As2O3聯(lián)合丹參酮ⅡA對SW620細胞侵襲轉移能力的影響

王勇+王秀月+梁永娟+張廣潤+楚惠媛+陳徹

【摘要】 目的：探討As2O3（arsenic trioxide，As2O3）聯(lián)合運用丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA）對結腸癌SW620細胞遷移和侵襲的影響，并探討聯(lián)合用藥與單獨用藥的差異。方法：應用MTT法檢測不同濃度As2O3、Tan ⅡA及兩藥的聯(lián)合用藥對人結腸癌SW620細胞的增殖抑制作用，確定最佳聯(lián)合用藥濃度；分別用As2O3和Tan ⅡA以及兩藥聯(lián)合處理結腸癌SW620細胞，同時以未經藥物處理的SW620細胞作為空白對照，5-氟脲嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）處理組為陽性對照組。應用Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。結果：MTT試驗結果表明，As2O3（2.5 μg/mL）聯(lián)合Tan ⅡA（10 μg/mL）為最佳聯(lián)合用藥濃度。經As2O3和Tan ⅡA聯(lián)合干預后，SW620細胞的遷移和侵襲能力比空白對照及單藥組明顯降低（P<0.01）。結論：As2O3聯(lián)合Tan ⅡA作用能夠明顯抑制人結腸癌SW620細胞的侵襲轉移能力。

【關鍵詞】 結腸癌； 侵襲轉移； 三氧化二砷； 丹參酮ⅡA； 抗腫瘤

【Abstract】 Objective：To discuss the effect of arsenic trioxide （As2O3） combined with Tanshinone ⅡA （Tan ⅡA） on the migration and invasion of colon cancer SW620 cells，and to explore the difference between the combination with medication alone.Method：MTT assay was used to detect the inhibitory effect of As2O3，Tan ⅡA and two drugs on the proliferation of human colon cancer SW620 cells.The best combination concentration was determined.The combination of As2O3 and Tan ⅡA and two drugs were used to treat colon cancer SW620 cells，While the untreated SW620 cells were used as blank control，5-fluorouracil （5-FU） treated group was positive control group.Transwell migration and invasion experiments were used to detect changes in fine walking and invasive ability.Result：MTT assay showed that As2O3（2.5 μg/mL） combined with Tan ⅡA（10 μg/mL） was the best combination concentration.With the combination of As2O3 and Tan ⅡA，the migration and invasion ability of SW620 cells were significantly lower than those of blank control group and single drug group（P<0.01）.Conclusion：As2O3 combined with Tan ⅡA can significantly inhibit the invasion and metastasis of human colon cancer SW620 cells.

【Key words】 Colon cancer； Migration and invasion； As2O3； Tanshinone ⅡA； Antitumor

First-authors address：Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.28.007

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率和發(fā)病率逐年升高[1]，目前治療手段以早期切除及放化療為主，但易復發(fā)和轉移的特點，給其治療過程帶來了難題[2]。有研究表明，結腸癌患者發(fā)生肝轉移的概率高達50%[3]。因此，通過采取有效的治療手段抑制結腸癌細胞的侵襲和轉移，對結腸癌治療具有重要意義。

As2O3作為一種劇毒致癌藥物，2000年被FDA正式批準應用到急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）的治療中[4]。此后，大量研究表明其對實體惡性腫瘤細胞有效。Wang等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可以抑制小鼠結腸癌的肺轉移，然而As2O3的毒性作用限制了其在臨床上的廣泛應用，因此尋找減毒增效的用藥方案是As2O3抗腫瘤研究中的重點。有研究表明，有些中藥與化療藥物的聯(lián)用可以減少藥物的不良反應，并使每種藥物療效發(fā)揮最大作用[6]。Tan ⅡA是從丹參中提取出的脂溶性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其存在一定的抗癌活性。已有關于Tan ⅡA聯(lián)合其他抗腫瘤化療藥物的研究：其可協(xié)同順鉑聯(lián)合作用促進前列腺癌的凋亡[7]，可增強5-氟脲嘧啶（5-FU）對人結腸癌的抗腫瘤作用[8]。然而未見Tan ⅡA和As2O3聯(lián)合對結腸癌細胞作用的報道。因此本研究采用MTT、Transwell、研究As2O3聯(lián)合Tan ⅡA對人結腸癌SW620細胞游走及侵襲能力的影響，以期為抗結腸癌轉移提供新思路，現(xiàn)報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物 Leibovitzs L-15培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胰蛋白酶和胎牛血清購自美國HyClone公司；PBS、青鏈霉素混合液、MTT試劑購自北京索萊寶科技有限公司；基質膠（Matrigel）購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Corning公司；As2O3購自湖南省水口山礦務局衡陽實業(yè)總公司，Tan ⅡA購自上海第一生化藥業(yè)有限公司，5-FU購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 人結腸癌SW620購自上海中科院細胞庫，細胞用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素混合液的Leibovitzs L-15培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%且飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2～3天傳代、換液1次。

1.3 MTT法確定As2O3、TanⅡA及兩藥聯(lián)合用藥濃度 取處于對數(shù)生長期的SW620細胞，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于96孔板中（100 μL/孔），邊緣孔用PBS填充，細胞培養(yǎng)24 h后，對細胞進行分組及藥物干預。實驗分為空白對照組組（僅含培養(yǎng)液）、實驗對照組（SW620細胞）、陽性對照組（SW620細胞用1000 μg/mL 5-FU進行干預）、As2O3單藥組（SW620細胞分別用0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μg/mL As2O3進行干預）、Tan ⅡA單藥組（SW620細胞分別用0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL進行干預）、As2O3聯(lián)合Tan ⅡA用藥組（2.5 μg/mL+10 μg/mL Tan ⅡA聯(lián)合干預），每組設5個復孔。藥物作用72 h后，加入5 g/L的MTT溶液；培養(yǎng)4 h后，加入三聯(lián)裂解液（10%SDS溶液+5%異丁醇溶液+0.1%鹽酸溶液）；37 ℃孵育4～6 h，紫色結晶溶解后，將96孔板置于搖床上輕搖15 min；用酶標儀檢測波長520 nm處各孔的光密度值（OD），按下列公式計算各用藥組的細胞活性（Cell ability），Cell ability=OD用藥組/OD實驗對照組。

1.4 Transwell遷移和侵襲實驗檢測各組藥物作用后SW620細胞的遷移和侵襲能力 收集無血清饑餓培養(yǎng)12 h后的SW620細胞1×104個，稀釋于200 μL無血清的Leibovitzs L-15培養(yǎng)液中，加入Transwell上室；下室加入600 μL含20%胎牛血清的Leibovitzs L-15培養(yǎng)液。實驗分為5組：空白對照組（無藥物干預）、陽性對照組（5-FU干預組）、As2O3單藥組（2.5 μg/mL）、Tan ⅡA單藥組（10 μg/mL）、As2O3聯(lián)合Tan ⅡA用藥組（2.5 μg/mL As2O3與10 μg/mL Tan ⅡA 聯(lián)合）。培養(yǎng)48 h后，用棉簽拭去上室面的細胞，經3.7%甲醛溶液固定，100%甲醇溶液脫水，然后進行結晶紫染色。光學顯微鏡下隨機選取中央及四周的5個視野，計數(shù)下室面附著的細胞數(shù)，來反映細胞的轉移能力。重復實驗3次。在Transwell上室膜（孔徑為8 μm的聚碳酸酯膜）上涂布無血清Leibovitzs L-15培養(yǎng)液稀釋的Matrigel（模擬細胞外基膜）40 μL，37 ℃反應1 h成膠，然后紫外線照射過夜。第2天，將饑餓培養(yǎng)12 h后的SW620細胞計數(shù)4×105個，稀釋于200 μL的無血清Leibovitzs L-15培養(yǎng)液中，加入上室；剩余步驟同Transwell遷移實驗。計數(shù)穿膜細胞數(shù)，來反映細胞的侵襲能力。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間數(shù)據采用單因素方差分析或F檢驗，組內數(shù)據兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檢測As2O3或Tan ⅡA處理后的SW620細胞活力 As2O3（2.5 μg/mL）聯(lián)合Tan ⅡA（10μg/mL）抑制結腸癌SW620細胞的生長，且兩者具有協(xié)同作用。MTT結果顯示，As2O3對SW620作用的72 h半數(shù)抑制濃度（halfinhibitory concentration，IC50）在2.5 μg/mL附近，而Tan ⅡA的72 h IC50約為10 μg/mL（圖1、2），且兩藥都存在時間-劑量依賴關系。因此本研究取As2O3（2.5 μg/mL）和Tan ⅡA（10 μg/mL）作為用藥濃度，通過聯(lián)合用藥組的細胞存活率（0.358±0.010）與As2O3組的細胞存活率（0.497±0.041）、TanⅡA組的細胞存活率（0.565±0.012）、5-FU單藥組的細胞存活率（0.572±0.038）比較，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥的細胞存活率明顯降低。且兩藥聯(lián)合應用時，對細胞的生長抑制作用明顯高于As2O3、Tan ⅡA及5-FU單藥組（F=59.940，P<0.05），見圖3。各單藥組之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 As2O3聯(lián)合Tan ⅡA作用對SW620細胞遷移及侵襲能力的影響 Transwell遷移實驗結果顯示，藥物作用48 h后在顯微鏡下計數(shù)穿膜的SW620細胞，單因素方差分析5組之間的穿膜細胞數(shù)，差異均有統(tǒng)計學意義（F=720.372，P<0.01）；As2O3單藥組、Tan ⅡA及5-FU單藥組和聯(lián)合組的穿膜細胞數(shù)分別為（54.33±4.04）、（80.33±5.03）、（89.33±4.04）、（24.00±4.00）均明顯少于空白對照組的（237.00±8.19）（P<0.01）；且聯(lián)合組的穿膜細胞數(shù)明顯少于各單藥組（P<0.01）。Transwell侵襲實驗結果顯示，藥物作用48 h后在顯微鏡下計數(shù)穿膜的SW620細胞，單因素方差分析5組之間的穿膜細胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.351，P<0.01）；As2O3單藥組、Tan ⅡA及5-FU單藥組和聯(lián)合組的穿膜細胞數(shù)分別為（21.00±3.60）、（29.67±3.51）、（30.67±3.05）、（13.67±3.51）均明顯少于空白對照組的（39.67±4.73）（P<0.01）；且聯(lián)合組的穿膜細胞數(shù)明顯少于各單藥組（P<0.01）。見圖4、5。endprint

3 討論

腫瘤細胞的侵襲轉移能力是惡性腫瘤最基本的特性，也是導致腫瘤患者死亡的重要原因[9]。結腸癌細胞的侵襲轉移是結腸癌發(fā)展的重要過程，抑制結腸癌細胞的侵襲可能提高結腸癌術者的預后[10-12]。近年來越來越多的研究表明，As2O3和Tan ⅡA分別在結腸癌的治療過程中都具有抑制結腸癌腫瘤細胞轉移和侵襲的作用[13-16]，聯(lián)合藥物治療結腸癌的研究也越來越多[17-20]，然而就As2O3和Tan ⅡA兩者聯(lián)合應用，是否能夠抑制結腸癌細胞侵襲和轉移，目前未見報道。本研究應用Transwell遷移及侵襲實驗檢測了As2O3和Tan ⅡA單藥及兩者聯(lián)合用藥對SW620細胞遷移和侵襲能力的影響。結果顯示，聯(lián)合用藥組對SW620細胞的活力，遷移和侵襲的抑制作用超過明顯超過兩單藥組。

綜上所述，As2O3聯(lián)合Tan ⅡA具有抗人結腸癌SW620細胞遷移和侵襲的能力，聯(lián)合兩者用藥是很有前途的抗結腸癌治療手段，為臨床上治療結腸癌提供了新思路。腫瘤的侵襲轉移是極為復雜度動態(tài)調節(jié)過程，是疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素，其具體作用機制有待進一步研究。

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