外周血淋巴細胞維生素D受體表達與冠心病的相關(guān)性研究

艾思迪，丁 茹，賀治青，吳宗貴，梁 春

·臨床醫(yī)學(xué)論著·

外周血淋巴細胞維生素D受體表達與冠心病的相關(guān)性研究

艾思迪，丁 茹，賀治青，吳宗貴，梁 春

目的觀察冠心病病人外周血中淋巴細胞維生素D受體(VDR)表達的變化情況，并探討其在冠心病病人診治中的潛在價值。方法采用流式細胞術(shù)檢測50例冠心病病人及30名健康對照志愿者外周血淋巴細胞VDR的表達水平(平均熒光強度VDR-MFI)，同時收集相關(guān)資料并檢測血脂、空腹血糖、糖化血紅蛋白、維生素D等指標(biāo)。結(jié)果冠心病病人淋巴細胞的log10VDR-MFIs顯著低于健康對照人群(P=0.028)，且與糖化血紅蛋白呈負相關(guān)(r= -0.347，P=0.002)；多因素分析提示log10VDR-MFIs與冠心病獨立相關(guān)(OR=0.051，P=0.019)。結(jié)論與健康人群相比，冠心病病人淋巴細胞表面VDR表達顯著降低，且與糖化血紅蛋白水平呈負相關(guān)，外周血淋巴細胞表面VDR表達降低可能是冠心病的潛在危險因素。

冠心??；外周血；淋巴細胞；維生素D受體

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制尚未闡明，免疫應(yīng)答在動脈粥樣硬化的發(fā)展中起著重要作用[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)維生素D對免疫系統(tǒng)有干預(yù)作用，通過作用于T淋巴細胞相關(guān)的免疫反應(yīng)。維生素D生物活性形式1，25-二羥基維生素D3通過與特異性受體維生素D受體(VDR)結(jié)合而調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達，調(diào)節(jié)階梯免疫系統(tǒng)功能，目前已知VDR廣泛表達于T淋巴細胞、巨噬細胞、胸腺內(nèi)未成熟的淋巴細胞及成熟的CD8淋巴細胞，但其功能和臨床意義尚不清楚[2]。本研究旨在觀察冠心病病人與健康對照人群外周血中淋巴細胞VDR表達的差異，初步探討外周血淋巴細胞VDR表達在冠心病診治中的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年4月—12月本院心內(nèi)科首次住院病人80例，均行冠狀動脈造影檢查。根據(jù)冠狀動脈造影是否正常分組，冠心病組左主干、左前降支、左旋支、右冠狀動脈或其主要分支狹窄≥50%，共50例。健康對照組，冠狀動脈造影正?；蛐募?，共30例。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肌病、慢性心房纖顫、合并Ⅲ/Ⅳ級心功能不全(紐約心臟病學(xué)會分級)、過去6個月內(nèi)經(jīng)歷過再血管化治療；慢性腎功能不全[估算腎小球濾過率lt;90 mL/(min·1.73 m2)]、慢性肝病、腸道功能性和炎癥性疾病、與維生素D相關(guān)的代謝性疾病、嚴(yán)重感染、腫瘤、嗜酒以及3個月內(nèi)正在服用含維生素D制劑的藥物。

1.2 一般資料采集、生化指標(biāo)檢查及SYNTAX評分 采集所有病人高血壓病、糖尿病、吸煙等一般資料；于次日清晨空腹采集外周靜脈血，檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹血糖、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及25羥維生素D[25(OH)D]等；SYNTAX由兩名高年資冠狀動脈介入主任醫(yī)生明確冠狀動脈病變情況后，再由兩名介入醫(yī)師按SYNTAX評分要求將結(jié)果逐項輸入SYNTAX評分器(2.1版本)，計算SYNTAX分值。SYNTAX評分lt;22分為低SYNTAX評分組，SYNTAX評分≥22分位高SYNTAX評分組[3]。

1.3 淋巴細胞表面VDR檢測方法 取100 μL用肝素抗凝的全血，加入5 μL FcR阻斷抗體，孵育10 min，按照說明書后加入小鼠抗人CD45抗體(FITC； Beckton Dickinson)及小鼠抗人 VDR 抗體(Abcam)，冰上孵育10 min。用生理鹽水洗滌游離抗體后加入大鼠抗小鼠二抗(APC；Abcam)，孵育10 min，再經(jīng)過紅細胞裂解、洗滌、重懸后通過流式細胞檢測淋巴細胞表面VDR平均熒光強度(VDR-MFIs)。以CD45和SS分別為坐標(biāo)軸圈取淋巴細胞群[4]，檢測APC陽性信號的平均熒光強度。由于VDR-MFI原始數(shù)值分布偏態(tài)，故采用log10對原始數(shù)值進行轉(zhuǎn)化再進行后續(xù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 流式細胞檢測淋巴細胞VDR結(jié)果 流式細胞儀檢測淋巴細胞VDR的結(jié)果圖。圖1a：應(yīng)用CD45和SS建立直方圖，根據(jù)CD45和SS指標(biāo)特征，選擇淋巴細胞群進行分析。圖1b是對圖1a所選取的淋巴細胞檢測VDR受體，VDR+門內(nèi)的細胞為VDR陽性細胞，如圖1b所示，所有的淋巴細胞均為VDR陽性細胞。

圖1流式細胞檢測淋巴細胞VDR結(jié)果圖

2.2 兩組臨床資料比較 冠心病組患糖尿病比例大于對照組(P=0.001)，糖化血紅蛋白水平(Plt;0.001)及空腹血糖(P=0.004)也顯著高于對照組。兩組年齡、性別比例、吸煙比例及血脂水平無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表1。冠心病組log10VDR-MFIs顯著低于對照組(3.09±0.37 vs 3.26±0.30 P=0.028)，兩組25(OH)D水平無統(tǒng)計學(xué)意義。冠心病病人中高SYNTAX評分亞組的高血壓及糖尿病病人比例顯著高于低SYNTAX評分組(Plt;0.05)，空腹血糖、LDL-C及HbA1c水平均高于低SYNTAX評分組，兩組log10VDR-MFIs及25(OH)D水平無。詳見表2、圖2。

表1 兩組病人臨床資料比較

表2 冠心病各亞組病人臨床資料

圖2對照組與冠心病組log10VDR-MFIs及25(OH) D水平比較

2.3 相關(guān)性分析 各個臨床參數(shù)與log10VDR-MFIs的相關(guān)性，可見log10VDR-MFIs和HbA1c成顯著負相關(guān)(r=-0.347，P=0.002，見圖3)。除了HbA1c之外，其他的臨床參數(shù)如年齡、血脂、hs-CRP、25(OH)D、SYNTAX評分與log10VDR-MFIs無相關(guān)性。詳見表3。

表3 淋巴細胞log10VDR-MFIs與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

圖3 Log10VDR-MFIs與HbA1c之間相關(guān)性分析

2.4 單因素及多因素Logistic回歸分析 以有無冠心病為因變量，其他為自變量，進行Logistic回歸分析，單因素分析提示糖尿病、高水平HbA1c及l(fā)og10VDR-MFIs降低是冠心病的危險因素，多因素分析則提示log10VDR-MFIs降低是冠心病的獨立危險因素(OR=0.051，P=0.019)。以SYNTAX積分高低為因變量，其他為自變量，進行Logistic回歸分析，單因素分析提示高血壓、糖尿病、空腹血糖升高、LDL-C升高及糖化血紅蛋白升高為高SYNTAX評分的危險因素，多因素分析則提示高血壓是高SYNTAX積分的獨立危險因素。詳見表4、表5。

表4 單因素及多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)與冠心病發(fā)病相關(guān)的危險因素

表5 單因素及多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)與高SYNTAX積分相關(guān)的危險因素

3 討 論

冠心病是一種多危險因素激發(fā)的涉及慢性炎癥、免疫功能紊亂的代謝性疾病，近年來大量研究提示淋巴細胞參與冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展[5]。維生素D對免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，其相應(yīng)受體被報道廣泛存在于外周淋巴細胞、巨噬細胞及胸腺組織中[6- 7]。維生素D能夠抑制淋巴細胞釋放炎性細胞因子，如TNF、IL-1、IFN-γ及IL-2，并增加釋放抗炎細胞因子，如IL-4及IL-10，同時維生素D能夠抑制B淋巴細胞IgE的表達[8]。與全身低密度脂蛋白受體(LDLR)基因單敲除小鼠相比，全身VDR及LDLR雙敲除小鼠的主動脈處釋放更多的黏附分子及促炎因子，而且巨噬細胞有更多的膽固醇流入，導(dǎo)致主動脈斑塊形成加速[9]。沉默VDR后，T細胞的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活并誘導(dǎo)T細胞凋亡，激活VDR不僅能夠抑制T細胞的RAS并促進DNA修復(fù)[10]。因此，維生素D/VDR具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，并影響冠狀動脈粥樣硬化的病程進展。

在2型糖尿病病人中，頸動脈粥樣硬化與血漿25(OH) D水平降低相關(guān)[11]；2型糖尿病合并糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)病變等微血管并發(fā)癥病人25(OH) D水平顯著低于無微血管并發(fā)癥的2型糖尿病病人[12]。但本研究并未能發(fā)現(xiàn)冠心病病人外周血25(OH) D水平低于對照組。事實上，25(OH) D經(jīng)過腎臟由1α羥化酶轉(zhuǎn)化形成的1，25(OH) D是維生素D的活性形式，但由于1，25(OH) D的血漿濃度過低，不易測量，而且易于失活，故臨床上常用25(OH) D濃度反應(yīng)體內(nèi)維生素D水平[13-15]。因此低血漿濃度1，25(OH) D才是冠心病的高危因素，但目前無相關(guān)臨床研究。最近的實驗研究發(fā)現(xiàn)成纖維生長因子23(FGF23)能夠抑制腎臟的1α羥化酶表達，進而影響血漿1，25(OH) D濃度[16]。因此，血漿FGF23濃度升高也有可能是冠心病的高危因素，但仍需進一步研究。

本研究提示淋巴細胞表面VDR表達量與糖化血紅蛋白呈負相關(guān)，提示高糖狀態(tài)可能降低淋巴細胞VDR表達。目前沒有在體或離體實驗研究高糖環(huán)境或晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對淋巴細胞的VDR表達影響的研究。腹腔注射鏈霉素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠胰腺、肌肉及脂肪組織的VDR表達均顯著降低，但這項研究沒有討論組織的VDR表達與血糖及糖化血紅蛋白的相關(guān)性[17]，因此糖尿病環(huán)境與淋巴細胞VDR表達的相關(guān)性仍需要進一步研究[4]。

本研究表明冠心病病人淋巴細胞表明VDR表達顯著低于對照組，淋巴細胞表面VDR表達量與糖化血紅蛋白水平呈負相關(guān)，也是潛在的冠心病危險因素，但與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度無相關(guān)性，其具體聯(lián)系機制及臨床意義有待進一步研究證實。

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2017-07-12)

(本文編輯 王雅潔)

Correlation of Vitamin D Receptor Expression on Lymphocytes with Coronary Artery Disease

Ai Sidi，Ding Ru，He Zhiqing，Wu Zonggui，Liang Chun

Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Liang Chun

ObjectiveTo uncover the differential expression of vitamin D receptor (VDR) on lymphocyte in patients with coronary artery disease (CAD) compared that in healthy controls and to discuss its potential significance in treatment of CAD patients.MethodsThe mean fluorescence intensities of VDR (VDR-MFIs) on peripheral lymphocytes were measured in 50 patients with CAD and 30 healthy controls without CAD.Clinical information of all subjects involved was collected and the levels of plasma lipids，fasting glucose，haemoglobin A1c (HbA1c)，and vitamin D were measured.ResultsThe log10VDR-MFIsof patients with CAD were significantly lower than those of healthy controls (P=0.028).The log10VDR-MFIswas negatively correlated with HbA1c(r=-0.347，P=0.002).Multivariate logistic regression analysis suggested log10VDR-MFIswere indepently associated with CAD (OR=0.051，P=0.019).ConclusionThe expression of VDR on peripheral lymphocytes in patients with CAD was significantly lower than that in healthy controls，which was negatively correlated with HbA1c.Lower VDR expression on peripheral blood lymphocytes might be a potential risk factor of CAD.

coronary artery disease； peripheral blood； lymphocyte； vitamin D receptor

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.21.001

1672-1349(2017)21-2657-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.8151101216、91539118、 81473445、81400336和81503371)，上海市科委中醫(yī)引導(dǎo)性項目(No.15401931500)

上海長征醫(yī)院(上海 200003)

梁春，E-mail：chunliangliang@hotmail.com

信息：艾思迪，丁茹，賀治青，等.外周血淋巴細胞維生素D受體表達與冠心病的相關(guān)性研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(21)：2657-2660.