟組織qRT-PCR檢測結(jié)果 方案一以及方案二中模型組TLR2，TLR4 mRNA的表達量與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；方案三中模型組TLR2 mRNA的表達量與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，而模型組TLR4 mRNA的表達量與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。詳見圖4。

注：與相同方案對照組比較，*Plt;0.05。

圖4心臟組織TLR2、TLR4的mRNA表達水平

2.4.2 脾臟組織qRT-PCR檢測結(jié)果 脾臟組織與心臟組織qRT-PCR 檢測結(jié)果一致，方案一以及方案二中模型組TLR2，TLR4 mRNA的表達量與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；方案三中模型組TLR2 mRNA的表達量與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，而模型組TLR4 mRNA的表達量與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。詳見圖5。

注：與相同方案對照組比較，*Plt;0.05。

圖5脾臟組織TLR2、TLR4的mRNA表達水平

3 討 論

EAM以心肌細胞的腫脹和壞死為特征，伴隨著炎癥細胞的浸潤和纖維化改變。心臟肌球蛋白(cardiac myosin，CM)是心肌的結(jié)構(gòu)蛋白，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，可誘導(dǎo)建立EAM，由CD4+T細胞介導(dǎo)，也是心肌炎的主要抗原，CM作為自身抗原可與抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)表面的主要組織相容性抗原Ⅱ(major histocompatibility antigen Ⅱ，MHCⅡ)類分子結(jié)合，形成抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物，進而激活CD4+T細胞[2]，其中CD4+Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，刺激細胞毒性T細胞增殖、激活巨噬細胞等，起到致炎作用。

本實驗采用CM誘導(dǎo)小鼠建立EAM模型，組織病理學(xué)結(jié)果顯示，方案一心肌組織中無明顯炎癥及纖維化改變，方案二中心肌細胞腫脹，出現(xiàn)少量單核細胞浸潤，并可見少量的纖維化；方案三中心肌細胞腫脹，心肌組織可見大量的炎癥細胞以及少量的纖維化。三種免疫方案出現(xiàn)不同的病理表現(xiàn)，可能與CM的劑量以及免疫次數(shù)有關(guān)，與此前相關(guān)文獻報道一致[3-6]。第21天為EAM急性炎癥期，肌球蛋白達到一定劑量并多次免疫小鼠，可引起持續(xù)的自身免疫反應(yīng)，以及明顯的心肌細胞損害，出現(xiàn)典型的心肌炎癥改變，但該段時期心肌纖維化程度并不明顯，提示心肌炎急性期可能尚未發(fā)生膠原的明顯蓄積。超聲心動圖檢測顯示，方案二與方案三心肌炎小鼠EF，LVEDd，LVEDs明顯降低，提示EAM急性炎癥期心肌舒張與收縮功能受損，心功能明顯降低，心肌亦伴隨不同程度的炎癥細胞浸潤，說明EAM心功能與心肌炎癥程度密切相關(guān)。

近年來，關(guān)于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)在EAM中的作用越來越受到關(guān)注，TLRs在先天性和獲得性免疫中起重要作用[7-8]，TLR2和TLR4屬于TLRs家族成員，會促進炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。有研究表明，TLR2和TLR4在無菌性炎癥反應(yīng)條件下，在急性或慢性心血管疾病中起著關(guān)鍵作用[9]。本研究結(jié)果顯示，EAM模型小鼠TLR2表達水平顯著升高，其機制可能為CM促進心肌自身免疫反應(yīng)，并經(jīng)TLR活化NF-κB信號通路[8]。

本研究采用三種不同方案免疫Balb/c小鼠，并成功建立EAM動物模型，該模型穩(wěn)定并與人類VCM相似，可為臨床上VMC及DCM相關(guān)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，將這種免疫方案用于病毒性心肌炎的相關(guān)研究，具有較好的參考價值。

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2016-11-15)

(本文編輯 王雅潔)

The Analysis and Evaluation of Experimental Autoimmune Myocarditis in Mouse Model Based on Different Immunization Programs

Yan Hongmei， Li Tan， Zhou Xin， Zhao Jihong

Graduate School， Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China;Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury， Cardiovascular Disease Institute， Tianjin 300162，China

Zhou Jihong//Tianjin Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Target Organ Injury,Cardiovascular Disease Institute，Tianjin 300162，China；Affiliated Hospital of Logistics University of the Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China

ObjectiveTo explore the advantages and disadvantages of different immunization programs to establish experimental autoimmune myocarditis (EAM) mouse model.MethodsWe design three protocols to establish the experimental autoimmune myocarditis using Balb/c mice. The mice were assigned to normal control group and experimental group. Then， ultrasound imaging system was used to detect cardiac function， and quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in heart and spleen tissues.Finally，the changes of inflammation and fibrosis were observed pathologically， and the heart/spleen indexes were calculated.ResultsThe results showed that there was no differences for the first immunization program，compared with the normal control group. For the second immunization program， the values of ejection fraction (EF)， left ventricular systolic dysfunction (LVSDd ) and LVEDs were obviously reduced in experiment group， associated with a amount of mononuclear cell infiltration and fibrosis.Meanwhile the spleen index of experiment group was obviously increased. However， there were not obvious changes on the expressions of TLR2 and TLR4. For the third immunization program， the values of EF， LVEDd，and LVEDs were obviously reduced in experimental group. A large amount of mononuclear cell infiltration and fibrosis were seen in the myocardium and the outer membrane of the experimental group. The spleen index was also markedly increased， as well as overexpression of TLR2.ConclusionThe data indicate that the third program may be the best protocol for establishing EAM mouse model， which would provide a basis for EAM-related research.

autoimmune myocarditis；mouse model；toll-like receptor；cardiac function

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.007

1672-1349(2017)21-2684-06

國家自然科學(xué)基金(No.81202843，81570335)，天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(No.14JCZDJC36700)，天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室開放基金(No.TJC1402)

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(天津300193)；2.天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室； 3.天津武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院；4.天津武警后勤學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室

趙季紅，E-mail：zjhwj@163.com

信息：閆紅梅，李覃，周欣，等.不同免疫方案建立實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型的分析與評價[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2684-2689.