微生態(tài)制劑對(duì)小鼠受損腸道的修復(fù)作用

馬寧　張志宏　錢爽

【摘要】 目的：探究微生態(tài)制劑對(duì)小鼠腸道損傷后的修復(fù)作用。方法：將小鼠分5組，每組10只，對(duì)1～4組小鼠進(jìn)行腹腔注射順鉑，1 mL/100 g，造受損腸道模型。然后分別用乳酸菌、功能寡糖、乳酸菌和功能寡糖混合、飲用水（陽(yáng)性對(duì)照）喂養(yǎng)1～4組小鼠，第5組小鼠作陰性對(duì)照，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。2周后比較各組小鼠小腸石蠟切片和離體小腸平滑肌收縮能力。結(jié)果：乳酸菌和功能寡糖混合3組，切片觀察小腸黏膜細(xì)胞排列緊密，小腸平滑肌收縮力最強(qiáng)。結(jié)論：乳酸菌與功能寡糖制劑能有效修復(fù)損傷后小腸，增強(qiáng)小腸蠕動(dòng)。

【關(guān)鍵詞】 微生態(tài)制劑； 功能寡糖； 修復(fù)作用

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of microecological preparation on intestinal damaged mice.Method：Divided mice into 5 groups，10 mice in each group，group 1-4 made the model of the damaged intestine mice by intraperitoneal injected cisplatin 1 mL/100 g，and fed with lactic acid bacteria，functional oligosaccharides，lactic acid bacteria and functional oligosaccharides，drinking water（positive control group）respectively，group 5 as negative control.After 2 weeks，the small intestine paraffin sections and the contractility of isolated small intestinal smooth muscle were compared.Result：Intestinal mucosa cells of the mice fed with lactic acid bacteria and functional oligosaccharides（group 3）were arranged closely and the contractility of isolated small intestinal smooth muscle was the strongest.Conclusion：Lactic acid bacteria and functional oligosaccharide can repair small intestine damaged and enhance its peristalsis effectively.

【Key words】 Microecologics preparation； Functional oligosaccharide； Repairing function

First-authors address：School of Pharmacy Linyi University，Linyi 276000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.007

微生態(tài)制劑，是利用正常微生物或促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)制成的活的微生物制劑[1-3]。也就是說(shuō)，一切能促進(jìn)正常微生物群生長(zhǎng)繁殖及抑制致病菌生長(zhǎng)繁殖的制劑都稱為微生態(tài)制劑[4-5]。乳酸菌作為重要的益生菌來(lái)源，主要通過(guò)恢復(fù)或增強(qiáng)腸道穩(wěn)態(tài)發(fā)揮作用，是一類具有佐劑活性的非病原細(xì)菌，并有作為黏膜疫苗載體使用的潛能[6]。其中雙歧桿菌是人類腸道菌群中唯一的一種既不產(chǎn)生內(nèi)毒素又不產(chǎn)生外毒素，無(wú)致病性的具有許多生理功能的有益微生物[7]。功能性低聚糖是腸道內(nèi)有益菌的增殖因子，其中最明顯的增殖對(duì)象是雙歧桿菌，因?yàn)殡p歧桿菌細(xì)胞表面具有寡糖的受體，而許多寡糖是有效的雙歧因子。本實(shí)驗(yàn)主要比較不同組合的幾種微生態(tài)制劑對(duì)受損腸黏膜的修復(fù)作用，優(yōu)化最佳組合方案，以此維護(hù)腸道健康，提高患者的生存質(zhì)量，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇同批次的KM小鼠，雌雄各半，體重（28±2）g，購(gòu)于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.1.2 藥品及試劑 順鉑（10 mL/支，批號(hào)：H37021358）購(gòu)自齊魯制藥有限公司；低聚異麥芽糖（食品級(jí)，純度：99.8%），購(gòu)自安徽中南生物科技有限公司；乳酸菌（含雙歧桿菌BB-12、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳鏈球菌等，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)Q/TZCXG0001）北京川秀科技有限公司。配制

1000 mL臺(tái)氏液（Tyrode），含：NaCl 8.0 g、10% KCl

2.0 mL（0.2 g）、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL（0.26 g）、5% NaH2PO4·2H2O 1.3 mL（0.065 g）、NaHCO3 1.0 g、1M CaCl2 1.8 mL（0.2 g）、葡萄糖1.0 g。（注意：CaCl2溶液須在其他基礎(chǔ)溶液混合并加蒸餾水稀釋之后，方可一面攪拌一面逐滴加入，否則將生成鈣鹽沉淀，葡萄糖應(yīng)在臨用時(shí)加入，加入葡萄糖的溶液不能久置）。FAA固定液：40%的甲醛溶液5 mL，70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL。

1.1.3 儀器 BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；HHQ-3658電腦組織切片機(jī)（金華市華?？平虄x器廠）；水浴恒溫振蕩儀（金壇市億通電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠分為5組，每組10只，取回后先進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d。前4組小鼠進(jìn)行腹腔注射順鉑，1 mL/100 g，造受損腸道模型。然后分別用乳酸菌、功能寡糖、乳酸菌和功能寡糖混合、飲用水（陽(yáng)性對(duì)照）喂養(yǎng)1、2、3、4組小鼠，第5組小鼠作陰性對(duì)照，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。1周后第4、5組各取2只，脫臼處死取小腸，顯微鏡觀察并進(jìn)行石蠟切片比較兩組不同，判定模型組制備效果。模型制備成功后，實(shí)驗(yàn)組分別在飲用水中添加混合菌制劑，混合菌和功能寡糖，功能寡糖。乳酸菌的濃度為104CFU/mL，功能寡糖濃度為5 g/100 mL，2周后處死剩余小鼠并進(jìn)行小腸石蠟切片和測(cè)離體小腸平滑肌收縮力。endprint

1.2.2 小鼠小腸石蠟切片的制備 小鼠用頸椎脫臼法處死，剖腹取出粗細(xì)適宜的小腸2～3 cm若干段，修塊5 mm×5 mm×2 mm，立即投入生理鹽水中，用滅菌注射器吸取少量生理鹽水，不斷沖洗腸腔直至無(wú)任何雜物。立即投入FAA固定液中固定25 min，56 ℃、振速100 次/min恒溫振動(dòng)固定；在37 ℃恒溫振蕩儀中進(jìn)行脫水70%、80%乙醇溶液脫水各20 min、95%乙醇溶液Ⅰ、Ⅱ缸脫水各15 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸脫水各10 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸透明5 min，65 ℃振動(dòng)；浸蠟包埋58～60 ℃，15 min，切片，縱切厚度3～4 m，45 ℃水溫展開(kāi)，潔凈的載玻片上涂上一層薄薄蛋白甘油，把展開(kāi)的切片貼在上面，裱好的石蠟切片，60 ℃烤25～30 min；染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸各10 min，然后放入無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各10 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇2 min，再放入蒸餾水中1 min[8]。切片HE染色后在顯微鏡下觀察各組小腸絨毛的變化。

1.2.3 小鼠小腸離體平滑肌生理活性測(cè)定 取實(shí)驗(yàn)后的小鼠，禁食24 h后，用頸椎脫臼法處死。迅速沿腹中線打開(kāi)腹腔，每只小鼠取十二指腸同一腸段放入盛有混合氣體的飽和臺(tái)式液中，洗凈腸內(nèi)容物。將其剪成2～3 cm的腸段作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。打開(kāi)BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)零，定標(biāo)，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺(tái)式液加入預(yù)管內(nèi)，藥物管加入16 mL臺(tái)氏液。將標(biāo)本一端固定于L型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續(xù)通入混合氣體（96% O2，4% CO2），氣泡1～2個(gè)/s，溫度37 ℃，待腸管運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定離體小腸平滑肌的頻率和振幅。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠小腸石蠟切片觀察 圖1可以看出小腸黏膜纖毛排列緊密，圖2纖毛損傷較為嚴(yán)重。圖3基本和正常情況下的小腸切片一致，圖4纖毛損傷情況較前一組嚴(yán)重，圖5黏膜間出現(xiàn)裂縫，說(shuō)明有部分組織損傷。說(shuō)明微生態(tài)制劑可以有效修復(fù)受損腸黏膜組織。

2.2 各組小鼠離體小腸平滑肌收縮力測(cè)定比較 與陰性對(duì)照5組比較，1～4組小鼠小腸頻率增加的百分比分別是-9%，-22%，6%，-39%，而1～3組與陽(yáng)性對(duì)照4組比較增加的百分比分別是48%，27%，74%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分說(shuō)明乳酸菌與功能寡糖混合可以充分修復(fù)被放化療藥物破壞的小鼠小腸，甚至在其修復(fù)的基礎(chǔ)上增加了其平滑肌的收縮頻率，修復(fù)小腸的蠕動(dòng)能力，促進(jìn)消化吸收。與陰性對(duì)照5組比較，1～4組小鼠小腸振幅增加的百分比分別是50%，5%，11%，-56%，而1～3組與陽(yáng)性對(duì)照4組比較，增加的百分比分別是237%，138%，150%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說(shuō)明乳酸菌與功能寡糖混合可以充分修復(fù)被放化療藥物破壞的小鼠小腸，在增加其收縮頻率的基礎(chǔ)上增大其振幅。由此可知微生態(tài)制劑可以有效修復(fù)小鼠小腸平滑肌振動(dòng)頻率及振幅，促進(jìn)消化和吸收，見(jiàn)表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究確定由乳酸菌和功能寡糖配制成的微生態(tài)制劑對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用效果最佳。究其原因在于乳酸菌細(xì)胞、細(xì)胞壁成分和胞外分泌物可增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，促使腸道免疫蛋白A（IgA）漿細(xì)胞的產(chǎn)生，從而殺滅侵入體內(nèi)的細(xì)菌和病毒，消除體內(nèi)“病變”細(xì)胞，防止疾病的發(fā)生及惡化[9-10]。某些功能性低聚糖，如異麥芽低聚糖，攝入人體后到大腸被雙歧桿菌及某些乳酸菌利用，而腸道有害的產(chǎn)氣莢膜桿菌和梭菌等腐敗菌卻不能利用，從而保護(hù)腸黏膜[11-13]。

近年來(lái)，癌癥患者與日俱增，放化療是臨床目前治療癌癥主要的方式，但是隨著大劑量放化療在臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，所引起的不良反應(yīng)也越來(lái)越明顯[14-16]。影響正常組織細(xì)胞，引起機(jī)體免疫力下降尤其是消化道的損傷，據(jù)報(bào)道，40%的癌癥患者死于營(yíng)養(yǎng)不良。而微生態(tài)制劑能有效修復(fù)損傷的小腸，提高小腸的收縮能力，促進(jìn)小腸的蠕動(dòng)，從而有效緩解癌癥患者的消化不良等問(wèn)題，并且能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡，從而大大增加癌癥患者的存活率，提高患者生存質(zhì)量[17-20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化療藥物順鉑制備的腸道受損模型在一定程度上反映了化療藥物引起消化道不良反應(yīng)的一些特征，并利用外源性的添加部分有益的活菌制劑能在短時(shí)間內(nèi)使得多種菌群的達(dá)到均衡。說(shuō)明在臨床長(zhǎng)期使用放化療的情況下，適當(dāng)補(bǔ)充外源性有益活菌制劑可適當(dāng)調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，增強(qiáng)腸道平滑肌收縮功能，有利于疾病的康復(fù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Maroof H，Hassan Z M，Mobarez A M，et al.Lactobacillus acidophilus could modulate the immune response against breast cancer in murine model[J].J Clin Immunol，2012，32（6）：1353-1359.

[2] Rerksuppaphol S，Rerksuppaphol L.Lactobacillus acidophilus andBifidobacterium bifidum stored at ambient temperature are effective in the treatment of acute diarrhoea[J].Ann Trop Paediatr，2010，30（4）：299-304.

[3]周長(zhǎng)林.微生物學(xué)與免疫學(xué)[M].3版，北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2013.endprint

[4]艾洪濱.人體解剖生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].3版，北京：科學(xué)出版社，2016.

[5]周長(zhǎng)林.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與指導(dǎo)[M].3版，北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[6]杜丹，方立超，陳丙波，等.嗜酸乳桿菌合生元對(duì)抗生素相關(guān)腹瀉大鼠腸道菌群和腸黏膜損傷的作用[J].胃腸病學(xué)，2009，14（2）：88-91.

[7]趙勝娟，孫文峰，劉愛(ài)萍，等.益生菌對(duì)腸道微生態(tài)影響的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008，29（4）：182-185.

[8]李璐，李琛.制作小腸組織石蠟切片的改進(jìn)辦法[J].解剖學(xué)雜志，2014，37（2）：263-264.

[9]竇以志.潰瘍性結(jié)腸炎應(yīng)用腸道微生態(tài)制劑的效果觀察[J].臨床醫(yī)學(xué)，2016，36（6）：58-59.

[10]王賽，周國(guó)華.氨基水楊酸類聯(lián)合微生態(tài)制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的維持治療進(jìn)展[J].實(shí)用藥物與臨床，2015，12（4）：463-466.

[11]伍靜，蘇春萍，王顯超，等.乳酸菌和雙歧桿菌制劑對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)模型的調(diào)節(jié)作用[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2013，13（16）：4497-4500.

[12]張婧，程中.腸道微生態(tài)制劑及其臨床應(yīng)用和研究進(jìn)展[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2008，15（6）：463-466.

[13]錢家鳴，梁子鍵.微生態(tài)制劑在炎癥性腸病中的應(yīng)用[J].國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志2016，36（9）：733-735.

[14] Moayyedi P，Surette M G，Kim P T，et al.Fecal Microbiota Transplantation Induces Remission in Patients With Active Ulcerative Colitis in a Randomized Controlled Trial [J].Gastroenterology，2015，149（1）：102-109.

[15] Rossen N G，F(xiàn)uentes S，van der Spek M J，et al.Findings From a Randomized Controlled Trial of Fecal Transplantation for Patients With Ulcerative Colitis [J].Gastroenterology，2015，149（1）：110-118.

[16] Colman R J，Rubin D T.Fecal microbiota transplantation as therapy for inflammatorybowel disease：a systematic review and meta-analysis[J].Journal of Crohns & Colitis，2014，8（12）：1569-1581.

[17]李琨，張彩風(fēng)，夏永華，等.微生態(tài)制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果及作用機(jī)制研究[J].中華胃腸外科雜志，2013，16（4）：336-339.

[18]王慧，張海娟，李志東.忍冬藤提取物對(duì)兔離體腸平滑肌的舒張作用及其機(jī)制[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（2）：372-379.

[19]卡力比夏提·艾木拉江，周玉東，閆書(shū)平.溫度變化對(duì)家兔離體小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43（8）：2060-2065.

[20]閏一帆，姜敏，孫明軍，等.炎癥性腸病與腸道菌群[J].國(guó)際消化病雜志，2015，35（2）：84-87.

（收稿日期：2017-05-18） （本文編輯：康玥）endprint