中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，曾佳佳，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

中性蛋白酶降解棉粕中棉酚的研究

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，曾佳佳，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

該實驗旨在利用芽孢桿菌（Bacillus）和乳酸桿菌（Lactobacillus）發(fā)酵棉粕，研究對棉粕中游離棉酚降解率及飼料活菌數(shù)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌BLCC1-0039在37℃發(fā)酵24 h后棉酚降解率達(dá)到85.89%（P＜0.05），產(chǎn)中性蛋白酶活性達(dá)到2 811.40 U/g發(fā)酵料（P＜0.05）；發(fā)酵48 h時棉酚降解率達(dá)到91.47%，產(chǎn)中性蛋白酶活性達(dá)到2303.24 U/g。單獨添加中性蛋白酶發(fā)酵24 h時，添加量為1 000 U/g的棉酚降解率已達(dá)到58.46%，2 000 U/g時棉酚降解率達(dá)到72.68%；發(fā)酵48 h時1 000 U/g的棉酚降解率已達(dá)到73.29%。乳酸菌發(fā)酵棉粕不能降解棉酚，但乳酸桿菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶發(fā)酵24 h時，棉酚降解率達(dá)到67.13%，pH值降至4.71。

中性蛋白酶；棉酚；棉粕；芽孢桿菌；乳酸桿菌

我國蛋白質(zhì)飼料資源嚴(yán)重短缺，而棉粕產(chǎn)量高且價格低廉，棉粕蛋白含量高達(dá)38%～50%，粗纖維約11%，此外B族維生素、硫胺素和有機(jī)磷也比較多[1-2]，同大豆粕一樣是重要的蛋白質(zhì)飼料資源[3]。然而，棉籽餅中含有棉酚、環(huán)丙稀脂肪酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子物質(zhì)，其中最主要的是棉酚，如果未經(jīng)脫毒長期飼喂畜禽，則很易引起中毒甚至死亡，嚴(yán)重降低飼用價值[4-5]。目前，降解棉酚的方法主要有化學(xué)法、物理法和微生物發(fā)酵法等，其中微生物發(fā)酵法可以將棉酚轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，達(dá)到脫毒目的，既不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物，又可提高粗飼料的營養(yǎng)價值，增加適口性和采食量，是目前普遍認(rèn)為的成本低、效果好、較安全的脫毒方法[6-8]。但不同微生物菌種對棉酚的降解能力有較大的差異，篩選優(yōu)良的微生物菌種是影響棉籽餅粕脫毒效果和營養(yǎng)價值的首要步驟。

中性蛋白酶主要作用為在中性條件下水解蛋白質(zhì)的肽鍵，釋放氨基酸或者多肽，最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于生產(chǎn)的工業(yè)酶制劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面[9]，近年來更發(fā)展出許多新的用途[10-11]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）是美國食品藥物管理局公布的安全菌種[12]，是當(dāng)今工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌種之一，是工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的菌種之一，其產(chǎn)中性蛋白酶能力為芽孢菌生長的主要的考察指標(biāo)[13]。據(jù)報道，枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕，特別是加入木瓜蛋白酶后可有效提高棉粕的營養(yǎng)價值[14]。目前報道的用于棉籽餅粕脫毒的芽孢菌的相關(guān)研究有枯草芽孢桿菌菌株M-9[15]和菌株M-4[16]，這兩株菌對棉酚具有較高的降解活性。乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能性飼料，具有氣味香、適口性好、飼喂簡單方便、消化率高、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價值[17-18]。但是兩種菌單獨發(fā)酵時也存在一定不足，如枯草芽孢菌發(fā)酵過程中脫羧或脫氨作用會產(chǎn)生有機(jī)酸和氨氣，會有刺鼻的氨味，乳酸菌降解棉酚效果不顯著等。本研究旨在利用芽孢桿菌和乳酸桿菌對棉粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，充分利用兩種菌的優(yōu)勢，達(dá)到降低棉酚含量，同時提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品質(zhì)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵原材料及菌株

棉粕由新疆泰昆生物集團(tuán)提供，粉碎過40目篩。

芽孢桿菌（Bacillus）菌株：BLCC1-0039、BLCC1-0090、BLCC1-0157和BLCC1-0169；乳酸桿菌（Lactobacillus）菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111，均由山東寶來利來生物工程股份有限公司保存。中性蛋白酶（酶活性50 000 U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值6.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實業(yè)有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80、氫氧化鈉、磷酸、氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司；以上試劑均為分析純。乙腈、丙酮（色譜級）、甲醇（色譜級）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；微孔濾膜（直徑13mm、孔徑0.45μm）：上海安譜有限公司；棉酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司。蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LDE-2A低速離心機(jī)：北京時代北利離心機(jī)有限公司；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SB1200超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備

取經(jīng)過兩次活化的芽孢菌斜面一環(huán)于裝有100 mL酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，待用。取經(jīng)過兩次活化的乳酸菌斜面一環(huán)于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)24 h待用。

1.3.2 芽孢桿菌的篩選

生料發(fā)酵。稱取一定量的基料于1 000 mL三角瓶中，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量100 g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的芽孢菌種子液，每個樣品設(shè)3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24h和48h取樣，測定發(fā)酵樣芽孢菌活菌數(shù)、中性蛋白酶活性及棉酚含量。優(yōu)選芽孢菌活菌數(shù)較高、產(chǎn)中性蛋白酶活性較高并能有效降解棉酚含量的菌株。

1.3.3 乳酸桿菌的篩選

生料發(fā)酵。稱取一定量的基料裝袋，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量100 g/袋，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的乳酸菌種子液，密封。每個樣品設(shè)3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣，測定發(fā)酵樣乳酸菌活菌數(shù)、pH值及棉酚含量。優(yōu)選乳酸菌活菌數(shù)較高且pH值較低的菌株。

1.3.4 棉粕中添加不同濃度中性蛋白酶發(fā)酵

生料發(fā)酵。稱取一定量的基料裝袋，裝量100 g/袋，設(shè)置中性蛋白酶濃度梯度為0、1 000 U/g、2 000 U/g、4 000 U/g和8 000 U/g基料，按照料水比1∶0.4（g∶mL）先溶解中性蛋白酶，完全加入基料中，混勻，密封。每個樣品設(shè)3個平行，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣，測定發(fā)酵樣棉酚含量。

1.3.5 乳酸菌加中性蛋白酶發(fā)酵

生料發(fā)酵。稱取一定量的基料裝袋，裝量100 g/袋，根據(jù)1.3.4種篩選的最優(yōu)中性蛋白酶添加量1 000 U/g基料，按照料水比1∶0.4（g∶mL）先溶解中性蛋白酶，完全加入基料中，混勻，密封。每個樣品設(shè)3個平行，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h和48 h取樣，測定發(fā)酵樣乳酸菌活菌數(shù)、pH值及棉酚含量。

1.3.6 測定指標(biāo)及方法

（1）pH值的測定

取10g樣品加入90mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

（2）芽孢桿菌和乳酸桿菌活菌數(shù)的測定

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵棉粕10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計算樣品中芽孢桿菌和乳酸桿菌活菌數(shù)，結(jié)果用CFU/g發(fā)酵料表示。

（3）中性蛋白酶活性的測定

取發(fā)酵棉粕1.0 g，采用福林-酚試劑法測定樣品中中性蛋白酶活性。中性蛋白酶酶活定義：1g固體酶粉（或1mL液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位，以U/g表示。

（4）棉酚含量的測定[19]

棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶解得到1.21 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，貯備液再用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）稀釋成121 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。用流動相將標(biāo)準(zhǔn)品工作液逐級稀釋得到質(zhì)量濃度分別為61.50 μg/mL、20.17 μg/mL、5.04 μg/mL、2.52 μg/mL和1.21 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積（X）和質(zhì)量濃度（Y）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.000 005 45X+0.160 525（R2≥0.999 96），線性范圍為1.21～121.00 μg/mL。

待測樣品游離棉酚的提取：準(zhǔn)確稱取待測樣品3.00 g，加入丙酮30 mL，超聲提取30 min，3 000 r/min 25℃離心10 min，重復(fù)提取3次，合并上清液。全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液溶解，多次超聲清洗轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）測定。棉酚含量計算公式如下：

式中：c為棉酚溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；m為樣品質(zhì)量，g。高效液相色譜（HPLC）法測定棉酚含量：色譜柱為Intertsil RODS-2（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長235 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25℃。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用ANOVA進(jìn)行方差分析，最小顯著差異法（leastsignificantdifference，LSD）法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的篩選

不同芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響見表1。由表1可知，除菌株BLCC1-0040在發(fā)酵24 h和48 h時活菌數(shù)在108CFU/g水平外，其余菌株均在109CFU/g水平，48 h時菌株BLCC1-0039、BLCC1-0157和BLCC1-0169均達(dá)到1010CFU/g水平，且各取樣時間點的中性蛋白酶活性也均在1 000 U/g以上，以菌株BLCC1-0039最高，發(fā)酵24 h時，中性蛋白酶活性高達(dá)2 811 U/g，顯著高于其他組（P＜0.05），棉酚含量最低，降解率達(dá)到85.89%，其次為菌株BLCC1-0157，中性蛋白酶活性為1 716 U/g，棉酚降解率為81.95%，均顯著高于其他三組菌株發(fā)酵（P＜0.05）。發(fā)酵48 h時，菌株BLCC1-0039產(chǎn)中性蛋白酶活性達(dá)到2 303.24 U/g，棉酚降解率達(dá)91.47%，與其他菌株發(fā)酵差異顯著（P＜0.05）。綜上所述，芽孢桿菌BLCC1-0039產(chǎn)中性蛋白酶活性高、降解棉酚能力強(qiáng)，最適宜發(fā)酵棉粕。

表1 不同芽孢桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響Table 1 Effect ofBacillusspp.on fermented feed quality

2.2 乳酸桿菌的篩選

表2 不同乳酸桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響Table 2 Effect ofLactobacillusspp.on fermented feed quality

不同乳酸桿菌發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響見表2。由表2可知，發(fā)酵24 h時除菌株BLCC2-0112活菌數(shù)在108CFU/g水平外，其余菌株均在109CFU/g水平，差異不顯著（P＞0.05）；pH值方面，發(fā)酵24 h時菌株BLCC2-0092和BLCC2-0001發(fā)酵的飼料pH值最低，分別為5.47和5.49，其次為菌株BLCC2-0015（5.77），48 h時三株菌發(fā)酵棉粕的pH均降至5.00以下，其中菌株BLCC2-0092發(fā)酵48 h時最低達(dá)到4.67；棉酚含量方面，各菌株間差異不顯著（P＞0.05），與對照相比幾乎均沒有降解棉酚的能力。綜合發(fā)酵活菌數(shù)和降低pH值結(jié)果來看，乳酸桿菌BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015較適宜發(fā)酵棉粕，其次為菌株BLCC2-0111。

2.3 中性蛋白酶對棉酚含量的影響

由表3可知，添加中性蛋白酶發(fā)酵棉粕降低了棉酚含量，24 h時，中性蛋白酶添加量1 000 U/g時棉酚降解率已達(dá)到58.46%；2 000 U/g的添加量時棉酚降解率最高，達(dá)到72.68%；超過2 000 U/g時，棉酚降解率并沒有隨著中性蛋白酶添加量的升高而繼續(xù)升高。48 h時，1 000 U/g時棉酚降解率最高為73.29%。說明適量中性蛋白酶的添加可有效降解棉酚，1 000 U/g的中性蛋白酶添加量已達(dá)到較優(yōu)效果。

表3 不同中性蛋白酶添加量發(fā)酵對棉粕中棉酚含量的影響Table 3 Effect of neutral protease addition on fermented feed quality

2.4 乳酸桿菌加中性蛋白酶發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響

乳酸桿菌加中性蛋白酶（1 000 U/g）發(fā)酵棉粕對棉酚含量的影響見表4。由表4可知，添加中性蛋白酶的乳酸桿菌發(fā)酵有效降解了棉粕中棉酚含量，菌株BLCC2-0092降解棉酚效果較好，24 h時棉酚降解率達(dá)到67.13%，其次為菌株BLCC2-0001，棉酚降解率為60.43%，均顯著高于菌株BLCC2-0015（P＜0.05）和BLCC2-0111（P＜0.05），后兩者的棉酚降解率也達(dá)到了47.0%以上；48 h時，四株乳酸桿菌棉酚降解率均在50%以上，均優(yōu)于乳酸菌單獨發(fā)酵時的棉酚降解率（見表2）?；罹鷶?shù)在109CFU/g水平，以菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092發(fā)酵的活菌數(shù)較高。pH值方面，菌株BLCC2-0001和BLCC2-0092較低，發(fā)酵24 h時pH值分別為4.62和4.71，顯著低于其他兩株（P＜0.05）。

表4 乳酸桿菌加中性蛋白酶發(fā)酵棉粕對飼料品質(zhì)的影響Table 4 Effect ofLactobacillusspp.with neutral protease on fermented feed quality

綜上所述，添加中性蛋白酶的乳酸桿菌發(fā)酵可有效降解棉粕中棉酚含量，菌株BLCC2-0092添加1000U/g的中性蛋白酶發(fā)酵24 h時棉酚降解率為67.13%，pH值為4.71，效果最優(yōu)。

3 結(jié)論

本實驗旨在利用芽孢桿菌和乳酸桿菌發(fā)酵棉粕，研究對棉粕中游離棉酚降解率及飼料品質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)：芽孢桿菌發(fā)酵棉粕降解棉酚效果與菌株產(chǎn)中性蛋白酶的高低有關(guān)，棉酚降解率最優(yōu)的芽孢桿菌為BLCC1-0039，37℃發(fā)酵24 h時，棉酚降解率已達(dá)到85.89%，產(chǎn)中性蛋白酶活性達(dá)到2 811.00 U/g發(fā)酵料；發(fā)酵48 h時，產(chǎn)中性蛋白酶活為2 303.24 U/g，棉酚降解率達(dá)91.47%，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。芽孢桿菌發(fā)酵棉粕可產(chǎn)生降解棉酚的物質(zhì)，其中中性蛋白酶起著重要作用：單獨添加中性蛋白酶發(fā)酵24 h時，1 000 U/g的添加量棉酚降解率已達(dá)到58.46%，2 000 U/g的添加量時棉酚降解率達(dá)到72.68%；48 h時，1000U/g中性蛋白酶添加量的棉酚降解率最高為73.29%。乳酸桿菌無降解棉酚的能力，但乳酸桿菌BLCC2-0092添加1 000 U/g的中性蛋白酶發(fā)酵24 h時，棉酚降解率達(dá)到67.13%，pH值降至4.71。

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Degradation of cottonseed meal gossypol by neutral protease

QI Xiuye,XIE Quanxi,CHEN Zhen,YU Jiamin,ZENG Jiajia,XU Haiyan,GU Wei
(Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

UsingBacillusandLactobacillusto ferment cottonseed meal,the effects of strains on the degradation rate of free gossypol and feed quality was studied.Results indicated that withBacillusBLCC1-0039 cultured at 37℃for 24 h,the degradation rate of gossypol was 85.89%(P＜0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 811.40 U/g(P＜0.05).With fermentation for 48 h,the degradation rate of gossypol was 91.47%(P＜0.05),and the activity of neutral protease was up to 2 303.24 U/g.With the addition of 1 000 U/g neutral protease individually for 24 h fermentation,the degradation rate of gossypol was 58.46%,however,with the addition of 2 000 U/g neutral protease individually,the degradation rate of gossypol reached 72.68%.With the addition of 1 000 U/g neutral protease for 48 h fermentation,the degradation rate of gossypol reached 73.29%.Lactobacillus sp.can not degrade gossypol,but after the strain BLCC2-0092 fermentation with 1 000 U/g neutral protease for 24 h,the gossypol degradation rate reached 67.13%,pH value decreased to 4.71.

neutral protease;gossypol;cottonseed meal;Bacillus;Lactobacillus

TQ920.6

0254-5071（2017）10-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.030

2017-05-04

泰安市科技發(fā)展計劃（201540701）

亓秀曄（1987-），女，助理研究員，碩士，主要從事動物微生態(tài)制劑研發(fā)工作。