高原低氧環(huán)境下小鼠皮層神經(jīng)元自噬與凋亡的相關(guān)性研究

馬文科 戴舒惠 楊悅凡 羅鵬 費(fèi)舟

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

·論著·

高原低氧環(huán)境下小鼠皮層神經(jīng)元自噬與凋亡的相關(guān)性研究

馬文科 戴舒惠 楊悅凡 羅鵬 費(fèi)舟*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的觀察6000 m海拔高度下不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元自噬及凋亡的影響，探討其相關(guān)性。方法40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為平原對(duì)照組及不同時(shí)長(zhǎng)(1 d、3 d、7 d、14 d)的高原低氧處理組，每組8只。模擬6000 m海拔的高原低氧環(huán)境，實(shí)驗(yàn)組分別給予1 d、3 d、7 d、14 d的高原低氧處理，對(duì)照組飼養(yǎng)于艙外。采用Western Blot檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及自噬標(biāo)志物Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(LC3-II)在皮層組織的表達(dá)；赫斯特?zé)晒馊玖?3342(Hoechst 33342)染色用于觀察皮層神經(jīng)元的凋亡改變。結(jié)果與平原對(duì)照組相比，不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理增加了小鼠皮層組織HIF-1α、Beclin-1及LC3-II的表達(dá)，同時(shí)明顯增加了皮層神經(jīng)元的凋亡率。結(jié)論高原低氧環(huán)境下，自噬的激活可能是小鼠皮層神經(jīng)元凋亡發(fā)生的重要原因，而HIF-1α在該過(guò)程中可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

高原低氧; 神經(jīng)元; 自噬; 凋亡

中樞神經(jīng)系統(tǒng)耗氧量大、低氧耐受性差，在高原低氧環(huán)境下會(huì)首先出現(xiàn)不同程度的缺氧性損害，表現(xiàn)出高原性頭痛(high-altitude headache, HAH)、急性高山病(acute mountain sickness, AMS)和高原性腦水腫(high-altitude cerebral edema, HACE)等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。研究顯示高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元會(huì)發(fā)生凋亡、變性等損傷，提示高原性腦損害與神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)[1]。自噬是應(yīng)激條件下細(xì)胞利用溶酶體降解并重復(fù)利用自身細(xì)胞器、蛋白或清除損傷的細(xì)胞器及蛋白的代謝過(guò)程[2,3]。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的途徑，自噬可以分為微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)。有大量文獻(xiàn)報(bào)道，自噬(本文提到的自噬特指巨自噬)的激活可以減輕缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。但是，在高原低氧環(huán)境下，自噬在神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮的作用以及與高原低氧暴露時(shí)間之間的關(guān)系目前仍不清楚。

本研究利用低壓氧艙，模擬了6000 m海拔的高原低氧環(huán)境，旨在觀察不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠皮層組織低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)及自噬標(biāo)志物Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3- II, LC3-II)表達(dá)的影響，以及對(duì)皮層神經(jīng)元凋亡的影響，進(jìn)而了解高原低氧環(huán)境下自噬與凋亡之間的可能關(guān)系和相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制，為高原性腦損害分子病理機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性C57BL/6小鼠40只，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18～20 g。小鼠統(tǒng)一編號(hào)后，采用SPSS 19.0軟件產(chǎn)生的完全隨機(jī)數(shù)字分為平原對(duì)照組、高原低氧處理1 d、3 d、7 d及14 d組，每組8只。

二、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛；二喹啉甲酸(bicichoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京博奧森；凝膠電泳試劑盒購(gòu)于上海碧云天；化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于美國(guó)Advansta公司；小鼠抗HIF-1α、兔抗LC3購(gòu)于Sigma公司；兔抗Beclin-1、兔抗β-actin購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗鼠IgG購(gòu)于北京康為世紀(jì)；Hoechst 33342染色液購(gòu)于萬(wàn)類生物科技；低壓氧艙由第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防系提供。

三、建立高原低氧模型

本研究利用低壓氧艙模擬了6000 m海拔的高原環(huán)境，建立了高原低氧模型。6000 m海拔下低壓氧艙的相關(guān)參數(shù)：艙內(nèi)壓力47.2 kPa，艙內(nèi)溫度25.6 ℃，艙內(nèi)濕度為21.3%，12 h明暗交替光照，運(yùn)行時(shí)間24 h/d，降艙速度為5 m/s。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食水。各實(shí)驗(yàn)組小鼠置于低壓氧艙后給予相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理；對(duì)照組小鼠不作處理，置于艙外飼養(yǎng)(西安海拔約為400 m)。

四、組織樣本制備

各組小鼠出艙后，隨機(jī)選取4只，腹腔麻醉后開(kāi)胸，經(jīng)左心室用4%甲醛充分灌注固定，開(kāi)顱取腦后繼續(xù)用4%甲醛固定1 w。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，選取皮層組織連續(xù)切片，用于Hoechst 33342染色。各組剩余小鼠斷頭處死，冰上迅速分離皮層組織，-80 ℃保存，用于后續(xù)Western Blot實(shí)驗(yàn)。

五、Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

根據(jù)皮層組織塊大小加入適當(dāng)體積的細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上充分研磨裂解后12 000 r/min離心40 min，取上清進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，并制備成Western Blot蛋白樣品。常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜90 min，小鼠抗HIF-1α一抗(1∶4000)、兔抗Beclin-1一抗(1∶2000)、兔抗LC3一抗(1∶2000)、兔抗β-actin一抗(1∶5000)，山羊抗小鼠、抗兔二抗(1∶20 000)，化學(xué)發(fā)光后用掃描儀采集電子圖像信息，測(cè)量灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

六、Hoechst 33342染色

切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌后，Hoechst 33342常溫避光染色7 min，PBS洗滌，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察皮層神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)學(xué)及染色改變，致密濃染或碎塊狀致密濃染的神經(jīng)元為Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞相對(duì)數(shù)目，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

七、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠皮層組織自噬標(biāo)志物表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，與平原對(duì)照組相比，不同時(shí)長(zhǎng)(1 d、3 d、7 d、14 d)的高原低氧處理均明顯上調(diào)了小鼠皮層組織Beclin-1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。同時(shí)，LC3-II也在不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理后表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

二、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠皮層組織HIF-1α表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，與平原對(duì)照組相比，小鼠皮層組織HIF-1α在高原低氧暴露1 d、3 d、7 d、14 d后表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。HIF-1α在高原低氧暴露1 d后表達(dá)即達(dá)到高峰，后呈持續(xù)性高表達(dá)。

圖1 高原低氧環(huán)境上調(diào)了小鼠皮層組織Beclin-1和LC3-II表達(dá)
Fig 1 High-altitude hypoxia exposure for different duration (1 d, 3 d, 7 d and 14 d) up-regulated the expression of Bcelin-1 and LC3-II in mouse cortex
A: Quantity of Bcelin-1 was detected by Western Blot (aPlt;0.01,bPlt;0.001,vscontrol group); B: Quantity of LC3-II was detected by Western Blot (aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group).

Note: HH stands for high-altitude hypoxia exposure, and the number behind HH stands for high-altitude hypoxia exposure time.

圖2 高原低氧環(huán)境上調(diào)了小鼠皮層組織HIF-1α的表達(dá)
Fig 2 High-altitude hypoxia exposure up-regulated the expression of HIF-1α in mouse cortex
A: Western Bot analysis of HIF-1α after high-altitude hypoxia exposure for 1 d, 3 d, 7 d and 14 d; B: Quantification of band densities showed that high-altitude hypoxia exposure for different duration (1 d, 3 d, 7 d, and 14 d) was significantly increased the expression of HIF-1α.

aPlt;0.05,vscontrol group.

圖3 高原低氧暴露增加了小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率(Hoechst, ×200)
Fig 3 High-altitude hypoxia exposure increased neuronal apoptosis rates in mouse cortex (Hoechst, ×200)

A～E: Hoechst 33342 staining results after high-altitude hypoxia exposure for 1 d, 3 d, 7 d and 14 d in mouse cortex; F: Neuronal apoptosis rates was significantly increased after high-altitude hypoxia exposure.

aPlt;0.001,vscontrol group.

Bar=50 μm.

三、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響

Hoechst 33342染色顯示，對(duì)照組小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)及染色基本正常，而不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理組Hoechst陽(yáng)性的神經(jīng)元，即凋亡的神經(jīng)元明顯增多(圖3A～E)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理后小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3F)。

討 論

高原環(huán)境空氣稀薄、氧分壓低。進(jìn)入高原地區(qū)時(shí)，人體首先可以通過(guò)加快呼吸、心率等方式代償大氣環(huán)境低氧造成的組織供氧不足。然而，當(dāng)代償機(jī)制仍無(wú)法滿足機(jī)體氧需求時(shí)，由于腦組織對(duì)氧極為敏感，便會(huì)出現(xiàn)高原性腦損害。

高原低氧環(huán)境下腦損害發(fā)生的相關(guān)機(jī)制有[6]：ATP合成減少導(dǎo)致鈉鉀ATP酶活性降低，從而使細(xì)胞內(nèi)水鈉潴留，引起腦細(xì)胞水腫；自由基的過(guò)度釋放及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)增多破壞了血管基膜的完整性，導(dǎo)致血管通透性增加，加重了腦水腫；血管內(nèi)皮細(xì)胞NO釋放的增加導(dǎo)致其對(duì)Ca2+的敏感性下降，從而使腦血管舒張、灌注壓升高。也有研究顯示高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)凋亡、變性等損傷[1,7]，提示高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元的損傷是高原性腦損害發(fā)生的重要因素，但具體的損傷機(jī)制目前仍不清楚。此外，有大量研究發(fā)現(xiàn)，自噬在缺血缺氧條件下發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，提示自噬可能是影響低氧條件下神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸的重要因素[4-5]。然而，在高原低氧這種特殊環(huán)境下，自噬的激活與神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸是否相關(guān)，目前仍無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究利用低壓氧艙模擬了6000 m海拔的高原低氧環(huán)境，初步闡明了不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元自噬的影響，證實(shí)了高原低氧環(huán)境下小鼠皮層神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，探討了該環(huán)境下自噬在神經(jīng)元凋亡中的可能作用及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

首先，我們通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察了不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理對(duì)皮層神經(jīng)元自噬的影響。Beclin-1是自噬上游分子，在自噬的啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以作為自噬的標(biāo)志蛋白[8]。LC3-II與自噬體膜延長(zhǎng)、閉合及自噬小體的形成有密切關(guān)系，是自噬的另一標(biāo)志性分子[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與平原對(duì)照組相比，小鼠皮層組織Beclin-1及LC3-II分別經(jīng)過(guò)1 d、3 d、7 d、14 d的高原低氧處理后均呈持續(xù)性高表達(dá)，提示高原低氧環(huán)境可大量激活皮層神經(jīng)元自噬的發(fā)生，且呈時(shí)間非依賴性。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，作為調(diào)控機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子，HIF-1α在不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理后也表現(xiàn)為持續(xù)性高表達(dá)，提示6000 m海拔的高原低氧環(huán)境可明顯降低小鼠皮層組織的氧含量，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1α的激活。已有文獻(xiàn)報(bào)道，HIF-1α可以調(diào)控低氧條件下自噬的發(fā)生[10-11]，所以我們推測(cè)HIF-1α也可能是高原低氧環(huán)境下自噬激活重要的調(diào)控分子。

Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的親DNA熒光燃料，常用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。通過(guò)該染色，我們發(fā)現(xiàn)不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理也明顯增加了小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率，提示高原低氧環(huán)境可以引起神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，與Maiti等的研究結(jié)果一致[1,12]。

至此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理可明顯上調(diào)氧敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1α的表達(dá)，激活自噬的發(fā)生，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡。所以我們推測(cè)，高原低氧環(huán)境下自噬的大量激活加重了皮層神經(jīng)元的損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡，是高原性腦損害發(fā)生的重要分子病理機(jī)制，而HIF-1α在該過(guò)程中發(fā)揮了自噬激活調(diào)控的重要作用。然而，在高原低氧環(huán)境下，自噬在神經(jīng)元損傷中的確切作用及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制仍不明確，有待進(jìn)一步研究。

1ZHOU B, LI M, CAO X, et al. Phenylethanoid glycosides of Pedicularis muscicola Maxim ameliorate high altitude-induced memory impairment [J/OL]. Physiol Behav, 2016, 157: 39-46. doi: 10.1016/j.physbeh.2016.01.037.

2CHEN G, KE Z, XU M, et al. Autophagy is a protective response to ethanol neurotoxicity [J]. Autophagy, 2014,8(11): 1577-1589.

3丁培炎, 王冬, 赫曼, 等. 短期禁食誘導(dǎo)自噬對(duì)大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2013,12(3): 201-204.

4WANG P, GUAN Y F, DU H, et al. Induction of autophagy contributes to the neuroprotection of nicotinamide phosphoribosyltransferase in cerebral ischemia [J]. Autophagy, 2012, 8(1): 77-87.

5BAI X, LIU S, YUAN L, et al. Hydrogen-rich saline mediates neuroprotection through the regulation of endoplasmic reticulum stress and autophagy under hypoxia-ischemia neonatal brain injury in mice [J/OL]. Brain Res, 2016, 1646: 410-417. doi: 10.1016/j.brainres. 2016. 06.020.

6WILSON M H, WRIGHT A, IMRAY C H. Intracranial pressure at altitude [J]. High Alt Med Biol, 2014, 15(2): 123-132.

7CHEN S J, YANG J F, KONG F P, et al. Overactivation of corticotropin-releasing factor receptor type 1 and aquaporin-4 by hypoxia induces cerebral edema [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(36): 13199-13204.

8KANG R, ZEH H J, LOTZE M T, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J]. Cell Death Differ, 2011, 18(4): 571-580.

9ASHRAFI G, SCHWARZ T. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria [J]. Cell Death Differ, 2013, 20(1): 31-42.

10GUI L, LIU B, LV G. Hypoxia induces autophagy in cardiomyocytes via a hypoxia-inducible factor 1-dependent mechanism [J]. Exp Ther Med, 2016, 11(6): 2233-2239.

11WU J, LEI Z, YU J. Hypoxia induces autophagy in human vascular endothelial cells in a hypoxia-inducible factor 1dependent manner [J]. Mol Med Rep, 2015, 11(4): 2677-2682.

12MAITI P, SINGH S B, MALLICK B, et al. High altitude memory impairment is due to neuronal apoptosis in hippocampus, cortex and striatum [J]. J Chem Neuroanat, 2008, 36(3-4): 227-238.

Correlationbetweenneuronalautophagyandapoptosisinmousecortexafterhigh-altitudehypoxiatreatment

MAWenke,DAIShuhui,YANGYuefan,LUOPeng,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveEffect of high-altitude (6000 m) hypoxia exposure for different duration on neuronal autophagy and apoptosis in mouse cortex was investigated, and the correlation between them was discussed.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly divided into five groups: control group, and 1 d, 3 d, 7 d, 14 d high-altitude hypoxia exposure groups. High-altitude hypoxia circumstances (6000 m) was mimicked by hypobaric oxygen chamber. Then all the experimental groups were subjected to high-altitude hypoxia treatment for different durations, whereas the control group was kept only outside the chamber. Expressions of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and autophagy marker proteins-Bcelin-1 and microtubule-associated protein 1 light 3-II (LC3-II) were detected by Western Blot. Hoechst 33342 staining was used to observe the neuronal apoptosis in mouse cortex.ResultsCompared with control group, the expressions of HIF-1α, Beclin-1 and LC3-II were significantly increased after high-altitude hypoxia exposure for different time. Meanwhile, neuronal apoptosis rates in mouse cortex were also increased after high-altitude hypoxia treatment.ConclusionActivation of autophagy may lead to neuronal apoptosis in mouse cortex after high-altitude hypoxia exposure and HIF-1α may play a regulatory role in this process.

High-altitude hypoxia; Neurons; Autophagy; Apoptosis

1671-2897(2017)16-317-04

R 651

A

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助項(xiàng)目(81430043)

馬文科，碩士研究生，E-mail: mwkcqmu@163.com

*通訊作者：費(fèi)舟，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail:feizhou@fmmu.edu.cn

2016-08-16；

2016-10-19)