（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚原料藥的穩(wěn)定性研究

張歡，唐輝，劉艷芳，吳旭東，陳歡

（石河子大學藥學院／新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，石河子832002）

棉酚（Gossypo1）又稱棉籽醇，是天然存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉莖以及根部等器官中的一種黃色多元酚類化合物，本身為消旋體，其分子中兩個萘環(huán)之間存在阻轉異構現(xiàn)象，具有手性軸，有左、右旋體［1］。棉酚具有抗腫瘤、抗病毒和抗菌等作用［2－4］。現(xiàn)有的研究已表明棉酚的藥理作用與其分子手性結構相關，（－）－棉酚的活性比（＋）－棉酚強，（－）－棉酚是（±）－棉酚的主要藥用活性成分，其對細胞的敏感性及對細胞的殺傷作用是（±）－棉酚的5倍多［5］，且毒副反應?。?］。棉酚分子中的酚羥基極易氧化而降低其藥用活性，故常將棉酚與冰醋酸絡合形成更穩(wěn)定、更利于保存和運輸?shù)拇姿崦薹优浜衔铮壳耙焉鲜械拿薹又苿┮喽酁榇姿崦薹悠瑒?/p>

關于棉酚及其衍生物穩(wěn)定性的研究較少［7］，本課題組已報道［8］棉酚原料藥的穩(wěn)定性，本文旨在考察熱、濕、光對高活性的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚原料藥穩(wěn)定性的影響，為該藥原料標準制定新制劑的研究奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器

美國Agilent 1100高效液相色譜儀；德國SartoriusBP211D電子天平；北京泰克X－5型顯微熔點測定儀；寧波東南RXZ－300C型智能人工氣候箱；法國MOS 450圓二色譜儀；美國Autopol V旋光儀。

1．1．2 試藥

棉酚對照品（美國SIGMA公司，含量95%，Lot 20k4057）；（－）－棉酚樣品3批（自制）；（－）－醋酸棉酚樣品3批（自制）；（＋）－棉酚樣品（自制）；（＋）－醋酸棉酚樣品（自制）；磷酸、甲醇、氯仿（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；水為重蒸水。

1．2 方法

1．2．1 熔點測定

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，以 X－5型顯微熔點測定儀（使用前已校正）測定，每份樣品重復測定3次。

1．2．2 比旋度測定

精密 稱 取 （－）－棉 酚 及 （－）－醋 酸 棉 酚 樣 品 各 9 mg，置于10mL容量瓶中，以重蒸氯仿溶解并定容，搖勻，以旋光儀測定。

1．2．3 旋光特性

精密稱?。ǎ薹印ⅲǎ姿崦薹?、（＋）－棉酚及（＋）－醋酸棉酚樣品各2mg，置于25mL容量瓶中，以重蒸氯仿溶解并定容，搖勻，以圓二色譜儀測定。

1．2．4 色譜條件

色譜柱為 Wondasil C18Column（4．6mm×150 mm，5μm），流動相為甲醇：0．7%磷酸水＝85∶15，流速1．0mL／min，檢測波長238nm，柱溫25℃，進樣量20μL。

1．2．5 色譜條件的方法學考察

1．2．5．1 標準曲線

精密稱取棉酚對照品12．50mg，置于50mL容量瓶中，甲醇溶解定容，搖勻，作為對照品溶液。分別精密移取對照品溶液1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0 mL置于25mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，成為標準系列溶液。各取20μL，注入 HPLC儀，記錄色譜圖。

1．2．5．2 精密度及回收率試驗

取質量濃度為30μg／mL的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，計算精密度。精密稱取已知含量的（－）－棉酚樣品（批號：100123），分別加入相對于樣品含量80%、100%、120%3種不同比例的對照品及甲醇。平行操作3次，計算加樣回收率。

1．2．5．3 樣品含量測定

精密 稱 取 （－）－棉 酚 及 （－）－醋 酸 棉 酚 樣 品 各 5 mg，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解定容，移取0．6 mL置于10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，成為樣品溶液。按標準曲線繪制項下方法操作，根據(jù)標準曲線計算含量。

1．2．6 穩(wěn)定性試驗

1．2．6．1 高溫試驗

取精密稱重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品，置已知質量的稱量瓶中（去蓋），鋪成5mm厚的薄層，置人工氣候箱內，于40℃恒溫條件下放置10d，分別在第5天、第10天取樣考察。

1．2．6．2 高濕試驗

取精密稱重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品，置已知質量的稱量瓶中（去蓋），鋪成5mm厚的薄層，置人工氣候箱內，于相對濕度75%、溫度25℃條件下放置10d，分別在第5天、第10天取樣考察。

1．2．6．3 強光照試驗

取精密稱重后的（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚樣品，置已知質量的稱量瓶中（去蓋），鋪成5mm厚的薄層，置人工氣候箱內，于光照照度4500Lx±500Lx條件下放置10d，分別在第5天、第10天取樣考察。

1．2．6．4 長期試驗

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，真空封裝于錫箔包裝紙內，置人工氣候干燥箱內，于溫度40℃，相對濕度RH75%條件下放置6個月，每個月取樣測定。

1．2．6．5 加速試驗

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，真空封裝于錫箔包裝紙內，置人工氣候干燥箱內，于溫度25℃，相對濕度RH60%條件下放置6個月，每個月取樣測定。

1．2．6．6 留樣考察

?。ǎ薹蛹埃ǎ姿崦薹訕悠愤m量，真空封裝于錫箔包裝紙內，置于冰箱中（5℃）冷藏放置6個月，每個月取樣測定。

2 結果

2．1 理化性質

2．1．1 性狀

（－）－棉酚為黃色粉末，（－）－醋酸棉酚為棕黃色粉末。

2．1．2 熔點

（－）－棉酚的熔點為180．0～182 ℃，（－）－醋酸棉酚的熔點為176．5～178．2℃。

2．1．3 旋光度

（－）－棉酚的比旋度［α］20D＝－353，（－）－醋酸棉酚的比旋度［α］20D＝－80．3。（－）－棉酚的比旋度值與文獻報道（［α］15D＝－354．2）相近［8］，（－）－醋酸棉酚的比旋度值未見報道。

2．1．4 旋光特性

圓二色譜圖見圖1、圖2。由圖可知（－）－棉酚與（＋）－棉酚、（－）－醋酸棉酚與（＋）－醋酸棉酚的圓二色譜圖均呈鏡像關系，對應波長處的Cotton效應相 反，說明兩兩互為對映異構體。

圖1 （＋）－棉酚和（－）－棉酚 CD圖譜Fig．1CD chromatogram of（＋）－gossypol and（－）－gossypol

圖2 （＋）－醋酸棉酚和（－）－醋酸棉酚 CD圖譜Fig．2CD chromatogram of（＋）－gossypol acetic acid and（－）－gossypol acetic acid

2．2 含量測定

2．2．1 標準曲線

其液相色譜圖見圖3。

圖3 棉酚HPLC色譜圖Fig．3HPLC chromatogram of gossypol

以對照品濃度作為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程y＝149．71x－422．3，R2＝0．9992，結果表明（－）－棉酚質量濃度為10～60μg／mL時線性關系良好，棉酚的保留時間約為8．2min。

2．2．2 精密度及回收率結果

精密度RSD＝0．1%（n＝5）；平均回收率為99．55%，RSD 為0．79%。

2．3 穩(wěn)定性［9－10］

2．3．1 高溫試驗

第5天、第10天時樣品性狀無變化且未發(fā)生消旋化，含量、熔點及比旋度變化見表1?？梢姌悠穼Ω邷夭环€(wěn)定。

表1 高溫試驗n＝3Tab．1The experiment of high temperature condition

2．3．2 高濕試驗

第5天、第10天時樣品性狀無變化且未發(fā)生消旋化，含量、熔點及比旋度變化見表2。可見樣品對高濕不穩(wěn)定。

表2 高濕試驗n＝3Tab．1The experiment of high wet condition

2．3．3 強光照射試驗

第5天、第10天時樣品性狀無變化且未發(fā)生消旋化，含量、熔點及比旋度變化見表3?？梢姌悠穼姽獠环€(wěn)定。

表3 強光照射試驗n＝3Tab．3The experiment of highlight condition

2．3．4 加速試驗

樣品的外觀性狀無變化且未發(fā)生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分別下降了7．87%和3．76%，說明樣品對濕熱相對不穩(wěn)定。

2．3．5 長期試驗

樣品的外觀性狀無變化且未發(fā)生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分別下降了4．15%和1．87%，說明樣品對濕熱相對不穩(wěn)定。

2．3．6 留樣考察

樣品的外觀性狀無變化且未發(fā)生消旋化，（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚的含量分別下降了1．47%和0．43%，說明樣品在該條件下相對穩(wěn)定，且（－）－醋酸棉酚比（－）－棉酚穩(wěn)定。

3 討論

以 HPLC法定量時，（±）－棉酚、（－）－棉酚及（－）－醋酸棉酚的出峰時間一致，故以（±）－棉酚作對照品測含量。（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚為本實驗室自制，薄層顯示為一個斑點，經質譜MS和核磁共振NMR的結構鑒定，結果與文獻報道［11］一致。

本試驗以棉酚穩(wěn)定性研究的報道為基礎，考察了（－）－棉酚和（－）－醋酸棉酚原料藥的穩(wěn)定性，選用了專屬性更強，靈敏度更高的HPLC法檢測其含量變化，結果更準確。

由穩(wěn)定性試驗結果可看出，樣品在高溫、高濕、強光照射條件下均不穩(wěn)定，含量明顯下降；在長期、加速試驗條件下含量下降較少；在避光冷藏條件下相對穩(wěn)定，故在生產應用中樣品應置于避光、陰涼、干燥處保存。

［1］James A K．Reaction chemistry of gossypol and its derivatives［J］．JAOCS，2006，83（4）：269－302．

［2］Baram N I，Ismailov A I，Ziyaev K L，et al．Biological activity of gossypol and its derivatives［J］．Chemistry of Natural Compounds，2004，40（3）：199－205．

［3］Turco E，Vizzuso C，F(xiàn)ranceschini A，et al．The in vitro effect of gossypol and its interaction with salts on conidial germination and viability of Fusarium oxysporum sp．vasinfectum isolates［J］．Journal of Applied Microbiology，2007，103（6）：2370－2381．

［4］Catherine V P，Andrew D S，Marcus M R，et al．Oral gossypol in the treatment of patient with refractory metastatic breast cancer：A phase I／II clinical trial［J］．Breast Cancer Research and Treatment，2001，66（3）：239－248．

［5］Blackstaffe L，Shelley M D，F(xiàn)ish R G．Cytotoxicity of gossy－pol enantiomers and its quinone metabolite gossypolone in melanoma cell lines［J］．Melanoma Res，1997，7（5）：364－372．

［6］Liu S，Kulps K，Sugimoto Y，et al．The （－）－enantiomer of gossypol possesses highter anticancer potency than racemic gossypol in human breast cancer［J］．Anticancer Res，2002，22（1）：33－38．

［7］陸蓮英．影響棉酚穩(wěn)定性的若干因素［J］．中國棉花，1989（1）：22－24．

［8］黃洪勇，唐輝，關麗，等．棉酚原料藥的理化性質及穩(wěn)定性研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2010，21（2）：309－310．

［9］Jiang H X，Cao X X，Huang H，et al．An expedient route for the practical preparation of optically active（－）－gossypol［J］．Tetrahedron：Asymmetry，2007，18（20）2437－2441．

［10］蘇志德．醋酸艾司利卡西平片的制備及其穩(wěn)定性研究［J］．中國藥房，2010，21（37）：3509－3510．

［11］Jiang H X，Zhang L．Chiral gossypol derivatives：evaluation of their anticancer activity and molecular modeling［J］．European Journal of Medicinal Chemistry，2009，44（10）：3961－3972．