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    高原低氧環(huán)境下小鼠皮層神經(jīng)元自噬與凋亡的相關(guān)性研究

    2017-11-27 02:44:18馬文科戴舒惠楊悅凡羅鵬費(fèi)舟
    關(guān)鍵詞:皮層低氧高原

    馬文科 戴舒惠 楊悅凡 羅鵬 費(fèi)舟

    (第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710032)

    ·論著·

    高原低氧環(huán)境下小鼠皮層神經(jīng)元自噬與凋亡的相關(guān)性研究

    馬文科 戴舒惠 楊悅凡 羅鵬 費(fèi)舟*

    (第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710032)

    目的觀察6000 m海拔高度下不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元自噬及凋亡的影響,探討其相關(guān)性。方法40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為平原對(duì)照組及不同時(shí)長(zhǎng)(1 d、3 d、7 d、14 d)的高原低氧處理組,每組8只。模擬6000 m海拔的高原低氧環(huán)境,實(shí)驗(yàn)組分別給予1 d、3 d、7 d、14 d的高原低氧處理,對(duì)照組飼養(yǎng)于艙外。采用Western Blot檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及自噬標(biāo)志物Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(LC3-II)在皮層組織的表達(dá);赫斯特?zé)晒馊玖?3342(Hoechst 33342)染色用于觀察皮層神經(jīng)元的凋亡改變。結(jié)果與平原對(duì)照組相比,不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理增加了小鼠皮層組織HIF-1α、Beclin-1及LC3-II的表達(dá),同時(shí)明顯增加了皮層神經(jīng)元的凋亡率。結(jié)論高原低氧環(huán)境下,自噬的激活可能是小鼠皮層神經(jīng)元凋亡發(fā)生的重要原因,而HIF-1α在該過(guò)程中可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

    高原低氧; 神經(jīng)元; 自噬; 凋亡

    中樞神經(jīng)系統(tǒng)耗氧量大、低氧耐受性差,在高原低氧環(huán)境下會(huì)首先出現(xiàn)不同程度的缺氧性損害,表現(xiàn)出高原性頭痛(high-altitude headache, HAH)、急性高山病(acute mountain sickness, AMS)和高原性腦水腫(high-altitude cerebral edema, HACE)等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。研究顯示高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元會(huì)發(fā)生凋亡、變性等損傷,提示高原性腦損害與神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)[1]。自噬是應(yīng)激條件下細(xì)胞利用溶酶體降解并重復(fù)利用自身細(xì)胞器、蛋白或清除損傷的細(xì)胞器及蛋白的代謝過(guò)程[2,3]。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的途徑,自噬可以分為微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)。有大量文獻(xiàn)報(bào)道,自噬(本文提到的自噬特指巨自噬)的激活可以減輕缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。但是,在高原低氧環(huán)境下,自噬在神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮的作用以及與高原低氧暴露時(shí)間之間的關(guān)系目前仍不清楚。

    本研究利用低壓氧艙,模擬了6000 m海拔的高原低氧環(huán)境,旨在觀察不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠皮層組織低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)及自噬標(biāo)志物Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II(microtubule-associated protein 1 light chain 3- II, LC3-II)表達(dá)的影響,以及對(duì)皮層神經(jīng)元凋亡的影響,進(jìn)而了解高原低氧環(huán)境下自噬與凋亡之間的可能關(guān)系和相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制,為高原性腦損害分子病理機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

    材料與方法

    一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    健康雄性C57BL/6小鼠40只,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重18~20 g。小鼠統(tǒng)一編號(hào)后,采用SPSS 19.0軟件產(chǎn)生的完全隨機(jī)數(shù)字分為平原對(duì)照組、高原低氧處理1 d、3 d、7 d及14 d組,每組8只。

    二、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

    細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛;二喹啉甲酸(bicichoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京博奧森;凝膠電泳試劑盒購(gòu)于上海碧云天;化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于美國(guó)Advansta公司;小鼠抗HIF-1α、兔抗LC3購(gòu)于Sigma公司;兔抗Beclin-1、兔抗β-actin購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗鼠IgG購(gòu)于北京康為世紀(jì);Hoechst 33342染色液購(gòu)于萬(wàn)類生物科技;低壓氧艙由第四軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防系提供。

    三、建立高原低氧模型

    本研究利用低壓氧艙模擬了6000 m海拔的高原環(huán)境,建立了高原低氧模型。6000 m海拔下低壓氧艙的相關(guān)參數(shù):艙內(nèi)壓力47.2 kPa,艙內(nèi)溫度25.6 ℃,艙內(nèi)濕度為21.3%,12 h明暗交替光照,運(yùn)行時(shí)間24 h/d,降艙速度為5 m/s。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食水。各實(shí)驗(yàn)組小鼠置于低壓氧艙后給予相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理;對(duì)照組小鼠不作處理,置于艙外飼養(yǎng)(西安海拔約為400 m)。

    四、組織樣本制備

    各組小鼠出艙后,隨機(jī)選取4只,腹腔麻醉后開(kāi)胸,經(jīng)左心室用4%甲醛充分灌注固定,開(kāi)顱取腦后繼續(xù)用4%甲醛固定1 w。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋,選取皮層組織連續(xù)切片,用于Hoechst 33342染色。各組剩余小鼠斷頭處死,冰上迅速分離皮層組織,-80 ℃保存,用于后續(xù)Western Blot實(shí)驗(yàn)。

    五、Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

    根據(jù)皮層組織塊大小加入適當(dāng)體積的細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑,冰上充分研磨裂解后12 000 r/min離心40 min,取上清進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),并制備成Western Blot蛋白樣品。常規(guī)電泳,轉(zhuǎn)膜90 min,小鼠抗HIF-1α一抗(1∶4000)、兔抗Beclin-1一抗(1∶2000)、兔抗LC3一抗(1∶2000)、兔抗β-actin一抗(1∶5000),山羊抗小鼠、抗兔二抗(1∶20 000),化學(xué)發(fā)光后用掃描儀采集電子圖像信息,測(cè)量灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    六、Hoechst 33342染色

    切片常規(guī)脫蠟至水,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌后,Hoechst 33342常溫避光染色7 min,PBS洗滌,甘油封片。熒光顯微鏡下觀察皮層神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)學(xué)及染色改變,致密濃染或碎塊狀致密濃染的神經(jīng)元為Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞相對(duì)數(shù)目,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    七、統(tǒng)計(jì)分析

    結(jié) 果

    一、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠皮層組織自噬標(biāo)志物表達(dá)的影響

    Western Blot結(jié)果顯示,與平原對(duì)照組相比,不同時(shí)長(zhǎng)(1 d、3 d、7 d、14 d)的高原低氧處理均明顯上調(diào)了小鼠皮層組織Beclin-1的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。同時(shí),LC3-II也在不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理后表達(dá)明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。

    二、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠皮層組織HIF-1α表達(dá)的影響

    Western Blot結(jié)果顯示,與平原對(duì)照組相比,小鼠皮層組織HIF-1α在高原低氧暴露1 d、3 d、7 d、14 d后表達(dá)均明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。HIF-1α在高原低氧暴露1 d后表達(dá)即達(dá)到高峰,后呈持續(xù)性高表達(dá)。

    圖1 高原低氧環(huán)境上調(diào)了小鼠皮層組織Beclin-1和LC3-II表達(dá)
    Fig 1 High-altitude hypoxia exposure for different duration (1 d, 3 d, 7 d and 14 d) up-regulated the expression of Bcelin-1 and LC3-II in mouse cortex
    A: Quantity of Bcelin-1 was detected by Western Blot (aPlt;0.01,bPlt;0.001,vscontrol group); B: Quantity of LC3-II was detected by Western Blot (aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group).

    Note: HH stands for high-altitude hypoxia exposure, and the number behind HH stands for high-altitude hypoxia exposure time.

    圖2 高原低氧環(huán)境上調(diào)了小鼠皮層組織HIF-1α的表達(dá)
    Fig 2 High-altitude hypoxia exposure up-regulated the expression of HIF-1α in mouse cortex
    A: Western Bot analysis of HIF-1α after high-altitude hypoxia exposure for 1 d, 3 d, 7 d and 14 d; B: Quantification of band densities showed that high-altitude hypoxia exposure for different duration (1 d, 3 d, 7 d, and 14 d) was significantly increased the expression of HIF-1α.

    aPlt;0.05,vscontrol group.

    圖3 高原低氧暴露增加了小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率(Hoechst, ×200)
    Fig 3 High-altitude hypoxia exposure increased neuronal apoptosis rates in mouse cortex (Hoechst, ×200)

    A~E: Hoechst 33342 staining results after high-altitude hypoxia exposure for 1 d, 3 d, 7 d and 14 d in mouse cortex; F: Neuronal apoptosis rates was significantly increased after high-altitude hypoxia exposure.

    aPlt;0.001,vscontrol group.

    Bar=50 μm.

    三、高原低氧環(huán)境對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響

    Hoechst 33342染色顯示,對(duì)照組小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)及染色基本正常,而不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理組Hoechst陽(yáng)性的神經(jīng)元,即凋亡的神經(jīng)元明顯增多(圖3A~E)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理后小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3F)。

    討 論

    高原環(huán)境空氣稀薄、氧分壓低。進(jìn)入高原地區(qū)時(shí),人體首先可以通過(guò)加快呼吸、心率等方式代償大氣環(huán)境低氧造成的組織供氧不足。然而,當(dāng)代償機(jī)制仍無(wú)法滿足機(jī)體氧需求時(shí),由于腦組織對(duì)氧極為敏感,便會(huì)出現(xiàn)高原性腦損害。

    高原低氧環(huán)境下腦損害發(fā)生的相關(guān)機(jī)制有[6]:ATP合成減少導(dǎo)致鈉鉀ATP酶活性降低,從而使細(xì)胞內(nèi)水鈉潴留,引起腦細(xì)胞水腫;自由基的過(guò)度釋放及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)增多破壞了血管基膜的完整性,導(dǎo)致血管通透性增加,加重了腦水腫;血管內(nèi)皮細(xì)胞NO釋放的增加導(dǎo)致其對(duì)Ca2+的敏感性下降,從而使腦血管舒張、灌注壓升高。也有研究顯示高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)凋亡、變性等損傷[1,7],提示高原低氧環(huán)境下神經(jīng)元的損傷是高原性腦損害發(fā)生的重要因素,但具體的損傷機(jī)制目前仍不清楚。此外,有大量研究發(fā)現(xiàn),自噬在缺血缺氧條件下發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用,提示自噬可能是影響低氧條件下神經(jīng)元轉(zhuǎn)歸的重要因素[4-5]。然而,在高原低氧這種特殊環(huán)境下,自噬的激活與神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸是否相關(guān),目前仍無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

    本研究利用低壓氧艙模擬了6000 m海拔的高原低氧環(huán)境,初步闡明了不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧暴露對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元自噬的影響,證實(shí)了高原低氧環(huán)境下小鼠皮層神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,探討了該環(huán)境下自噬在神經(jīng)元凋亡中的可能作用及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

    首先,我們通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察了不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理對(duì)皮層神經(jīng)元自噬的影響。Beclin-1是自噬上游分子,在自噬的啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,可以作為自噬的標(biāo)志蛋白[8]。LC3-II與自噬體膜延長(zhǎng)、閉合及自噬小體的形成有密切關(guān)系,是自噬的另一標(biāo)志性分子[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與平原對(duì)照組相比,小鼠皮層組織Beclin-1及LC3-II分別經(jīng)過(guò)1 d、3 d、7 d、14 d的高原低氧處理后均呈持續(xù)性高表達(dá),提示高原低氧環(huán)境可大量激活皮層神經(jīng)元自噬的發(fā)生,且呈時(shí)間非依賴性。

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),作為調(diào)控機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子,HIF-1α在不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理后也表現(xiàn)為持續(xù)性高表達(dá),提示6000 m海拔的高原低氧環(huán)境可明顯降低小鼠皮層組織的氧含量,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1α的激活。已有文獻(xiàn)報(bào)道,HIF-1α可以調(diào)控低氧條件下自噬的發(fā)生[10-11],所以我們推測(cè)HIF-1α也可能是高原低氧環(huán)境下自噬激活重要的調(diào)控分子。

    Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的親DNA熒光燃料,常用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。通過(guò)該染色,我們發(fā)現(xiàn)不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理也明顯增加了小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡率,提示高原低氧環(huán)境可以引起神經(jīng)元凋亡的發(fā)生,與Maiti等的研究結(jié)果一致[1,12]。

    至此,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同時(shí)長(zhǎng)的高原低氧處理可明顯上調(diào)氧敏感的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1α的表達(dá),激活自噬的發(fā)生,導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡。所以我們推測(cè),高原低氧環(huán)境下自噬的大量激活加重了皮層神經(jīng)元的損傷,最終導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡,是高原性腦損害發(fā)生的重要分子病理機(jī)制,而HIF-1α在該過(guò)程中發(fā)揮了自噬激活調(diào)控的重要作用。然而,在高原低氧環(huán)境下,自噬在神經(jīng)元損傷中的確切作用及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制仍不明確,有待進(jìn)一步研究。

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    Correlationbetweenneuronalautophagyandapoptosisinmousecortexafterhigh-altitudehypoxiatreatment

    MAWenke,DAIShuhui,YANGYuefan,LUOPeng,FEIZhou

    DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

    ObjectiveEffect of high-altitude (6000 m) hypoxia exposure for different duration on neuronal autophagy and apoptosis in mouse cortex was investigated, and the correlation between them was discussed.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly divided into five groups: control group, and 1 d, 3 d, 7 d, 14 d high-altitude hypoxia exposure groups. High-altitude hypoxia circumstances (6000 m) was mimicked by hypobaric oxygen chamber. Then all the experimental groups were subjected to high-altitude hypoxia treatment for different durations, whereas the control group was kept only outside the chamber. Expressions of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and autophagy marker proteins-Bcelin-1 and microtubule-associated protein 1 light 3-II (LC3-II) were detected by Western Blot. Hoechst 33342 staining was used to observe the neuronal apoptosis in mouse cortex.ResultsCompared with control group, the expressions of HIF-1α, Beclin-1 and LC3-II were significantly increased after high-altitude hypoxia exposure for different time. Meanwhile, neuronal apoptosis rates in mouse cortex were also increased after high-altitude hypoxia treatment.ConclusionActivation of autophagy may lead to neuronal apoptosis in mouse cortex after high-altitude hypoxia exposure and HIF-1α may play a regulatory role in this process.

    High-altitude hypoxia; Neurons; Autophagy; Apoptosis

    1671-2897(2017)16-317-04

    R 651

    A

    國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助項(xiàng)目(81430043)

    馬文科,碩士研究生,E-mail: mwkcqmu@163.com

    *通訊作者:費(fèi)舟,教授、主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,E-mail:feizhou@fmmu.edu.cn

    2016-08-16;

    2016-10-19)

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