益生菌干酪乳桿菌FM10-3生物學(xué)與發(fā)酵特性分析

王 英， 周劍忠， 仇小妹， 劉小莉， 馬艷弘， 黃開紅

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014)

益生菌是當(dāng)攝入一定量時能對宿主健康有作用的微生物活體。Schrezenmier等對益生菌定義作了更具體修訂，將益生菌定義為含有足夠數(shù)量活菌、組成明確的微生物制劑或產(chǎn)品，能通過定植作用改變宿主某一部位菌群組成，從而產(chǎn)生有利于宿主健康作用的微生物［1］。

干酪乳桿菌作為益生菌的一種，能夠耐受有機體的防御機制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小腸的膽汁酸等。所以干酪乳桿菌進入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活，起到調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進人體消化吸收等作用［2-3］。同時，干酪乳桿菌具有高效降血壓、降膽固醇，促進細胞分裂，產(chǎn)生抗體免疫，增強人體免疫及預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長等功能［4-5］;還具有緩解乳糖不耐癥、過敏等益生保健作用。近年來，由于干酪乳桿菌對其宿主營養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效，越來越成為人們關(guān)注的焦點。隨著高血壓人群的增加，對干酪乳桿菌的研究以及用其開發(fā)功能性乳制品具有重要意義。

FM10-3分離自新疆地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA同源性分析FM10-3被鑒定為干酪乳桿菌［6］。本試驗對FM10-3作為發(fā)酵劑菌種的一些生長及發(fā)酵特性進行測定，為利用該菌種開發(fā)功能性乳制品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)FM10-3，本實驗室篩選保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基按文獻［7］的方法配制，121℃滅菌20 min。10%脫脂牛奶，巴氏滅菌。

1.1.3 儀器 主要儀器有恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、NDJ-8S型黏度計、UV-1600PC型分光光度計、超凈工作臺、電熱手提式高壓殺菌鍋、酸度計和電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 干酪乳桿菌的活化與擴大培養(yǎng) 將菌種的凍干粉分別接種到10%滅菌脫脂牛奶管和液體MRS培養(yǎng)基試管中，于37℃培養(yǎng)24 h，傳代2次。按3%的接種量分別接種到裝有10%無菌脫脂牛奶三角瓶和裝有液體MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)24 h，置冰箱中備用。

1.2.2 菌株生長特性研究

1.2.2.1 生長曲線的測定 把對數(shù)生長期的菌液以3%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)。每隔3 h取樣，用UV-1600PC型分光光度計測定λ=600 nm處的吸光值。以空白培養(yǎng)基作為對照，測定生長曲線。

1.2.2.2 最佳生長pH值的測定 分別將MRS液體培養(yǎng)基調(diào)到不同的pH值，把培養(yǎng)到對數(shù)生長期的菌液以3%的接種量接種于其中，培養(yǎng)24 h后取樣。以不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基作為對照，用UV-1600PC型分光光度計測定 λ=600 nm處的吸光值，確定菌株生長的最佳pH值。

1.2.2.3 最佳生長溫度的測定 將菌株在不同的溫度下培養(yǎng)，以同溫下不接種的空白培養(yǎng)基作為對照，培養(yǎng)24 h后取樣測定λ=600 nm處的吸光值，確定菌株生長的最佳溫度。

1.2.2.4 菌株耐鹽性測定 將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的菌液以3%的接種量分別接種于食鹽添加質(zhì)量分數(shù)為0～7% 的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后取樣。用UV-1600PC型分光光度計在 λ=600 nm處測定吸光值，測定菌株耐鹽性。

1.2.3 干酪乳桿菌FM10-3發(fā)酵特性的研究［8-9］按3%的接種量將菌液接種到裝有10%脫脂乳的三角瓶中，混勻后于37 ℃培養(yǎng)，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h 和 24 h 取樣測定其 pH 值、滴定酸度、黏度、菌落總數(shù)等指標(biāo)(平行試驗重復(fù)3次)，并將培養(yǎng)24 h的發(fā)酵乳樣放入4℃冰箱中冷藏保存，于 0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d、28 d時分別取樣測定上述指標(biāo)。

1.2.3.1 pH值的測定 取待測酸乳樣品，用上海雷磁ZD-2型自動電位滴定儀測定pH值。

1.2.3.2 滴定酸度的測定 取待測酸乳樣品，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液測定滴定酸度。

1.2.3.3 黏度的測定 取酸乳樣品用NDJ-8S型數(shù)顯黏度計測定黏度。

1.2.3.4 活菌數(shù)測定 將發(fā)酵乳樣用滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，分別為 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－77 個梯度，取后 3 個梯度。采用平板傾注法制備MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計菌落總數(shù)，測定干酪乳桿菌活菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 FM10-3菌株的生長特性測定

2.1.1 FM10-3菌株的生長曲線 圖1是菌株FM10-3生長36 h的OD600值變化曲線。從圖1中可以看出，F(xiàn)M10-3培養(yǎng)24 h后即進入穩(wěn)定期。

圖1 干酪乳桿菌FM10-3菌液OD600值隨培養(yǎng)時間變化曲線Fig.1 Changes in OD600value of Lactobacillus casei FM10-3 suspension with culture time

2.1.2 FM10-3菌株的最適生長溫度 由圖2可以看出，F(xiàn)M10-3菌株可以在較寬的溫度范圍內(nèi)生長，其最適生長溫度在36℃左右，最高生長溫度度為45℃，最低生長溫度為20℃。

圖2 溫度對干酪乳桿菌FM10-3生長的影響Fig.2 The effects of temperature on the growth of Lactobacillus casei FM10-3

2.1.3 FM10-3菌株最適生長pH值 由圖3可以看出，F(xiàn)M10-3的生長pH值范圍偏酸性，其最適生長pH值在6左右。

圖3 不同pH值對干酪乳桿菌FM10-3生長的影響Fig.3 The effects of pH values on the growth of Lactobacillus casei FM10-3

2.1.4 FM10-3菌株的耐鹽性能 滲透壓對微生物的生長有很大影響，較高滲透壓會使微生物產(chǎn)生質(zhì)壁分離繼而死亡，因此耐鹽能力也是評價益生菌的重要特性之一。由圖4可知，3%NaCl對FM10-3的生長幾乎沒有影響，當(dāng)NaCl濃度達到7%時，F(xiàn)M10-3還能生長，但生長速度受到很大影響。由此可以看出，F(xiàn)M10-3可在人體內(nèi)生存。

圖4 不同NaCl含量對干酪乳桿菌FM10-3生長的影響Fig.4 The effects of different contents of NaCl on the growth of Lactobacillus casei FM10-3

2.2 FM10-3菌株的發(fā)酵特性測定

2.2.1 FM10-3酸奶發(fā)酵過程中pH值及滴定酸度變化 使用乳酸菌發(fā)酵劑的最重要的目的是通過乳酸菌代謝把乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，使牛奶的pH值下降，同時結(jié)合凝乳酶的共同作用，使牛奶變酸和凝固，并產(chǎn)生特定的風(fēng)味，同時可防止雜菌污染。對于干酪乳桿菌FM10-3在復(fù)原脫脂乳中發(fā)酵的酸度變化進行測定，對其產(chǎn)酸能力進行評價。由圖5可以看出，在發(fā)酵初期，pH值下降的速度較慢，當(dāng)發(fā)酵進行到10 h時，pH值下降的速度很快，并且相應(yīng)的滴定酸度也迅速升高，15 h時開始凝乳，18 h時pH值達到了4.5，滴定酸度81.6°T?？梢姡衫胰闂U菌FM10-3具有較好的乳品發(fā)酵性能。

圖5 干酪乳桿菌FM10-3發(fā)酵期pH值和滴定酸度的變化Fig.5 The changes of pH value and titratable acidity of Lactobacillus casei FM10-3 during fermentation

2.2.2 FM10-3酸奶發(fā)酵及儲存過程中滴定酸度和黏度的變化 由圖6 A可以看出，發(fā)酵開始時發(fā)酵乳黏度增加很小，pH值也沒有很大變化。15 h時黏度開始增大，酪蛋白膠粒開始凝集;18 h時，發(fā)酵乳黏度顯著增大，與發(fā)酵過程中滴定酸度值的變化呈現(xiàn)正相關(guān)。這主要是因為乳酸菌生長進入了對數(shù)期，利用大量乳糖發(fā)酵分解成乳酸，破壞了酪蛋白的水化層和電荷層，酪蛋白失去穩(wěn)定性，酪蛋白粒子發(fā)生凝集，酪蛋白分子團變大，黏度不斷增大。發(fā)酵后期，黏度變化趨于平緩，這是因為酪蛋白粒子已經(jīng)基本凝集完全，形成較大的酪蛋白分子團。儲藏期的滴定酸度和黏度變化見圖6B，由圖6B可以看出，在酸奶的儲藏前期，隨著時間的延長，酸奶的黏度呈現(xiàn)上升的趨勢，后期呈現(xiàn)下降的趨勢;在整個儲藏期，酸奶的滴定酸度隨著時間的延長呈現(xiàn)增加的趨勢。

圖6 發(fā)酵(A)及貯藏(B)期間發(fā)酵乳樣品黏度和滴定酸度變化Fig.6 The changes of the viscosity and titratable acidity of fermented milk sample during fermentation(A)and storage(B)

2.2.3 FM10-3發(fā)酵酸奶樣品發(fā)酵及儲藏過程中活菌總數(shù)的變化 發(fā)酵期間FM10-3活菌數(shù)變化如圖7A所示，在發(fā)酵初期，活菌數(shù)變化不大，當(dāng)發(fā)酵進入到第6 h時，活菌數(shù)增加幅度變大。在整個發(fā)酵的過程中，F(xiàn)M10-3活菌數(shù)整體呈現(xiàn)增加趨勢，在發(fā)酵結(jié)束時，活菌數(shù)達到8.8×109CFU/g。儲藏期間FM10-3活菌數(shù)變化如圖7B所示，從圖7B中可以看出，在儲藏過程中，活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，儲藏的初期，活菌數(shù)下降不明顯，但在儲藏后期，活菌數(shù)下降趨勢明顯增大，儲藏28 d的活菌數(shù)為1.1×107CFU/g。發(fā)酵乳作為普通酸奶食用，活菌數(shù)變化無特殊重要性，但若其應(yīng)用于膳食治療，大量活菌存在是十分重要的［10］。按前人的觀點，治療產(chǎn)品中應(yīng)含有高數(shù)量的益生菌活菌數(shù)，以確保其迅速通過胃而仍能保持足夠高的活菌數(shù)，才能達到理想的治療效果，最大劑量l010～1011CFU/g，一般劑量108～109CFU/g。本試驗中測定的以干酪乳桿菌FM10-3作為發(fā)酵菌種發(fā)酵的酸奶在4℃儲藏28 d仍保持較高的活菌數(shù)，可見FM10-3具有較高的存活性能。

圖7 發(fā)酵(A)及貯藏(B)期間發(fā)酵乳樣品中活菌總數(shù)的變化Fig.7 The changes of the viable count of FM10-3 in fermented milk sample during fermentation(A)and storage(B)

3 結(jié)論

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)相關(guān)菌株是經(jīng)長期驗證對人體無毒副作用，且廣泛用于保健食品生產(chǎn)的益生菌。本試驗對從新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分離篩選出的具有潛在益生特性的干酪乳桿菌FM10-3的生長規(guī)律和其發(fā)酵特性進行了研究，為該菌株的后期開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。但要確證其功能并開發(fā)成乳制品發(fā)酵劑菌株還需要進行動物模型試驗等的驗證，目前相關(guān)研究工作還在繼續(xù)。本研究獲得如下結(jié)論:

(1)FM10-3菌株生長較快，在37℃條件下靜止培養(yǎng)24 h即可進入穩(wěn)定生長期，菌體密度OD600值為2.2左右。

(2)FM10-3菌株的最適生長溫度為36℃左右，最適生長pH值為6.0左右，具有較好的耐鹽性能，在NaCl含量為7%的條件下仍能夠生長，但生長受到很大限制。

(3)FM10-3菌株具有較好的發(fā)酵特性，37℃條件下15 h開始凝乳，發(fā)酵結(jié)束時pH值為4.5，滴定酸度為81.6°T，酸奶黏度為2.49 Pa·s。在儲藏28 d后，滴定酸度為109.9°T，符合中國酸牛乳標(biāo)準(zhǔn)(LGB2746—1999)。

(4)FM10-3菌株具有較好的存活性能，發(fā)酵后儲藏28 d，酸奶的菌落密度仍能保持在107CFU/g以上，因此可應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

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