神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾胚胎脊髓神經(jīng)干細胞移植后脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)和損傷局部基因表達

解錦鼎　王龍　楊印東　俞春雷　栗昭生　安寧

[摘要] 目的 探究神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾胚胎脊髓神經(jīng)干細胞移植后脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)與損傷局部基因表達。方法 于2016年8月從孕18 d的30只大鼠胚胎腦部皮質(zhì)中提取適量的脊髓神經(jīng)干細胞，對其進行體外培養(yǎng)，然后采用巢蛋白免疫熒光染色方法進行鑒定，將鑒定后的胚胎脊髓神經(jīng)干細胞植入成年的大鼠損傷脊髓，并將其分為3組，對照組10只、神經(jīng)干細胞組10只、神經(jīng)干細胞加胚胎細胞衍生的神經(jīng)因子移植10只，對胚胎神經(jīng)干細胞的存活進行觀察分析，并對大鼠的損傷后的功能恢復(fù)情況以及局部基因表達進行比較分析。結(jié)果 經(jīng)過胚胎神經(jīng)干細胞移植后，7、21 d大鼠的運動功功能評分分別為（26.37±4.62）分、（39.55±2.42）分，對照組7、21 d的運動功能評分分別為（25.62±2.523）分、（32.43±2.46）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），脊髓損傷局部空洞面積也得到了減?。≒<0.05），在胚胎神經(jīng)干細胞中加入修飾胚胎脊髓的神經(jīng)營養(yǎng)因子后，大鼠的運動功能恢復(fù)與局部損傷基因狀況改善更加明顯，神經(jīng)干細胞不僅存活，而且能夠向損傷頭尾處遷移4 mm。結(jié)論 采用神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾胚胎脊髓神經(jīng)干細胞移植后，不僅能夠使神經(jīng)細胞存活，遷移，而且能促進大鼠功能的有效恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)營養(yǎng)因子；胚胎脊髓神經(jīng)干細胞；脊髓損傷；功能恢復(fù)

[中圖分類號] R446 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）09（b）-0001-03

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the functional recovery and damage of local gene expression in rats with spinal cord injury after transplantation of neurotrophic factor-modified embryonic spinal cord neural stem cells. Methods The spinal cord neural stem cells were extracted from the brain cortex of 30 rat embryos for 18 days from August 2016， and then cultured in vitro by nestin immunofluorescence staining. The embryonic spinal cord neural stem cells were implanted into adult rats. The adult rats were divided into three groups： the control group （n=10）， the neural stem cells （n=10）， the neural stem cells （MSCs） and embryonic cells （n=10）. The survival of embryonic neural stem cells was observed and analyzed. And the functional recovery of the rats after injury and the local gene expression were analyzed. Results After embryonic neural stem cells transplantation， the movement function score of rats after 7 days and 21 days were （26.37±4.62）points and （39.55±2.42）points respectively， and the control group in the movement of 7 days and 21 days were （25.62±2.523）points and （32.43±2.46）points respectively， the difference was statistically significant （P<0.05）， local cavity area of spinal cord injury was also decreased（P<0.05）； after adding modifiers in embryonic neural stem cells of embryonic spinal cord after neurotrophic factor， the improvement of rats motor function recovery and partial damage genetic was apparent， not only did the neural stem cells survive， but also damage could migrate 4 mm from the head and tail. Conclusion The use of neurotrophic factor modified embryonic spinal cord neural stem cell transplantation not only can make nerve cell survive and migrate， but also promote effective functional recovery in rats.

[Key words] Neurotrophic factor； Embryonic spinal cord neural stem cells； Spinal cord injury； Functional recoveryendprint

隨著我國社會主義現(xiàn)代化建設(shè)的不斷發(fā)展，我國的醫(yī)療衛(wèi)生水平得到了空前地提升。目前，神經(jīng)干細胞移植得到了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者的普遍關(guān)注，它主要致力于對脊髓損傷的治療，具有一定的發(fā)展前景[1]。然而，當(dāng)前的神經(jīng)干細胞移植后存在存活率低、療效不明顯等問題，而采用胚胎修飾的神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠?qū)顾钃p傷起到恢復(fù)作用[2]。該次研究于2016年8月對30只脊髓損傷大鼠的神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾胚胎脊髓神經(jīng)干細胞移植進行分析，觀察脊髓損傷大鼠移植后的功能恢復(fù)情況，為臨床醫(yī)學(xué)的神經(jīng)干細胞移植提供一個參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次研究選取了孕18 d的30只成年雌性wistar大鼠，將這30只大鼠分別分為3組，每組10只，一組為神經(jīng)干細胞組（NSC組）：重量在240～270 g之間，平均重量為（250±2.4）g，胚齡為13～16 d，平均為（14.6±1.5）d；一組為神經(jīng)干細胞加神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾（NSCs+GDNF組）：重量在235～270 g，平均為（254±3.2）g，胚齡為12～16 d，平均為（14.1±1.8）d；另一組則為對照組：重量在245～275 g之間，平均重量為（255±2.6）g，胚齡為13～15 d，平均為（14.4±1.6）d。3組大鼠在胚齡、重量等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。在實驗之前，先進行模型制作，采用2%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉術(shù)對大鼠進行麻醉，然后將動物的皮膚打開，對其進行肌肉分離，使動物的脊椎暴露，用醫(yī)學(xué)動脈夾對動物的脊髓持續(xù)5 s左右的夾擊，并用生理鹽水對動物的傷口進行沖洗，再將皮膚縫合，輔之以青霉素注射。飼養(yǎng)條件、飼料情況、護理條件均符合國際上擬定的動物公約[3]。

1.2 方法

首先從孕18 d的大鼠胚胎中提取大腦皮質(zhì)，并通過吹打使其成為單個分開的細胞，將這些細胞收集起來，1.5×105個/瓶，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)、2%N2以及5 μg/mL肝素要進行定時更換，以2次/周為宜，另外，要適當(dāng)增補FGF-2以及EGF，并對神經(jīng)球進行免疫鑒定。首先采用4%的多聚甲醛對神經(jīng)球進行固定，一般固定30 min即可，將30%的蔗糖經(jīng)過夜且為厚度在15 μm左右的切片，選用pH為7.4的洗滌液，封閉液則是由10%洗滌液與山羊血清組成，在37℃溫度下封閉1 h左右，然后去除封閉，施以nestin單抗5℃過夜，對對照組則加PBS，在次日進行濕盒內(nèi)37℃避光孵育，大概在45 min左右[4]。然后于載波片滴加適量的混合液，對其封閉，采用熒光鏡進行觀察，并將所拍攝圖片進行記錄。在進行移植前，對已鑒定過的前體細胞加以Hochest原液，在37℃的溫度下，用5%的二氧化碳進行1 h的孵育，再用培養(yǎng)液進行反復(fù)沖洗，將細胞重懸，并將其濃度進行調(diào)整，以1×104個細胞/U，將其置于冰中，做好移植前的準備。對照組在移植神經(jīng)干細胞時不包含營養(yǎng)因子，經(jīng)神經(jīng)干細胞加胚胎細胞衍生的神經(jīng)因子組加入修飾胚胎脊髓神經(jīng)因子。在移植的過程中要使動物的損傷脊髓充分暴露在視線內(nèi)，采用立體定位儀實現(xiàn)微玻管的固定，并在動物的脊髓損傷處注射細胞，然后立即對傷口處進行縫合，并注射抗菌藥物等，觀察動物的變化情況，待其醒后，移到動物房進行有效護理。

1.3 觀察指標

在實驗后1個月左右，對大鼠進行斜板實驗以及運動功能評分，主要觀察動物的臀、膝、踝關(guān)節(jié)等，觀察動物的協(xié)調(diào)功能，并采用BBB運動評分對其進行比較分析[4]。

1.4 統(tǒng)計方法

該次研究用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，所用的計數(shù)資料采用[n（%）]表示，用χ2來進行檢驗，用平均數(shù)±標準差（x±s）的形式表示計量資料，行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斜板實驗

在實驗后的2周左右，對實驗大鼠進行斜板實驗，移植術(shù)均符合模型的基本要求。在實驗4周后，這3組大鼠的實驗結(jié)果分別為：神經(jīng)干細胞組（35.63±0.52）分，神經(jīng)干細胞加修飾胚胎脊髓神經(jīng)營養(yǎng)因子組為（39.55±2.42）分，對照組則為（32.43±2.46）分，神經(jīng)干細胞組與另外兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且與神經(jīng)干細胞加修飾胚胎脊髓神經(jīng)營養(yǎng)因子組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 功能恢復(fù)評分測試

經(jīng)過平地場測試，對照組、神經(jīng)干細胞組以及經(jīng)干細胞加修飾胚胎脊髓神經(jīng)營養(yǎng)因子組的大鼠的得分依次為（5.12±0.45）分、（6.95±0.53）分、（8.73±0.24）分，經(jīng)干細胞加修飾胚胎脊髓神經(jīng)營養(yǎng)因子組的分值最高，與其他兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3 討論

近年來，神經(jīng)干細胞移植在臨床醫(yī)學(xué)中得到了廣泛地應(yīng)用。目前已經(jīng)研究出在胚胎、成年人的大腦與脊髓中都含有大量的胚胎神經(jīng)干細胞，它具有一定的特殊性，可以用于對神經(jīng)性疾病的有效治療[5-6]。該次實驗中選用的都是大鼠的胚胎神經(jīng)干細胞，在對干細胞進行培養(yǎng)的過程中可以發(fā)現(xiàn)胚胎神經(jīng)細胞具有一定的活性，且不容易分化，有一定的優(yōu)越性。該次研究采用動脈夾擊法創(chuàng)建了脊髓損傷的模型，這在一定程度上與臨床中的脊髓損傷者相似性，在對大鼠進行細胞移植的1個月后，可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞組能得到了存活，大鼠的運動功功能評分達到（39.55±2.42）分與對照組的（32.43±2.46）分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），脊髓損傷局部空洞面積也得到了減小（P<0.05），在胚胎神經(jīng)干細胞中加入修飾胚胎脊髓的神經(jīng)營養(yǎng)因子后，大鼠的運動功能恢復(fù)與局部損傷基因狀況改善更加明顯，神經(jīng)干細胞不僅存活，而且能夠向損傷頭尾處遷移4 mm，這很大程度上源于所移植的細胞向神經(jīng)原、星型細胞轉(zhuǎn)化，為軸突的再生提供必不可少的生長基質(zhì)。學(xué)者Shan Gao等人[7]在研究NSCs移植修復(fù)大鼠SCI中發(fā)現(xiàn)，NSCs在移植前處于克隆球階段能夠特異性的分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，在移植后亦通過ELISA免疫組織化學(xué)方法證實NSCs能持續(xù)上調(diào)包括GDNF在內(nèi)的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，由移植前的（2.43±1.36）分增高至（8.78±1.62）分，與該次研究結(jié)果一致。

綜上所述，神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾胚胎脊髓神經(jīng)干細胞移植后脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)與損傷局部基因表達有著明顯的效果，能夠促進大鼠運動功能的恢復(fù)，可以為臨床醫(yī)學(xué)提供一個有效的參考。

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（收稿日期：2017-06-12）endprint