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    同步提取棉花DNA和RNA的方法

    2011-01-11 02:56:34朱新霞艾尼江閆潔趙海
    關(guān)鍵詞:分子生物學(xué)離心管條帶

    朱新霞,艾尼江,閆潔,趙海

    (1石河子大學(xué)生命科學(xué)院,石河子832000;2新疆石河子棉花所,石河子832000)

    棉花(Gossypiumspp.)組織中富含多糖、脂類以及多酚、色素等次生代謝物質(zhì),這些物質(zhì)在DNA和RNA提取過程中較難以去除干凈,其以不同方式干擾DNA和RNA的提取。目前應(yīng)用于棉花總DNA提取的方法主要有SDS法、CTAB法、PVP40法、氯仿-異戊醇法、β-巰基乙醇法、改良Trizol法以及 DNA 提取試劑盒[1-5],應(yīng)用于棉花總 RNA 提 取的方法主要有異硫氰酸胍法、冷酚法、SDS/酸酚法、高鹽高pH值提取法、CTAB/酸酚法、RNA提取試劑盒[6-10],這些方法(除試劑盒)雖能提取出棉花的DNA或RNA,但提取步驟比較繁雜,所耗試劑較多、提取周期比較長,有的甚至還需要2d。試劑盒相比而言操作簡便、能快速提取棉花組織的DNA或RNA,但產(chǎn)率低且價(jià)格昂貴,提取成本較高,對(duì)于樣品數(shù)量較少的樣本和樣品種類較多的實(shí)驗(yàn)材料局限性較大。

    為節(jié)約樣品數(shù)量、降低成本、簡捷快速地提取棉花DNA與RNA,本實(shí)驗(yàn)以棉花幼苗為試材,通過對(duì)棉花基因組DNA或RNA提取方法的比較分析,針對(duì)棉花富含酚類、多糖、單寧等次生物質(zhì)的特點(diǎn),借鑒前人提取DNA和RNA的方法,通過改進(jìn)常規(guī)試劑CTAB法提取程序和相關(guān)技術(shù)參數(shù),摸索出一套簡便、快速、低成本的高純度棉花DNA和RNA同步提取的方法,以期為棉花分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)材料為室內(nèi)培養(yǎng)的高度約20cm的雜交棉及其親本幼苗,分別取其頂端葉片貯存于-80℃超低溫冰箱中備用。所用試劑中,焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,DEPC)、β-巰 基 乙 醇 (β-mercaptoethanol)購自Amresco公司,十六烷基三甲基溴化胺(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)、聚乙烯吡咯烷酮(polywiny pyrro lidone40,PVP40)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)等均購自上海生工公司,其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    所用試劑和塑料耗材均需預(yù)先用0.1%DEPC處理24h后高溫滅菌,研缽等物品則經(jīng)180℃高溫烘烤2h以上,以避免RNase的污染。

    1.2 方法

    1)取1g左右的棉花新鮮幼嫩組織,加液氮充分研磨呈粉末狀,及時(shí)轉(zhuǎn)移到10mL離心管中,加5 ml的提取緩沖液(1.4mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl(pH=8.0),20mmol/L EDTA,2%CTAB,2%PVP,1%β-巰基乙醇),振蕩混勻,65℃水浴約20min,中間混合2~3次;

    2)加0.6倍體積的氯仿,充分混勻,然后冰浴靜置10min;4℃,8000r/min離心20min,將上清液轉(zhuǎn)移到另一新10mL離心管中,加入1/3倍體積的8mol/L的LiCl溶液,顛倒混勻,-20℃靜置2 h,4℃,8000r/min離心20min,將上清和沉淀分置2個(gè)離心管中;

    3)在上清液離心管中,加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻,絮狀DNA用玻璃棒攪出,用70%乙醇重懸洗滌2次絮狀DNA后,加5mL dd H2O溶解,再加入0.6倍體積氯仿:異戊醇(24∶1),震蕩混勻,4℃靜置片刻,8000r/min離心15min,取上清加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻,于-20℃靜置1h,絮狀DNA用玻璃棒攪出,用70%乙醇重懸洗滌2次,5000r/min離心5min,吸去殘余水滴,待干后加入適量TE+RNase A溶液(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0,1mmol/L EDTA pH 8.0,RNase A終濃度為100μg/mL),37℃水浴中溫育溶解,取2μL檢測DNA質(zhì)量(1μL用于0.8%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳,1μL用于分光光度計(jì)測吸光值),剩余DNA放于-70℃冰箱保存。

    4)在2)棄去上清溶液的離心管中用70%乙醇洗滌沉淀2次,真空抽干后加入50μL無RNase的dd H2O充分溶解并轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中;

    5)總RNA中DNA的消化,反應(yīng)體系如下:總RNA(10~100μg),RNA 酶抑制劑(20U),不含RNA酶的DNA酶I(10U),5×DNDNase 1Buffer(10μL),用無 RNase的ddH2O補(bǔ)至總體積500 μL,37℃溫育20min,加入500μL酚/氯仿(1∶1),漩渦混勻,4℃靜置片刻,12000r/min離心15min;將上清移至一干凈的微量離心管中,加入等體積氯仿,振蕩,4℃靜置片刻,12000r/min離心15min;取上清加入3mol/L pH 5.2的乙酸鈉、2倍體積的無水乙醇,-70℃放置30min~2h,12000r/min離心10min,棄上清,用500μL 70%乙醇洗滌沉淀2次,真空抽干,用35μL無RNase的ddH2O溶解沉淀,取2μL檢測RNA質(zhì)量(1μL用于1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳,1μL用于分光光度計(jì)測吸光值),剩余RNA放于-70℃冰箱保存。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總DNA和RNA的質(zhì)量檢測

    瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明:此方法所提取的總DNA都比較完整(圖1),所提的總RNA可明顯看到28S、18S條帶,條帶整齊一致,28S亮度明顯高于18S(圖2),表明RNA降解很少,保持了RNA較好的完整性。

    圖1 棉花總DNAFig.1 The total DNA from cotton

    圖2 棉花總RNAFig.2 The total RNA from cotton

    此方法所提總DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測,發(fā)現(xiàn)OD260/280值均為1.7~1.85,說明此方法所提總DNA無糖類、酚及蛋白質(zhì)等的污染,與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相符;所提總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測,OD260/280值均為1.85~1.99,表明此方法所提總RNA無DNA或蛋白質(zhì)污染;OD260/OD230值均大于2.0,表明此方法可較有效地去除多糖等雜質(zhì)。

    2.2 總DNA的PCR檢測

    擴(kuò)增檢測。SSR研究主要參考文獻(xiàn)[11]中的方法;AFLP研究主要參考參照文獻(xiàn)[12-14]中的方法,并稍作調(diào)整。

    結(jié)果(圖3、4)表明:用該法提取的總DNA用于SSR和AFLP擴(kuò)增,均可擴(kuò)增出清晰的條帶且穩(wěn)定性好,這表明用該法提取的總DNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求,可作為分子標(biāo)記應(yīng)用在棉花分子生物學(xué)研究中。

    本研究直接用所提總DNA進(jìn)行SSR和AFLP

    圖3 SSR檢測Fig.3SSR amplification results from DNA

    圖4 AFLP檢測(HpaⅡ、MspⅠ酶切后擴(kuò)增條帶)Fig.4AFLP amplification results from DNA

    2.3 總RNA的PCR檢測

    RT-PCR方法是檢測RNA質(zhì)量的良好方法,多糖等雜質(zhì)的污染將抑制RNA的反轉(zhuǎn)錄[4],擴(kuò)增基因的完整編碼區(qū)需要有良好的RNA完整性,即便微量的降解也會(huì)使mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA長度大大減小,導(dǎo)致RT-PCR的失敗。因此,為了更加準(zhǔn)確地了解該法提取的總RNA是否能滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求,本研究選擇1對(duì)在棉花各組織cDNA中都可擴(kuò)增出500bp產(chǎn)物的棉花組成型表達(dá)基因 EF1α的引物(F:5′-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3′,5′-CCACCAATCTTGTACACATCC-3′)對(duì)所提RNA 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RTPCR檢測,瓊脂糖電泳檢測在預(yù)期500bp處出現(xiàn)亮的條帶(圖5),同時(shí)參照文獻(xiàn)[15-17]中的方法對(duì)所提RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行cDNA-AFLP擴(kuò)增檢測(圖6),也得到了清晰穩(wěn)定的條帶,證實(shí)本研究制備的RNA的完整性好,并且純度較高,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作的要求。

    圖5 RT-PCR檢測Fig.5RT-PCR amplification results from RNA Fig

    圖6 cDNA-AFLP檢測(2對(duì)引物擴(kuò)增條帶)Fig.6cDNA-AFLP amplification results from RNA

    3 討論

    棉花富含多糖、酚類、單寧等次生物質(zhì),如多糖、脂類的存在會(huì)使DNA、RNA的溶解度降低,同時(shí)還可以抑制許多工具酶的活性,多酚、色素等物質(zhì)在提取過程中很容易被氧化導(dǎo)致DNA、RNA變褐活性喪失,影響DNA、RNA用于進(jìn)一步的分子操作,因此能否在提取過程中盡量去除這些干擾物質(zhì)是獲得高質(zhì)量棉花總DNA、RNA的關(guān)鍵。高質(zhì)量的棉花組織總DNA和RNA的成功提取又是順利進(jìn)行文庫和遺傳圖譜構(gòu)建,基因克隆、表達(dá)和調(diào)控及遺傳轉(zhuǎn)化分析等棉花分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。

    CTAB是一種去污劑,它能夠溶解細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì),使細(xì)胞破裂,并與細(xì)胞內(nèi)的核酸形成核酸-CTAB復(fù)合物[18],這種復(fù)合物在沉淀的時(shí)候把蛋白、多糖、色素以及多酚類化合物與核酸徹底的分離開來,此外與提取緩沖液中的EDTA一起,共同保護(hù)DNA免受內(nèi)源核酸酶的降解。提取液中的β-巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加,其作為強(qiáng)還原劑能防止多酚被氧化,同時(shí)提取液中含有的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40),可與酚類化合物形成鰲合物,阻止其成為多酚氧化酶的底物而被氧化,使之不能與核酸結(jié)合,保證核酸的質(zhì)量;提取液中高濃度的NaCl有利于降低多糖的含量[4];核酸(DNA、RNA)在細(xì)胞內(nèi)部主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物的形式存在,因此分離DNA、RNA時(shí)必須使其與蛋白質(zhì)解離,并除去蛋白質(zhì)。除去蛋白質(zhì)主要用氯仿-異成醇混合液振蕩核蛋白溶液,使蛋白質(zhì)變性,然后通過離心分層,DNA和RNA溶于上層水相,而變性蛋白質(zhì)停留在水相及氯仿相中間而被除去;本研究在上述研究基礎(chǔ)上利用DNA和RNA在LiCl溶液中溶解度的差異將溶于上層水相的二者分離開來。在水相中加入LiCl溶液在-20℃放置一段時(shí)間后,RNA會(huì)特異性的沉淀下來,而DNA會(huì)繼續(xù)留在水相中,通過離心可使RNA分離出來。而留在上清液中的DNA會(huì)和預(yù)冷的異丙醇較快生成絮狀物被分離出來。提取步驟中使用的乙酸鈉和低濃度的乙醇,不僅可以幫助去除多糖,還可以去除色素類物質(zhì)[19]。

    在提取過程中為避免所提取的DNA中含有的少量RNA對(duì)下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的影響,可在加入TE溶液溶解DNA時(shí)同時(shí)加入RNase A(終濃度為100μg/mL)以除去RNA;同樣為避免所提取的RNA中含有的少量DNA對(duì)下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的影響,可加入不含RNA酶的DNase I除去DNA;為減少外源RNase對(duì)RNA的降解,試劑和塑料耗材需預(yù)先用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡處理24h后高溫滅菌,為避免內(nèi)源RNase對(duì)RNA的降解,可以加入適量的RNase抑制劑。同時(shí)整個(gè)提取過程中還應(yīng)注意避免過酸過堿或高溫環(huán)境,合適的溫度為0~4℃,pH 4~9,避免劇烈振蕩和防止機(jī)械力對(duì)DNA的切割作用;整個(gè)操作步驟應(yīng)盡量簡化,縮短實(shí)驗(yàn)過程,減少核酸變性、降解、機(jī)械切割的機(jī)會(huì)。

    與現(xiàn)有的棉花總DNA和RNA提取法相比,本方法所需用樣品數(shù)量、試劑、操作步驟、操作時(shí)間明顯減少,整個(gè)DNA和RNA提取工作可在1d內(nèi)完成。同步提取的棉花DNA和RNA,能滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)如 SSR、AFLP、RT-PCR、cDNAAFLP的要求,有效地節(jié)約了樣品數(shù)量和操作時(shí)間,降低了實(shí)驗(yàn)成本。

    4 結(jié)論

    本研究在借鑒各種植物DNA和RNA提取方法的基礎(chǔ)上,摸索出一套適合于棉花組織DNA和RNA同步提取的方法。該方法所用的都是常規(guī)試劑,不但操作簡單,易于重復(fù),同時(shí)還可節(jié)約樣品數(shù)量、試劑成本及提取時(shí)間,同步提取出的高質(zhì)量棉花

    DNA和RNA,能滿足許多后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求,對(duì)于樣品稀少珍貴的材料和樣本數(shù)量較多的研究尤為適用。此研究不僅為其它下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也可為其它多酚、多糖作物同步提取其DNA和RNA提供參考。

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