LPS誘導鼠急性肺損傷模型的評價分析

溫保強　劉江華

【摘要】 急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是通過干擾與肺泡毛細血管屏障有關的臨床急危重癥。過去由于對ALI和ARDS機制研究不清、臨床上沒有針對性治療方法，導致疾病的死亡率很高。近年來，隨著利用脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）創(chuàng)建ALI動物模型實驗的研究的不斷深入，在ALI模型的建立及其機制方面有了較新的進展，新的研究指導臨床有望降低ALI和ARDS的死亡率。本文對LPS誘導鼠急性肺損傷不同模型進行評價分析，以便廣大研究者對急性肺損傷動物模型建立和研究提供進一步認識，為前臨床研究提供動物實驗基礎。

【關鍵詞】 急性肺損傷； LPS； 鼠模型

Evaluation and Analysis of LPS Induced Acute Lung Injury in Mouse/WEN Bao-qiang，LIU Jiang-hua.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：137-140

【Abstract】 Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome are caused by disturbing clinical acute and severe complications associated with alveolar capillary barrier.In the past due to ALI and ARDS mechanism are unclear，there is no spcific clinical treatment，and resulting in a high mortality rate of the disease.In recent years，with the deepening of the study of ALI animal model experiments with using LPS，new progress has been made in the establishment and mechanism of ALI model.New research has suggested that clinical trials are expected to reduce the mortality of ALI and ARDS.In this paper，we evaluated the different mouse models of acute lung injury induced by LPS，in order that researchers could further develop the animal model of acute lung injury and provide the animal experimental basis for the preclinicalstudy.

【Key words】 Acute lung injury； LPS； Mouse model

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.036

目前，在已發(fā)表通過對急性肺損傷動物模型的實驗研究中，研究人員發(fā)現活化多形核白細胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）在肺組織內的聚集的現象，在ALI和ARDS的發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用[1-2]。然而PMN移動到肺部不同部位引起ALI和ARDS的原理尚未完全闡明。目前用于研究PMN與ALI和ARDS的關系主要方法為在LPS誘導下復制肺損傷鼠模型[3-4]，來闡明LPS刺激對化學引誘物的反應增加炎癥部位的PMN遷移的作用。雖然單獨使用LPS沒有預先考慮存在的疾病、液體復蘇或機械通氣等客觀條件的存在[5-6]，無法反映整體人類疾病的復雜性，但是通過對鼠肺損傷模型過程的，能夠在一定程度上反映模擬體內ALI和ARDS的病理生理狀態(tài)[7]，為前臨床研究提供研究思路。本文就LPS急性肺損傷模型建立總結和分析，為前臨床研究提供動物實驗基礎提供合適的參考。

1 LPS誘導下復制肺損傷機制

內毒素模型的基礎：LPS是一種糖脂，是存在于組成革蘭氏陰性細菌的外膜中的極性脂質頭組（脂質A）和鏈重復二糖[8]。LPS大多數的生物學效應是由脂質A復制的，即使存在或不存在寡糖O抗原的影響。在血清中，LPS與α結合特異性LPS結合蛋白（LBP）[9]形成一種LPS：激活關于單核細胞，巨噬細胞和其他細胞的CD14/TLR4受體的LBP復合物，觸發(fā)炎癥介質的產生[6]。LPS是膿毒血癥的重要介質，利用機體對革蘭陰性細菌的反應進行全身給藥，導致細菌性敗血癥，是LPS最早用于建模的原理方法之一[7]。

LPS激活循環(huán)中PMN遷移的途徑，主要是通過增強白細胞的機械性能跟遷徙活動，進而使白細胞遷移到肺組織中，釋放趨化性細胞因子進入支氣管肺泡灌洗液（BAL），從而將趨化因子受體表達的PMN引導到肺組織中[1]。這一過程需要PMN和肺內皮之間的的粘附分子接觸，一旦PMN粘附到肺血管壁，就開始經內皮遷移到肺間質和跨上皮遷移到肺泡空間。兩個遷移步驟受粘附分子和趨化因子受體得調節(jié)，同時伴隨著PMN、內皮細胞和上皮細胞的細胞骨架重組[10]。在大量已經研究了的各種ARDS模型中，將小鼠暴露于LPS環(huán)境中，使小鼠接觸LPS誘導大量PMN遷移進入肺，能夠引起ARDS典型癥狀，包括增加微血管的通透性，細胞因子的釋放和破壞的肺結構的等病理改變[9]。endprint

通過研究PMN在不同時間在不同組織結構中的數目變化，能夠提示ALI進程的變化，而收集到的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）以及對組織HE染色，觀察肺組織結構中PMN的數目改變結果，可作為診斷肺部間質疾病非常有用的工具[11-12]。它可以顯示有核免疫細胞的差異細胞計數，提供或支持某些診斷的有用的細胞學變化，以及有助于明確其他測試（包括感染性病原體的培養(yǎng)物，惡性細胞細胞學）的診斷[9-11]。

2 利用LPS誘導的優(yōu)點與缺點

2.1 優(yōu)點 LPS容易管理，并且結果往往是可重復的。另外LPS是先天免疫Toll樣受體（toll like receptor 4，TLR4）途徑反應的有效激活劑[13]，TLR4是主要的LPS受體，一般情況下，在人類中ARDS中LPS不會導致嚴重內皮和上皮損傷發(fā)生[14]，故而對體外細胞直接毒性很小。另外，同時由于物種對LPS得反應具有高度的變異性，其中一方面是人類與動物不同，沒有PIM。在使用LPS誘導后，肺炎可以發(fā)生在羊、小牛、豬和貓體內，但嚙齒動物或狗不會產生。具有PIM的動物[15]，在以g/kg小劑量范圍內的LPS誘導時就可以發(fā)展為發(fā)展膿毒癥和肺損傷，而沒有PIM的動物需要以mg/kg為單位的更高劑量的范圍[5]。因此，使用LPS可以提供特定物種在發(fā)生細菌感染后得到相關的宿主炎癥反應的信息。

2.2 缺點 LPS制劑通常含有污染物，如細菌脂蛋白，可能會影響通過與TLR以外的相互作用，影響LPS的生物學作用。另外LPS制劑的純度不同，可能會受到細菌脂蛋白和其他細菌材料的污染。因此，使用LPS可能得到肺中的細菌引起炎癥反應的不完整的過程[16-17]。

3 LPS誘導急性肺損傷不同給藥方式的特征

3.1 靜脈給藥 靜脈注射LPS后，毛細血管內皮是損傷的初始部位，LPS誘導的細胞損傷似乎與細胞凋亡有關，內皮細胞而在其他組織損傷之前，其凋亡速度迅速發(fā)展。靜脈注射LPS的血液動力學反應，主要有初始階段的白細胞減少，心臟輸出量的較少和動脈壓下降。同時肺動脈壓升高，主要是由于增加在后毛細血管阻力。這個初始階段肺的變化在2～4 h內明顯，并含有低氧血癥，但是只有少量的PMN遷移到肺泡腔中[17]。靜脈注射LPS引起膿毒性休克的效果明顯，當研究人員用1 mg LPS靜脈注射時，小鼠在3 h內發(fā)生高血壓反應，同時導致血管內凝血、肝臟異常、腎功能和非心源性肺水腫。LPS得靜脈注射劑量范圍從2～4 ng/kg6的時候可以得到全身炎癥的證據相關，并引發(fā)肺泡巨噬細胞得遷移[17]。

3.2 氣管內給藥 氣管內滴注LPS可以使PMN經內皮遷移到肺間質和跨上皮遷移到肺泡空間，使肺泡腔內的PMN大幅增加，便于直接引起肺部炎癥反應[11，17]。同時氣管內滴注LPS，劑量范圍在1～4 ng/kg5，以PMN數量增加為特征，在BAL液中PMN，白蛋白和促炎癥細胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，G-CSF，IL-8，ENA-78，MCP-1，MIP-1α和MIP-1β）、單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞計數在24～48 h后增加。

4 LPS誘導下急性肺損傷鼠模型選擇

（1）急性肺損傷實驗動物模型的選取，主要從實驗動物的可操作性、可重復性、動物對試劑的敏感性、藥物吸收的速度、試劑劑量的濃度要求、造模成功后是否易觀察到明顯的變化、購買實驗動物所需的經費等方面考慮[7]。（2）實驗設計選擇ALI的動物模型另一個個重要的考慮因素，動物大小尤影響在生理參數如動脈氧張力和平均動脈壓的監(jiān)測上；影響著實驗人員是否能更容易獲得足夠量的血液或以獲得較大物種中的多種血液樣品，如血氣，血漿細胞因子和白細胞計數的重要因素。（3）由于成本限制，所需試劑的數量和可用性等，可以讓實驗人員考慮限制使用較大的物種。（4）研究人員由于經常面臨缺乏用于測量ALI的發(fā)病機制相關炎癥的物種特異性試劑、介質、受體或其他蛋白質等因素，都影響著鼠模型的選擇[17]。

目前有根據對LPS的敏感度，大多數研究選取LPS的誘導敏感度高SD大鼠或者轉基因KM/Blac小鼠作為實驗動物。

SD大鼠：體型較大，操作空間大，易于進行注射、解剖等操作，尤其是給藥的方式以及劑量對試驗人員的技能要求不高；但是其所需LPS劑量會相應增多，同時對LPS試劑的敏感性不如小鼠，LPS的作用的效果相對于小鼠來不如其明顯。

轉基因KM/Blac小鼠：體型小，重量輕，所需要的LPS劑量濃度少，對LPS較敏感，既能夠節(jié)約實驗成本，同時又滿足短時間內的觀察到明顯病理變化實驗需求，并且可重復性好[18]。但是其體型較小，給藥操作空間局限，對操作技能的要求較高。然而當今被用于研究人類疾病的小鼠模型被廣泛使用，具體試劑的可用性和發(fā)展，能夠較為全面的評估的轉基因小鼠的特定基因的生理功能。故而轉基因小鼠在肺部炎癥過程的研究得到了一些很好的評論[17]。

5 LPS誘導下復制肺損傷鼠模型制備

使用同的給藥方式（包括經氣道、經靜脈等11方式），使小鼠暴露于LPS環(huán)境中。在LPS暴露后不同時間（0、2、4、6、12、24、48 h）[12-14]，通過腹膜內注射氯胺酮或者水合氯醛麻醉小鼠。

用23號套管在心室插管，并在25 cm水柱壓力下下緩慢注入10 mL PBS反復灌洗肺組織約6次，取出肺泡灌洗液[12]。同時將肺切除，切碎，消化，置于保存液中，通過將消化的肺通過70 μm細胞過濾器制作成細胞懸液，上清BCA法測灌洗液蛋白濃度；沉淀重懸后，甩片機做細胞甩片后Gimsa染色，比較肺泡灌洗液和肺組織中的中性粒細胞數量和比例。

分離出完整肺組織用1 mL 10%甲醛固定，注射固定后可將整個肺投入10%甲醛固定液10 h后；水洗、脫水、包埋、石蠟切片，進行HE染色，觀察肺組織中白細胞聚集情況[12，15]。同時通過烘干機測定肺濕干重比例。endprint

6 討論

急性肺損傷模型的成功建立，是研究ALI/ARDS的病理變化的基礎[19]。在LPS誘導的急性肺損傷模型中，通過研究PMN遷移到肺的不同組織中的順序來研究急性肺損傷病理變化。大量的研究結果表明，通過對實驗組跟對照組之間的比對，LPS誘導的PMN遷移到肺和BAL中的時間與動物在LPS中暴露導致時間呈依賴性。國外的一項研究表明，在高峰期反應中，中性粒細胞占肺內白細胞總數的（74±7）%，PMN的絕對和相對計數在4 h的時候迅速增加直到達到峰值，而4 h后，肺組織中的PMN計數減少并降低到在LPS暴露后24 h后的基線水平，空白對照組則無以上關系[6]。BAL的結果，在未暴露于LPS環(huán)境中時，BAL中未觀察到PMN。PMN被誘導進入肺組織組織的時間相對延后[2]，而第一個PMN出現在暴露于LPS中2 h后。在2～4 h，嗜中性粒細胞在BAL中聚集非常明顯。48 h后，BAL中的細胞計數開始減少但沒有達到基線。通過確定血管滲漏，可以在LPS吸入模型中確認肺損傷。在肺組織切片中可見明顯的炎癥反應，炎性細胞浸潤明顯，滲出的炎癥細胞可見于肺泡內和肺泡隔的結締組織。尤其是肺血管及各級支氣管周圍中性粒細胞滯留、聚集明顯[20]。此外，肺組織還可見充血、水腫、肺泡膈增厚，甚至肺泡壁表面可見早期透明膜形成[21]，可見LPS誘導的急性肺損傷模型是較為有效的。

因此考慮具體情況后，結合所需要模型的特征以及實驗參數，LPS誘導的鼠模型是較為適合模型：而決定急性肺損傷鼠型成功與否則于以下因素相關：（1）實驗動物動物對LPS的敏感度。本文經過對已報導發(fā)表的中外文獻的對比研究中發(fā)現，在KM/Blac小鼠上應用LPS建立急性肺損傷模型方面，其病理組織變化、生化改變等較SD大鼠大鼠明顯。（2）給藥途徑方面，經過對大量文獻的對比評價，在霧化吸入、氣管內滴注、尾靜脈注射、腹腔注射的給藥途徑中，通過報道文中肺組織病理變化改變、肺泡灌洗液中炎性因子濃度方面的對比，發(fā)現霧化吸入方式最優(yōu)、依次是氣管內滴注、尾靜脈注射和腹腔注射等。（3）在觀察時間點上，國內外文獻報道有較大差異，其中6、12、24 h被較多的選為觀察點，其中6 h在早期病理組織變化中較為明顯，24 h在后期的病理組織切邊、炎性細胞濃度、炎性因子濃度方面可被明顯觀測到，尤其以經氣道給藥方式，在24 h時間點觀察，能夠得到較為滿意的實驗數據。綜上，在急性肺損傷模型建立的過程中，LPS誘導的小鼠模型是一個較好的選擇：取標本、評估的肺泡毛細血管通透性和炎癥的響應相應方便，不僅節(jié)約成本及操作時間，其可重復性和對試劑的敏感性較高。

總之，使用LPS誘導ALI/ARDS鼠模型，因其可重復性高、敏感度好、成本低等優(yōu)勢，在目前研究ALI/ARDS仍然存在至關重要的意義誘導的動物小鼠模型作為生成有關信息的工具，在肺損傷的病理生理學和測試新型治療方法以及復雜生物系統(tǒng)的干預等方面應用廣泛。通過LPS誘導小鼠模型了解ALI的病理生理和發(fā)展，能夠加快人類對ALI/ARDS的新型治療方案的研究進展，提高動物模型的肺損傷的數據的有用性。

參考文獻

[1] Gill S E，Rohan M，Mehta S.Role of pulmonary microvascular endothelial cell apoptosis in murine sepsis-induced lung injury in vivo[J].Respir Res，2015，16（1）：109.

[2] Wagner J G，Harkema J R，Roth R A.Pulmonary leukostasis and the inhibition of airway neutrophil recruitment are early events in the endotoxemic rat[J].Shock，2002，17（2）：151-158.

[3] Ueda M，Iwasaki Y，Harada H，et al.Role of neutrophils in acute lung injury induced by Candida sepsis[J].Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi，2001，39 （10）：726-731.

[4] Jang Y J，Back M J，Fu Z，et al.Protective effect of sesquiterpene lactone parthenolide on LPS-induced acute lung injury[J].Arch Pharm Res，2016，39 （12）：1716-1725.

[5] Sandstrom T，Bjermer L，Rylander R.Lipopolysaccharide（LPS） inhalation in healthy subjects increases neutrophils，lymphocytes and fibronectin levels in bronchoalveolar lavage fluid[J].The European Respiratory Journal，1992，5（8）：992-996.

[6] Reutershan J，Basit A，Galkina E V，et al.Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury[J].American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology，2005，289（5）：L807-815.endprint

[7] Aulakh G K，Suri S S，Singh B.Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，306（1）：L58-68.

[8] Xu C，Chen G，Yang W，et al.Hyaluronan ameliorates LPS-induced acute lung injury in mice via Toll-like receptor（TLR） 4-dependent signaling pathways[J].Int Immunopharmacol，2015，28（2）：1050-1058.

[9] Ware L B，Matthay M A.The acute respiratory distress syndrome[J].The New England Journal of Medicine，2000，342（18）：1334-1349.

[10] Li Y，Huang J，Foley N M，et al.B7H3 ameliorates LPS-induced acute lung injury via attenuation of neutrophil migration and infiltration[J].Sci Rep，2016，6：31 284.

[11] Meyer K C.Bronchoalveolar lavage as a diagnostic tool[J].Semin Respir Crit Care Med，2007，28（5）：546-560.

[12] Pinheiro N M，Santana F P，Almeida R R，et al.Acute lung injury is reduced by the alpha7nAChR agonist PNU-282987 through changes in the macrophage profile[J].FASEB J，2017，31（1）：320-332.

[13] Liu D D，Cao G，Han L K，et al.Flavonoids from Radix Tetrastigmae improve LPS-induced acute lung injury via the TLR4/MD-2-mediated pathway[J].Mol Med Rep，2016，14（2）：1733-1741.

[14] Lorenz E，Jones M，Wohlford-Lenane C，et al.Genes other than TLR4 are involved in the response to inhaled LPS[J].American Journal of physiology Lung Cellular and Molecular Physiology，2001，281（5）：L1106-1114.

[15] Badshah H，Ali T，Kim M O.Osmotin attenuates LPS-induced neuroinflammation and memory impairments via the TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Sci Rep，2016，6：24 493.

[16] Fragoso I T，Ribeiro E L，Gomes F O，et al.Diethylcarbamazine attenuates LPS-induced acute lung injury in mice by apoptosis of inflammatory cells[J].Pharmacol Rep，2017，69（1）：81-89.

[17] Matute-Bello G，Frevert C W，Martin T R.Animal models of acute lung injury[J].American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology，2008，295（3）：L379-399.

[18] Wu Y，Jin F，Wang Y，et al.In vitro and in vivo anti-inflammatory effects of theaflavin-3，3-digallate on lipopolysaccharide-induced inflammation[J].Eur J Pharmacol，2017，794：52-60.

[19] Pereira M L，Ortolan L S，Sercundes M K，et al.Association of Heme Oxygenase 1 with Lung Protection in Malaria-Associated ALI/ARDS[J].Mediators Inflamm，2016，2016：4 158 698.

[20] Khan M S，Ali T，Kim M W，et al.Anthocyanins protect against LPS-induced oxidative stress-mediated neuroinflammation and neurodegeneration in the adult mouse cortex[J].Neurochem Int，2016，100：1-10.

[21] Li L，Zhang H，Min D，et al.Sox9 activation is essential for the recovery of lung function after acute lung injury[J].Cell Physiol Biochem，2015，37（3）：1113-1122.

（收稿日期：2017-07-11） （本文編輯：程旭然）endprint