血管緊張素Ⅱ?qū)υ囵B(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的影響

崔 琳，王幼平，謝世陽(yáng)，李 彬，王新陸，于 瑞，郝軒軒，高 原，王小曉，朱明軍

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

血管緊張素Ⅱ?qū)υ囵B(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的影響

崔 琳1，王幼平1，謝世陽(yáng)1，李 彬1，王新陸2，于 瑞2，郝軒軒2，高 原1，王小曉1，朱明軍1

目的探討血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)對(duì)原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖及轉(zhuǎn)分化的影響，摸索合適的AngⅡ濃度。方法應(yīng)用胰蛋白酶消化出生1 d～3 d 乳鼠心臟，差速貼壁法分離培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，免疫熒光法鑒定心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白(vimentin)表達(dá)；用不同濃度的AngⅡ作用于心肌成纖維細(xì)胞，MTT法檢測(cè)AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖影響；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)熒光含量；Westernblot技術(shù)檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)量變化。結(jié)果不同濃度 AngⅡ作用于心肌成纖維細(xì)胞，10-6、10-7mol/L AngⅡ能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖增加；10-5、10-6、10-7mol/L AngⅡ能促進(jìn)α-SMA熒光強(qiáng)度增加；10-6mol/L AngⅡ可引起α-SMA蛋白表達(dá)量增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論AngⅡ可引起心肌成纖維細(xì)胞增殖；同時(shí)可誘導(dǎo)α-SMA表達(dá)量增加。

血管緊張素Ⅱ；新生大鼠；心肌成纖維細(xì)胞；波形蛋白；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；原代培養(yǎng)

慢性心功能不全是各種心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一種綜合征，是心血管疾病死亡的主要原因之一。導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心室重構(gòu)(ventricular remodeling，VR)[1-3]。心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化是心室重構(gòu)的主要特征，其也是決定慢性心力衰竭(CHF)的發(fā)病率、死亡率非常重要的病理因素。因此，如何逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)成為國(guó)內(nèi)外共同的研究熱點(diǎn)。

心肌成纖維細(xì)胞(CFs)是心臟中數(shù)量最多且主要合成、分泌心臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的細(xì)胞類型[4-5]。膠原過(guò)度增生、沉積導(dǎo)致心肌纖維化可能是心室重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)。在心室重構(gòu)過(guò)程中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在其中起著極為重要的作用，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為RAAS最為重要的效應(yīng)分子，具有眾多的生物學(xué)活性，與心室重構(gòu)密切相關(guān)，可引起CFs的增生和心臟間質(zhì)纖維化[6-10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外原代提純培養(yǎng)新生大鼠(1 d～3 d)的CFs，通過(guò)AngⅡ處理CFs，在細(xì)胞水平研究AngⅡ?qū)Fs增殖及其向肌成纖維細(xì)胞(Myofibro blast，MF)發(fā)生轉(zhuǎn)化的影響，這可能為進(jìn)一步探討中藥及其有效組分對(duì)CFs增殖分化抑制作用的可能機(jī)制提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生后1 d～3 d SD大鼠，雌雄不限，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002，動(dòng)物合格證號(hào)：41003100001587。

1.2 儀器 RCO-3000TVBB型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)REVCD公司)、Milli-Q Synthesis超純水儀(美國(guó)Milipore公司)、Spetra Max M3酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)、倒置熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)、-70℃冰箱(美國(guó)Thermo公司)、BCM-1300 生物潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)。

1.3 試劑 AngⅡ(SIGMA公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBC0公司)、胎牛血清(以色列BI公司)、兔單克隆Vimentin抗體(美國(guó)abcam 公司)、MTT(Amresco公司)、Alexa flior 594 羊抗兔IgG(武漢三鷹生物)、α-SMA一抗、水溶性封片劑(武漢博士德公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.4 新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)并進(jìn)行改進(jìn)[11]，取新生1 d～3 d的SD大鼠，無(wú)菌下開(kāi)胸取心尖部，用預(yù)冷的PBS液洗滌3遍，仔細(xì)去除血管、心房及結(jié)締組織，將心臟剪成約1 mm3大小的組織塊；用心肌細(xì)胞消化液(Trypsin 0.16 g，NaCl 1.6 g，NaHCO30.070 6 g，無(wú)水葡萄糖0.198 2 g，KCl 0.059 6 g，HEPES 0.4 g，定容至200 mL，0.22 μL濾器過(guò)濾除菌)在37℃恒溫磁力攪拌器中分次消化心肌組織7～8次，每次5 min。第一次消化后自然沉淀并棄上清，以后自然沉淀后取上清，直至組織塊變?yōu)榘咨该?；每次分離的上清液加等量含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾除去未充分消化的組織塊。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶放入37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱，差速貼壁培養(yǎng)1.5 h，培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞即為心肌成纖維細(xì)胞。加4 mL含 10%胎牛血清的EMDM培養(yǎng)液入培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)近融合時(shí)按1∶2傳代，實(shí)驗(yàn)采用2～4代細(xì)胞。

1.5 心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白抗體鑒定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液，接種到預(yù)先放置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度適當(dāng)取出蓋玻片，PBS漂洗兩次，用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗2次；0.5% Triton-100滴加爬片20 min；PBS漂洗2次；用10%山羊血清封閉20 min，不洗滌片；滴加波形蛋白一抗(1∶500)4 ℃過(guò)夜；PBS漂洗2次；滴加熒光標(biāo)記的FITC，37℃ 20 min；PBS漂洗2次；DAPI染核5 min；PBS漂洗2次；水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察，計(jì)算成纖維細(xì)胞純度。

1.6 AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖的影響 心肌成纖維細(xì)胞以2×104/mL的密度接種于96孔板，待生長(zhǎng)貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h，將細(xì)胞分成5組： 空白對(duì)照組及10-4mmol/L、10-5mmol/L、10-6mmol/L、10-7mol/L AngⅡ組。加入不同濃度AngⅡ分別刺激24 h和48 h，之后每孔加入0.5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL DMSO，充分震蕩混勻10 min，測(cè)定490 nm吸光度值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.7 免疫熒光法檢測(cè)AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響 心肌成纖維細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于24孔板，待生長(zhǎng)貼壁后以10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L AngⅡ處理細(xì)胞，作用24 h后用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗2次；0.5% Triton-100滴加爬片20 min；PBS漂洗2次；用10%山羊血清封閉20 min，不洗滌片；滴加α-SMA一抗(1∶500)4℃過(guò)夜；PBS漂洗2次；滴加熒光標(biāo)記的FITC，20℃～37℃ 20 min；PBS漂洗2次；水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察α-SMA陽(yáng)性表達(dá)量并拍照。

1.8 Westernblot檢測(cè)AngⅡ?qū)Ζ?SMA蛋白含量的影響 將CFs以4×105細(xì)胞種6孔板，10-6mol/L AngⅡ加入24 h 后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，收集裂解液于4℃ 12 000 r/min離心15 min ，收集上清液凍存。10% 十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecyl sulphate，SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯 (polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，小鼠a-SMA單克隆抗體4℃過(guò)夜，TBST洗脫。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗37℃孵育1 h，TBST洗脫。ECL 發(fā)光試劑盒顯色、顯影，于暗室內(nèi)曝光。以GADPH作為內(nèi)部對(duì)照，采用Image ProPlus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的積分吸光度。

2 結(jié) 果

2.1 成纖維細(xì)胞形態(tài)及波形蛋白免疫熒光鑒定 倒置顯微鏡下觀察，CFs呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，顏色淡，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)。本研究中所獲細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征均與此相符。如圖1-A，1-B；免疫熒光染色鑒定：用波形蛋白單克隆抗體作為一抗，染色后見(jiàn)與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的絲狀物，見(jiàn)圖1-C，1-D，1-E，1-F；細(xì)胞純度gt;98%，證實(shí)該細(xì)胞可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。詳見(jiàn)圖1。

注：A為心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)(光鏡 200×)；B為心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)(光鏡 400×)；C為波形蛋白熒光染色(200倍)(一抗1∶500，熒光二抗1∶200)；D為DAPI染核(200×)；E為波形蛋白熒光染色(400×)；F為DAPI染核(400×)。

圖1原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光鑒定

2.2 AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖的影響 不同濃度AngⅡ作用24 h，AngⅡ10-7mol/L與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05) ；10-6mol/L AngⅡ刺激組與正常組相比，OD值明顯增加，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。10-4mol/L、10-5mol/L AngⅡ組與正常組相比，OD值明顯降低(Plt;0.05)，提示較高濃度的AngⅡ可能具有抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用。見(jiàn)圖2。不同濃度AngⅡ作用48 h，AngⅡ10-5mol/L，AngⅡ10-6mol/L組與正常組OD值相比有所增加，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)；AngⅡ10-7mol/L與正常組相比，OD值增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)；AngⅡ10-4mol/L與正常組相比OD值明顯降低，并且差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。詳見(jiàn)圖3，表2。根據(jù)增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇AngⅡ10-5mol/L、AngⅡ10-6mol/L、AngⅡ10-7mol/L濃度繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)α-SMA蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。

注：*Plt;0．05 vs 24 h正常組，# Plt;0．05 vs 48 h正常組。

圖2不同濃度AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞作用24 h

注：*Plt;0．05 vs 24 h正常組，# Plt;0．05 vs 48 h正常組。

圖3 不同濃度AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞作用48 h

2.3 不同濃度的AngⅡ?qū)Ζ?SMA熒光強(qiáng)度的影響 如圖3所示，不同濃度AngⅡ作用24 h，正常組心肌成纖維細(xì)胞有少量α-SMA表達(dá)；AngⅡ10-5mol/L、AngⅡ10-6mol/L、AngⅡ10-7mol/L刺激組α-SMA明顯增加。結(jié)合心肌成纖維細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇AngⅡ10-6mol/L組進(jìn)行后續(xù)蛋白表達(dá)分析。

注：A為正常組，B為AngⅡ10-7mol/L，C為 AngⅡ10-6 mol/L，D為 AngⅡ10-5 mol/L。

2.4 Westernblot檢測(cè)AngⅡ?qū)Ζ?SMA蛋白表達(dá)量的影響 正常組心肌成纖維細(xì)胞有少量α-SMA表達(dá)；10-5mol/L AngⅡ作用24 h，α-SMA表達(dá)量明顯增加，且與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

注：與正常組比較，*Plt;0．05。

3 討 論

心肌受損是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括心肌細(xì)胞的壞死、凋亡以及生化和代謝等諸多方面的改變，而心肌纖維化是大多數(shù)心肌受損的最終結(jié)局，是一個(gè)緩慢的動(dòng)態(tài)過(guò)程。心肌間質(zhì)纖維化是心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過(guò)量積聚或成分發(fā)生改變的一種現(xiàn)象。在該過(guò)程中，大量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積是形成纖維化的核心環(huán)節(jié)和關(guān)鍵步驟。心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞是目前研究心肌纖維化的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，不同濃度的血管緊張素Ⅱ作用于原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞后，其增殖有不同程度的提高，且表現(xiàn)為AngⅡ10-6mol/L 24 h組、AngⅡ10-7mol/L 48 h組與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在該濃度及時(shí)間下心肌細(xì)胞增殖增加。AngⅡ和醛固酮是RAAS的兩種主要效應(yīng)分子，AngⅡ與 AT1R結(jié)合后通過(guò)激動(dòng)蛋白激酶C(PKC)活化各種信號(hào)通路[7，12-13]，促進(jìn)CFs增殖及膠原合成，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化。本研究表明，AngⅡ刺激心肌成纖維細(xì)胞，引起細(xì)胞發(fā)生增殖。

波形蛋白(vimetin)是存在于間質(zhì)起源細(xì)胞中，是中間絲的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞骨架，有支持細(xì)胞形態(tài)與活動(dòng)的作用，體外培養(yǎng)時(shí)CFs存在有波形蛋白，而α-SMA特異性地存在于血管平滑肌細(xì)胞。在生理狀態(tài)下，CFs并不表達(dá)收縮性標(biāo)志α-SMA。經(jīng)歷損傷后，部分CFs轉(zhuǎn)分化為心肌成纖維細(xì)胞，特征為表達(dá)收縮性標(biāo)志α-sMA和波形蛋白。α-SMA是成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，這種轉(zhuǎn)變?cè)谛募∈軗p后的心肌纖維化過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的血管緊張素Ⅱ作用于原代培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞后，其α-SMA熒光表達(dá)量逐漸增加，可見(jiàn)在血管緊張素Ⅱ刺激下，心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生了不同程度的轉(zhuǎn)分化。同時(shí)α-SMA蛋白表達(dá)量與正常組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同濃度AngⅡ刺激心肌成纖維細(xì)胞，CFs表現(xiàn)出增殖，轉(zhuǎn)分化改變，這將為后期研究中藥加參方對(duì)心衰保護(hù)作用的分子機(jī)制提供一定的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

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2017-03-21)

(本文編輯 王雅潔)

R329，2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.006

1672-1349(2017)21-2680-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81173410)，國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81503419)，國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81603466)，國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81603432)

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(鄭州 450000)；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)院

朱明軍，E-mail：zhumingjun317@163.com

信息：崔琳，王幼平，謝世陽(yáng)，等.血管緊張素Ⅱ?qū)υ囵B(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2680-2684.