非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因突變及其臨床背景關(guān)系分析

王 巍，姜 江，榮 光，黃 宏， 張永勝， 石怡珍

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 a.核醫(yī)學科; b.病理科，江蘇 蘇州 215004)

·論著·

非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因突變及其臨床背景關(guān)系分析

王 巍a，姜 江a，榮 光a，黃 宏a， 張永勝b， 石怡珍a

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 a.核醫(yī)學科; b.病理科，江蘇 蘇州 215004)

目的探討非小細胞肺癌患者EGFR基因突變狀況以及與各臨床背景間的關(guān)系。方法采用擴增阻遏突變系統(tǒng)taqman-ARMS法對257例非小細胞肺癌患者腫瘤組織進行了EGFR基因檢測，并回顧性分析突變情況與病理類型、TNM分期、患者性別、年齡及生活習慣等臨床背景間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果257例非小細胞肺癌樣本中，EGFR突變率為38.5%，93例存在單一突變，6例存在兩種突變，突變主要集中在19外顯子缺失突變和21外顯子的點突變。腺癌突變率明顯高于鱗癌及其他非腺癌(P<0.01) 。女性突變率高于男性(P<0.01)?！?5歲與>65歲兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。非吸煙者突變率明顯高于吸煙者(P<0.01)，突變與吸煙年限關(guān)聯(lián)不明顯，與日吸煙量明顯相關(guān)(P<0.01)。根據(jù)TNM分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期各組間比較突變率差異無統(tǒng)計學意義。中、高分化間突變與低分化相比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。結(jié)論非小細胞肺癌EGFR基因突變與性別、組織學分型、腫瘤分化程度、吸煙以及日吸煙量等臨床特征顯著相關(guān)，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及吸煙年限等無明顯相關(guān)。

癌，非小細胞肺 ；受體，表皮生長因子； 突變

國際癌癥研究機構(gòu)(IARC) 于2013年12月12日公布，肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。目前在中國，肺癌的發(fā)病率和病死率也均居惡性腫瘤之首[2]。而肺癌患者中約有80%～85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)，且有近一半以上的 NSCLC確診即為晚期[3]。近10年來，隨著表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)這個靶點的發(fā)現(xiàn)和相關(guān)藥物的發(fā)展，使NSCLC的治療進入了基于分子靶點的個體化治療時代 。本研究匯總了2014年1月至2016年6月在我科臨床基因擴增室進行檢測的所有組織標本的EGFR基因結(jié)果，分析EGFR突變情況與患者性別、年齡及生活習慣、病理類型、TNM分期等臨床背景間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2014年1月至2016年6月蘇州大學附屬第二醫(yī)院收治的NSCLC患者257例，男150例，女107例，年齡29～85歲，平均(63.4±10.1)歲。吸煙者106例，不吸煙者151例。組織標本來自外科手術(shù)切除、纖維支氣管鏡下活檢、經(jīng)皮穿刺活檢，并經(jīng)病理證實，腺癌194例，鱗癌52例， 腺鱗癌8例，其他組織類型3例?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)放化療。

1.2DNA提取 標本均選取連續(xù)石蠟切片5～10片，1片進行蘇木精伊紅(HE)染色，顯微鏡下鏡檢，以確定腫瘤細胞的存在，估測腫瘤細胞百分比并提示分布區(qū)域。試劑盒為QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen公司，德國)。嚴格按照說明書操作提取腫瘤組織DNA，使用 Q5000超微量紫外分光光度計(Quawell，美國)測量所提取DNA濃度，260/280在1.7～2.1之間。DNA 濃度均稀釋至5～10 ng/μl待用。

1.3PCR擴增 擴增儀為Roche LightCycler?480Ⅱ(Roche公司，德國)。檢測試劑盒為Taqman-ARMS Detection Kit for the Analysis of Human EGFR Gene Mutations(蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司，中國)。試劑盒采用8聯(lián)管設(shè)計，最終反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5分鐘，(95 ℃ 20 s+ 63 ℃ 40 s)/循環(huán)，循環(huán)45次，40 ℃冷卻10 s，結(jié)果按照說明書進行分析，判定。

1.4統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SAS9.4統(tǒng)計軟件進行分析，組間分類變量比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1EGFR基因突變檢測結(jié)果 257例NSCLC中，檢測到EGFR突變99例(38.5%)。其中單突變93例，包括19外顯子缺失突變48例(48.5%)，21外顯子點突變39例(39.4%)，20外顯子突變6例(6.1%)，未檢測到18外顯子點突變；雙突變6例，分別是E19-del和S768I 1例，E19-del和L858R 1例，E19-del和T790M 2例，L858R和T790M 2例。99例突變中，以19外顯子746-752位密碼子的缺失突變或21外顯子L858R的點突變?yōu)橹?，?2例(92.3%)。見圖1 。

2.2EGFR基因突變與性別、年齡及生活習慣的關(guān)系 本組病例中，≤65歲者153例，57例突變(37.3%)，>65歲者104例，42例突變(40.4%)，兩者間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.256，P>0.05)；男性150例，突變35例(23.3%)，女性107例，突變64例(59.8%)，女性突變率明顯高于男性(χ2=33.727，P<0.01)。見表1。分析257例患者生活習慣，吸煙者106例，18例EGFR基因突變(17.0%)，非吸煙者151例，突變81例(53.6%)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=35.346，P<0.01)(圖2)。進一步對106例吸煙患者的吸煙史及日吸煙量進行了分組分析，吸煙史按照每10年分段共5組，組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。日吸煙量按照10支分期共分4組，各組間差異有統(tǒng)計學意義。尤其是每日吸煙量≤10支組與>10支組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.629，P<0.01)。同時，不難發(fā)現(xiàn)隨著日吸煙量的增加，基因突變率逐漸下降。EGFR突變與吸煙年限關(guān)聯(lián)不明顯，但與日吸煙量明顯相關(guān)。

表1 EGFR突變情況

圖2 患者吸煙狀況與EGFR基因突變關(guān)系

2.3EGFR基因突變與病理特征的關(guān)系 257例患者根據(jù)病理組織分型，腺癌194例，91例(46.9%)基因突變，鱗癌52例，5例(9.6%)突變，腺鱗癌8例，3例(37.5%)突變，其他組織類型3例，未發(fā)現(xiàn)突變。從突變率看，腺癌明顯高于鱗癌以及其他非腺癌(P<0.01)。此外，根據(jù)病理特征分組，低分化者42例，4例(9.5%)突變，中分化者105例，47例(44.8%)突變，高分化者15例，8例(53.3%)突變。中、高分化間突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但是，中、高分化間突變率明顯高于低分化組(均P<0.01)。腫瘤分化情況不詳者95例，40例突變(42.1%)。見表2。

回顧手術(shù)與影像學資料，257例患者按照淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移進行分組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移140例，54例突變(38.6%)，暫未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移117例，45例突變(38.5%)(P>0.05)。TNM分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期EGFR基因突變率分別為47.8%、31.0%、32.5%、37.7%，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 EGFR突變情況

注：與鱗癌比較， χ2=23.967，*P<0.01；與非腺癌比較，χ2=23.500，#P<0.01。 由于腺鱗癌病例少，未進行單獨統(tǒng)計。與中分化比較， χ2=29.002，△P<0.01；與高分化比較，χ2=12.763，▲P<0.01

3 討 論

EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，該酪氨酸激酶區(qū)域的激活即磷酸化對腫瘤細胞的增殖、生長、轉(zhuǎn)化、血管生成以及凋亡等作用重大[4-6]。EGFR基因突變僅見于腫瘤組織，尤其是NSCLC，約有40%～80%上調(diào)表達EGFR。研究表明，發(fā)生在EGFR-TK結(jié)構(gòu)域的突變共有486個，集中在18～21外顯子。其中90%是外顯子19的密碼子746～750主要位點的缺失突變及第21外顯子的密碼子858由亮氨酸變?yōu)榫彼?L858R)的點突變[6-7]。自從2004年發(fā)現(xiàn)肺癌 EGFR基因突變，具有EGFR基因突變的NSCLC患者使用EGFR-TKI制劑的療效得到眾多國內(nèi)外研究的肯定[8]。研究表明EGFR基因突變是腫瘤生長重要的調(diào)控基因，是目前最有前途的特異性腫瘤靶向診療分子之一，同時，EGFR突變與患者的某些臨床背景有著密切的關(guān)聯(lián)[9]。

本研究回顧分析了NSCLC患者257例， EGFR基因突變多見于女性、腺癌、不吸煙者，與相關(guān)文獻相符[9]。 突變主要集中在19外顯子的缺失突變及21外顯子L858R的錯義突變，突變率92.3%，與相關(guān)文獻報道的90%接近[6，9]。257例中有99例(38.5%)不同程度發(fā)生突變，略低于報道的亞裔突變率(39%～64%)，這可能與樣本量及樣本的選擇有關(guān)。這些具有基因突變的患者目前大部分都已經(jīng)或者即將在靶向治療中獲益。本研究中具備女性、腺癌、非吸煙者的突變優(yōu)勢人群中，突變頻率可達60%，與相關(guān)研究的突變率63%接近。在99例突變的樣本中，有6例檢出外顯子20突變，其中4例是在19外顯子缺失突變或L858R等敏感性突變的基礎(chǔ)上合并790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變(T790M)；6例中有1例為使用EGFR-TKI治療中發(fā)生的耐藥突變，其余5例均為治療前的原始腫瘤組織標本。有研究表明T790M不僅僅存在于已經(jīng)接受EGFR-TKI治療患者中，即與獲得性耐藥有關(guān)，還可能與致癌有關(guān)[10-12]。Cross及Yun等[13-14]認為EGFR基因由于存在T790M突變，導(dǎo)致側(cè)鏈空間結(jié)構(gòu)增大，出現(xiàn)位阻現(xiàn)象(steric hindrance)，阻礙了EGFR-TKI與酪氨酸激酶的結(jié)合；另一方面T790M突變使EGFR與ATP親和力增加，導(dǎo)致EGFR-TKI無法有效阻斷信號通路而導(dǎo)致耐藥。第三代靶向藥物能夠不可逆的與EGFR激酶ATP結(jié)合位點的第797位氨基酸半胱氨酸結(jié)合，抑制EGFR激酶磷酸化及下游腫瘤信號通路的激活，因此能夠抑制EGFR敏感突變及T790M突變的腫瘤細胞，為獲得性耐藥T790M陽性患者增加了治療的機會，因此，目前建立多種檢測平臺如數(shù)字PCR、二代測序等方法提高T790M突變檢測的敏感度是后續(xù)努力的方向。

在眾多臨床背景中，與EGFR突變獨立相關(guān)的是組織類型與吸煙狀況[15]。本研究腺癌患者突變率高達46.9%，明顯高于非腺癌。在吸煙方面，由于257例患者中女性基本為不吸煙者，因此單獨將男性患者進行分類比較。發(fā)現(xiàn)男性患者吸煙與不吸煙基因突變的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.982，P<0.01)。在各個外顯子的突變上，非吸煙者都明顯高于吸煙者。同時發(fā)現(xiàn)相對吸煙年限，吸煙者的日吸煙量與EGFR的基因突變關(guān)聯(lián)更大，在本研究中，日吸煙超過30支的患者22例，無1例存在EGFR突變，可見，日吸煙量越大，基因突變可能就越小，這與文獻[16]觀點一致。由于患者的生活習慣都是來自患者或家屬的自述，吸煙年限、每日吸煙支數(shù)無法保證特別精準，所以研究結(jié)果可能會存在一定的偏差。

另外，從患者的病程以及病理學特征分析，本研究中EGFR基因突變與TNM分期無明顯關(guān)聯(lián)，與腫瘤分化程度有一定相關(guān)性，腫瘤分化越好，突變率越高。這雖然與有些文獻觀點相符[17-18]，但同時又與另外一些報道相反[19]。出現(xiàn)兩種相反的觀點，最大原因應(yīng)該是標本量的局限，以及組間樣本量的差異過大。本研究中，高分化患者僅有15例，有95例無法獲得其具體的分化情況，這些都會影響最終的統(tǒng)計分析結(jié)果。

因此，需要加大樣本量，詳實病史資料，以便更清楚地了解靶點基因EGFR與NSCLC的關(guān)系，同時也希望通過相關(guān)臨床背景的統(tǒng)計分析，認識其與基因突變的相互關(guān)聯(lián)，一方面，有助于臨床確定最佳用藥人群，優(yōu)化符合患者臨床特征的個性化診治方案，在NSCLC靶向治療中更有針對性；另一方面，可提醒人們選擇良好的生活習慣，使健康生活更有保證。

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Epidermalgrowthfactorreceptormutationsinnon-smallcelllungcancerandclinicalbackground

Wang Weia， Jiang Jianga， Rong Guanga， Huang Honga， Zhang Yongshengb， Shi Yizhena

a.DepartmentofNuclearMedicine;b.DepartmentofPathology，theSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215004，China

ShiYizheng，Email:szdrshi88@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations and different clinical backgrounds in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).MethodsEGFR mutations in the tumor tissues of 257 NSCLC patients were analyzed by TaqMan-ARMS (TaqMan-amplification refractory mutation system). The mutation of EGFR was explored in correlation with the clinicopathological features， TNM stage， gender， age and habits of patients.Results99(38.5%) EGFR mutations， which were mainly located in exon 19 with the pattern of deletion mutation and exon 21 with the point mutation， were identified among 257 NSCLC patients. The mutation rate was higher in patients with adenocarcinoma and adenosquamous carcinoma than that in patients with squamous cell carcinomas and other subtypes(allP<0.01). Mutation rate in female was higher than that in male(P<0.01). However， no evident association was found between EGFR mutation and age(P>0.05). EGFR gene mutations occurred more frequently in non-smokers compared with smokers (P<0.01). EGFR mutation was not associated with smoking years， but significantly correlated with daily smoking (P<0.01). There was no significant difference between EGFR gene mutation and clinical TNM stage of NSCLC(Ⅰ，Ⅱ， Ⅲ and Ⅳ). EGFR mutation rates in patients with different pathological characteristics， to some extent， were different. Mutation was significantly different between low differentiation and middle or high differentiation (P<0.01).ConclusionEGFR gene mutation in NSCLC was significantly correlated with gender， histological type， tumor differentiation， smoking and daily smoking amount but not with age， lymph node metastasis， TNM stages and smoking years.

carcinoma，non-small cell lung；receptor，epidermal growth factor； mutation

石怡珍，Email: szdrshi88@163.com

R743.2

A

1004-583X(2017)11-0957-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.010

2017-07-19 編輯:武峪峰