烏司他丁對(duì)腸道上皮細(xì)胞屏障損傷的保護(hù)作用分析

李永勝，馬曉峰

(1.甘肅省人民醫(yī)院 急診科，甘肅 蘭州 730000; 2.國(guó)營(yíng)長(zhǎng)風(fēng)機(jī)器廠職工醫(yī)院 內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

·論著·

烏司他丁對(duì)腸道上皮細(xì)胞屏障損傷的保護(hù)作用分析

李永勝1，馬曉峰2

(1.甘肅省人民醫(yī)院 急診科，甘肅 蘭州 730000; 2.國(guó)營(yíng)長(zhǎng)風(fēng)機(jī)器廠職工醫(yī)院 內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

目的探討烏司他丁(UTI)對(duì)腸道上皮細(xì)胞屏障損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，并建立腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的單層上皮細(xì)胞模型，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、TNF-α模型組、UTI低劑量組(5萬(wàn)U/kg)、UTI中劑量組(10萬(wàn)U/kg)、UTI高劑量組(20萬(wàn)U/kg)。采用Millicell電阻儀和多功能讀板儀分別測(cè)定各組上皮細(xì)胞電阻(TER)和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-dextran)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-10水平，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，免疫蛋白質(zhì)印記(Western blot)技術(shù)測(cè)定緊密連接蛋白閉合蛋白(occludin)和緊密黏連蛋白1(ZO-1)表達(dá)水平。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，TNF-α模型組TER、FITC-dextran、occludin和ZO-1表達(dá)水平均明顯下降，IL-6、IL-10、細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，經(jīng)UTI處理后，TER、FITC-dextran、occludin和ZO-1表達(dá)水平升高，IL-6、IL-10、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，其中以UTI高劑量組變化最顯著(P<0.05)。結(jié)論UTI可能通過(guò)抑制炎性介質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞屏障功能損傷。

腸；細(xì)胞屏障；腫瘤壞死因子α；烏司他?。痪o密連接蛋白

腸道上皮細(xì)胞屏障是維持腸道屏障功能的關(guān)鍵[1]，腫瘤壞死因子α(TNF-α)是重要的致炎因子，可損害腸上皮細(xì)胞及其細(xì)胞間緊密結(jié)構(gòu)，影響腸道屏障功能。烏司他丁(UTI)是一種廣譜酶抑制劑，可抑制中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等釋放的絲氨酸蛋白酶，具有抑制炎癥、清除氧自由基等作用[2]。最近研究表明，UTI抗炎效果確切，對(duì)小鼠腸道黏膜損傷有保護(hù)作用[3-4]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立TNF-α誘導(dǎo)的單層腸上皮細(xì)胞(IECs)屏障模型，從細(xì)胞功能、分子水平方面綜合評(píng)價(jià)UTI對(duì)模型細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討作用機(jī)制，為UTI治療腸黏膜屏障損傷提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1試劑與設(shè)備 UTI由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供；DMEM高糖培養(yǎng)基由美國(guó)GIBCO BRl公司提供；人腸上皮細(xì)胞注射株Caco-2細(xì)胞由美國(guó)ATCC公司提供；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；兔抗occludin抗體由美國(guó)Abcam公司提供；兔抗ZO-1抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供；TNF-α、IL-6 ElISA檢測(cè)試劑由上海森雄生物技術(shù)公司提供；Millicell電阻儀由Millipore公司提供；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱由美國(guó)NAPCO公司提供BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀由美國(guó)Becton Dickinson公司提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及單層上皮細(xì)胞模型的建立 用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人腸上皮細(xì)胞注射株Caco-2細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，檢測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻(TER)。體外上皮屏障形成判斷標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)21～28天后TER明顯升高，且數(shù)值穩(wěn)定。

1.2.2Millicell電阻儀和多功能讀板儀分別測(cè)定TER和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-dextran) 將傳代至23～31代的Caco-2細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始后換用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)液，由不含谷氨酰胺(Gln)和胎牛血清(FBS)的DMEM、10 nmol/L 4-羥乙基哌乙磺酸(HEPES)、10 g/L丙酮酸鈉構(gòu)成。Caco-2細(xì)胞單層以5×105/個(gè)接種于96孔板，分別在頂室與底室中加入實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)液100 μl和600 μl，隔天換液。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及緊密連接的完整性。測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)TER值。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)前加入無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12小時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組(無(wú)TNF-α、UTI)和TNF-α處理組，TNF-α處理組分別不加入U(xiǎn)TI或加入U(xiǎn)TI低(5萬(wàn)U/kg)、中(10萬(wàn)U/kg)、高劑量組(20萬(wàn)U/kg)，每組3個(gè)復(fù)孔，孵育過(guò)夜后，空白對(duì)照組更換細(xì)胞培養(yǎng)液，UTI低、中、高劑量組分別給予5萬(wàn)U/kg、10萬(wàn)U/kg，20萬(wàn)U/kg UTI繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。用Millicell電阻儀的兩電極置入小室頂側(cè)和基底側(cè)測(cè)定TER值。各Caco-2細(xì)胞處理48小時(shí)，采用FITC-葡聚糖((FITC-dextran))熒光示蹤法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞通透性。預(yù)熱D-hank液至37 ℃，清洗Transwell頂室、底室1次，分別添加FITC-葡聚糖(1 mg/ml)100 μl、D-hank液500 μl，置于96孔板內(nèi)，37 ℃、5%CO2條件下孵育2小時(shí)。取底室液體，采用多功能讀板儀(芬蘭Thermo公司)檢測(cè)樣品熒光長(zhǎng)度，激光波長(zhǎng)480 nm，發(fā)生光波長(zhǎng)520 nm，重復(fù)測(cè)量5次取平均值。

1.2.3ELISA測(cè)定IL-6、TNF-α水平 將Caco-2細(xì)胞單層以5×105/L接種于24孔板，分組及干預(yù)方法同1.2.2，培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清液，采用ElISA法測(cè)定各組IL-6、IL-10水平。

1.2.4流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將Caco-2細(xì)胞單層以每孔3×105/L各細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜，分組及干預(yù)方法同1.2.2。干預(yù)24小時(shí)后吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞3次，制成單細(xì)胞懸液，并用PBS重懸，密度為1.0×106個(gè)/ml，加入FITC Annexin V和PI各5 μl，室溫下孵育15分鐘后，加入PBS 400 μl，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5采用免疫蛋白質(zhì)印記(western blot)技術(shù)測(cè)定緊密連接蛋白o(hù)ccludin、zo-1表達(dá)水平 將Caco-2細(xì)胞單層以1.0×105/L接種于24孔板，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，根據(jù)抗體實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書推薦濃度用一抗稀釋液稀釋對(duì)應(yīng)抗體，其中兔抗occlidin抗體為1∶800，兔抗ZO-1抗體為1∶200，將封閉好的PVDF膜放入稀釋一抗中，孵育過(guò)夜，TBST溫床上洗膜3次。按照1∶3 000的比例用脫脂奶粉稀釋二抗，與PVDF膜孵育，孵育1小時(shí)，TBST溫床上洗膜3次。按照發(fā)光液試劑盒說(shuō)明書吸取1 ml試劑A和試劑B，混合后滴到PVDF膜上，吸去周邊多余發(fā)光劑，測(cè)量吸光度值，重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，采用單因素方差分析，如方差不齊采用Welah校正。組間多重比較在方差齊時(shí)選用Dunnett法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)選用Dunnet T3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TER、FITC-dextran比較 與空白對(duì)照組比較，TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組TER、FITC-dextran均明顯下降(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，UTI治療后TER、FITC-dextra明顯升高(P<0.05)，UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 TER、FITC-dextran比較(n=3)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與TNF-α模型組比較，#P<0.05；與UTI低劑量組比較，△P<0.05；與UTI中劑量組比較，▲P<0.05

2.2Caco-2細(xì)胞單層炎性水平比較 與空白對(duì)照組比較，TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組IL-6、IL-10均明顯升高(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，UTI治療后IL-6、IL-10明顯降低(P<0.05)，UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 Caco-2細(xì)胞單層炎性水平比較(n=3)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與TNF-α模型組比較，#P<0.05；與UTI低劑量組比較，△P<0.05；與UTI中劑量組比較，▲P<0.05

2.3Caco-2細(xì)胞單層凋亡率及緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，Occludin、ZO-1表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)；與TNF-α模型組比較，UTI治療后細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，Occludin、ZO-1表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3，見圖1，2。

表3 Caco-2細(xì)胞單層凋亡率及緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)的比較(n=3)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與TNF-α模型組比較，#P<0.05；與UTI低劑量組比較，△P<0.05；與UTI中劑量組比較，▲P<0.05

圖1Caco-2細(xì)胞單層凋亡率分析

圖2緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)A、B、C、D、E分別為空白對(duì)照組、TNF-α模型組、UTI低劑量組、UTI中劑量組、UTI高劑量組

3 討 論

完整的腸道上皮細(xì)胞屏障是維持腸道屏障功能重要的一環(huán)，可阻止腸內(nèi)大分子毒素、細(xì)菌等穿過(guò)腸壁，預(yù)防全身炎癥反應(yīng)(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)等發(fā)生。腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接完整與否直接影響腸道上皮屏障功能，一旦上皮緊密連接缺失或變異，細(xì)胞間隙通透性明顯增加，腸道屏障功能被破壞[5]。緊密連接主要位于上皮細(xì)胞頂端，包括Occludin、ZO-1、claudin-2蛋白等，其中Occludin是一種擴(kuò)膜蛋白，通過(guò)Occludin蛋白封閉細(xì)胞間隙，與ZO-1蛋白共同形成緊密連接的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，可調(diào)控物質(zhì)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，是目前研究最多的緊密連接功能蛋白；ZO-1是ZO異構(gòu)體最為主要的部分，可將縫隙連接(GJ)、黏附連接(AJ)連接在一起，在維持腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接完整性中起重要作用[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，炎性介質(zhì)、腸道內(nèi)細(xì)菌、細(xì)胞因子等均會(huì)導(dǎo)致Occludin、ZO-1等緊密連接蛋白表達(dá)異常，增加腸黏膜通透性，影響腸道屏障功能[7]。故本研究選取Occludin、ZO-1作為觀察指標(biāo)。

TNF-α是重要的致炎性因子之一，可通過(guò)激活肌球蛋白輕鏈激酶(MlCK)所接介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈激酶化，導(dǎo)致緊密連接蛋白重組，破壞腸道屏障功能，一般阻斷TNF-α后，腸道屏障功能會(huì)有所恢復(fù)[8-9]。多數(shù)研究指出，TNF-α?xí)黾幽c黏膜通透性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)赥ranswell的上下室均加入TNF-α，以保證Caco-2單層細(xì)胞頂部和基底部均可接觸到TNF-α，結(jié)果顯示TER、FITC-dextra均下降，說(shuō)明TNF-α?xí)茐腃aco-2細(xì)胞單層屏障功能，增加細(xì)胞通透性增加，與Coskun等[12]研究結(jié)果一致。另外，本實(shí)驗(yàn)中，TNF-α模型組Occludin、ZO-1蛋白較空白對(duì)照組明顯降低，提示Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)異常，可能影響腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接完整性。劉行等[13]研究指出，緊密連接蛋白重新分布是TNF-α損害腸道上皮細(xì)胞功能的重要機(jī)制之一，本研究結(jié)果與其一致。

UTI主要來(lái)源于人尿的相對(duì)分子質(zhì)量為67 000的糖蛋白，對(duì)絲氨酸蛋白酶、透明質(zhì)酸梅、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還可抑制白細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等炎性介質(zhì)，降低細(xì)胞毒性作用，減輕腸黏膜充血，降低腸道通透性，預(yù)防腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素移位[14-15]。Shikimi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，UTI可抑制炎性介質(zhì)(如TNF-α、IL-6等)釋放，減輕其對(duì)器官功能的損害。周玉坤等[17]研究發(fā)現(xiàn)，UTI對(duì)急性重癥膽囊炎所致腸黏膜損傷有保護(hù)作用，能改善緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)異常情況。常瑞明等[18]研究指出，UTI可通過(guò)降低炎性介質(zhì)釋放、降低腸黏膜Caspase-3等保護(hù)心肺復(fù)蘇后大鼠受損腸黏膜。因此，我們考慮UTI可改善TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞屏障功能障礙。為證實(shí)這一猜想，本實(shí)驗(yàn)組中，加入不同劑量的UTI，結(jié)果表明加入U(xiǎn)TI后可改善TNF-α引起的TER、FITC-dextran下降，且治療后IL-6、IL-10明顯降低，Occludin、ZO-1表達(dá)水平上調(diào)，呈現(xiàn)出劑量依賴性，說(shuō)明UTI可上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，降低腸黏膜通透性。

綜上所述，TNF-α與腸道上皮細(xì)胞屏障損傷密切相關(guān)，UTI對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞屏障損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為抑制IL-6、IL-10炎性介質(zhì)釋放、上調(diào)緊密連接蛋白；另外，UTI對(duì)腸道上皮細(xì)胞屏障損傷的保護(hù)作用呈具有劑量依賴性。

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Protectiveeffectofulinastatinonintestinalepithelialcellbarrier

Li Yongsheng1， Ma Xiaofeng2

1.DepartmentofEmergency，GansuProvincialHospital，Lanzhou730000，China; 2.DepartmentofMedicine，GansuNationalChangfengMachineryFactoryHospital，Lanzhou730070，China

LiYongsheng，Email:zf26892@126.com

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of ulinastatin (UTI) on intestinal epithelial cell barrier.MethodsCaco-2 cells were cultured， epithelial cells monolayer models induced by tumor necrosis factor-α(TNF-α ) were established and were randomly divided into blank control group， TNF-α model group， low-dose UTI group (50 000 U/kg)， middle-dose UTI group (100 000 U/kg) and high-dose UTI group (200 000 U/kg). The transepithelial electrical resistance (TER) and fluoresce in isothiocyanate marked dextran FITC-dextran in all groups were determined by Millicell electrical resistance meter and multifunctional plate reader. Interleukin 6 (IL-6) and IL-10 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ElISA). The apoptosis rate was measured by flow cytometry， and the expression of tight junction protein occludin and ZO-1 were measured by Western blot.ResultsThe expression of TER， FITC-dextran， occludin and ZO-1 were significantly lower in TNF-α model group than those in blank control group， while IL-6， IL-10 and apoptosis rate were significantly higher (P<0.05). After UTI treatment， TER， FITC-dextran， occludin and ZO-1 were significantly higher than those in TNF-α model group， while IL-6， IL-10 and apoptosis rate were significantly lower (P<0.05). UTI change in high-dose group was the most significant (P<0.05).ConclusionUTI may protect the intestinal epithelial cell barrier injury induced by TNF-α through inhibiting the release of inflammatory mediators and regulating the expression of tight junction associated proteins.

intestines; cell mucosal barrier; tumor necrosis factor-alpha; ulinastatin; tight junction protein

李永勝，Email: zf26892@126.com

R322.45

A

1004-583X(2017)11-0953-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.11.009

2017-05-31 編輯:張衛(wèi)國(guó)