抗PD-L1 CAR基因的構(gòu)建及CAR-T的功能活性研究

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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

抗PD-L1 CAR基因的構(gòu)建及CAR-T的功能活性研究

白靜a,b，張潔雯a,b，施煒星a，陳健a,b，呂正兵a,b

(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

鑒于嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cells, CAR-T)療法應(yīng)用于腫瘤治療的臨床試驗(yàn)已取得很大突破，設(shè)計(jì)了程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1, PD-L1)特異性CAR-T細(xì)胞以體外殺傷肺癌細(xì)胞。通過(guò)克隆表達(dá)PD-L1(73-739)，并純化PD-L1蛋白以免疫BALB/c小鼠制備獲得PD-L1單克隆抗體；克隆PD-L1單克隆抗體單鏈可變區(qū)片段，與CD28、4-1BB、CD3-ζ鏈的基因體外融合構(gòu)建第三代CAR基因，并克隆于慢病毒載體pCDH-CMV-EF1-copGFP上，包裝成慢病毒。該慢病毒感染CD8+T細(xì)胞，擴(kuò)增5 d，測(cè)定CAR的表達(dá)，表達(dá)率可達(dá)到22%以上。PD-L1靶向的腫瘤細(xì)胞殺傷作用分析顯示，抗PD-L1 CAR-T細(xì)胞有一定的體外殺傷活性。

肺癌;程序性死亡配體-1;嵌合抗原受體;單克隆抗體;過(guò)繼細(xì)胞治療

0 引 言

腫瘤，尤其是惡性腫瘤，是目前威脅人類(lèi)生命健康的最主要疾病之一。其中肺癌已成為比較常見(jiàn)的惡性腫瘤。在我國(guó)，無(wú)論是肺癌的發(fā)病率還是死亡率均高居首位[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤治療的手段不斷創(chuàng)新，免疫治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第四種行之有效的治療手段，而它的臨床試驗(yàn)進(jìn)展更令人矚目，因此，腫瘤免疫治療在2013年被《Science》雜志評(píng)為年度十大科學(xué)突破第一位[2]。CAR-T細(xì)胞治療，是嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors，CAR)修飾的T細(xì)胞治療，是免疫治療一個(gè)重要方面，該技術(shù)是通過(guò)基因修飾的手段，將患者的T細(xì)胞在體外修飾，活化和擴(kuò)增后，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)[3]。經(jīng)過(guò)不斷的研究與改進(jìn)，CAR基因已由第一代發(fā)展到第三代；第一代僅CD3復(fù)合物(ζ鏈)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合形成嵌合受體[4-5]，第二代引入一個(gè)共刺激因子(如CD28)[6]，第三代CAR又增加一個(gè)共刺激因子引入(如CD134(OX40)、CD137(4-1BB))[7]。Zhao等[8]通過(guò)應(yīng)用CD28和CD137兩個(gè)共刺激因子構(gòu)建第三代CAR，第三代CAR-T細(xì)胞展示出較強(qiáng)的殺腫瘤功能，并增強(qiáng)T細(xì)胞在體內(nèi)作用的持久性。

PD-L1分子，亦稱(chēng)B7-H1、CD274[9-10]，是PD-1的主要配體，并在很多惡性腫瘤中高表達(dá)[11-17]，在免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活，有助于形成腫瘤微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷，而阻斷該信號(hào)通路，可以促進(jìn)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的增殖，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[18]。PD-1單克隆抗體與CAR-T技術(shù)結(jié)合，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證該聯(lián)合療法消除腫瘤的可行性[19]。PD-L1是PD-1的配體，PD-L1單克隆抗體優(yōu)勢(shì)也比較明顯，如特異性強(qiáng)，副作用低，腫瘤控制時(shí)間長(zhǎng)等，它已成為治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)有效手段，并在臨床試驗(yàn)中取得突破性進(jìn)展[20-22]。本文設(shè)想將PD-L1作為CAR-T治療的靶抗原，抗PD-L1 CAR-T既能阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，提高T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療，又可以直接特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，而且構(gòu)建的第三代CAR基因可以增加T細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性和持久性。本文提出把PD-L1作為CAR-T細(xì)胞的靶點(diǎn)，驗(yàn)證抗PD-L1 CAR-T細(xì)胞在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷活性，為后續(xù)的體內(nèi)試驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種TG1、BL21(DE3)，質(zhì)粒pcDAN3.1-PD-L1(73-739)、pETduet-His-SUMO、pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、pLP1、pLP2、pLP-VSVG，細(xì)胞株293T、A549、NCL-H1048及小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0均由本實(shí)驗(yàn)室提供；小鼠采用SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠(購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)；生物分子試劑非特殊說(shuō)明均購(gòu)于Takara；蛋白Marker(Thermo)；Anti-His6抗體(Roche)；BCA蛋白定量試劑盒(Biomiga)；TMB單組份顯色液(Solarbio)；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、四甲基聯(lián)苯胺、PEG、8-N-鳥(niǎo)嘌呤均購(gòu)于Sigma；CD8+T細(xì)胞分選磁珠(Miltenyi)；培養(yǎng)基RPMI-1640、DMEM，F(xiàn)BS，IL-2，均購(gòu)于Gibco；Ficoll-Paque PREMIUM sterile solution(GE healthcare)、IFN-γ檢測(cè)試劑盒(Life technologies)。

1.2 pETduet-His-SUMO-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及PD-L1蛋白的表達(dá)與純化

1.2.1 pETduet-His-SUMO-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和NotI對(duì)含有pcDNA3.1-PD-L1(73-739)基因的質(zhì)粒和pETduet-His-SUMO載體分別進(jìn)行雙酶切獲得PD-L1(73-739)基因片段和載體片段，采用凝膠回收試劑盒(Axygen)回收目的片段，通過(guò)T4DNA Ligase將回收的酶切產(chǎn)物于16～24 ℃連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)；轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)10 h。挑選單斑菌落，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)10 h，提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定獲得pETduet-PD-L1(73-739)，并送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 PD-L1蛋白的表達(dá)與純化

將pETduet-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，使用蛋白割膠回收試劑盒(Sangon)純化，SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)目的蛋白，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，電泳時(shí)間1.5 h，考馬斯亮藍(lán)溶液染色2.0 h，脫色至目的條帶清晰后拍照記錄。隨后利用Western blotting驗(yàn)證，將SDS-PAGE凝膠上的PD-L1蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)脫脂奶粉封閉后，加入1∶5000倍稀釋的Anti-His6，孵育1.0 h，TBST洗膜3次，每次15 min，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)采集圖像。

1.3 PD-L1單克隆抗體制備

1.3.1 動(dòng)物免疫

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[23-24]改進(jìn)，1 mg/mL的PD-L1純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻免疫BALB/c雌性小鼠，每隔兩周進(jìn)行一次免疫，進(jìn)行腹部或皮下注射，共免疫4次，一周后收集小鼠脾細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞融合

將1×106個(gè)脾臟細(xì)胞和1×105的SP2/0細(xì)胞充分混合，在1 mL的37 ℃預(yù)熱PEG溶液(pH值為8.0～8.2)作用下融合1 min，再加入RPMI-1640培養(yǎng)基終止PEG作用，1000 rpm離心3 min，重復(fù)洗滌兩次，細(xì)胞接種密度調(diào)至2.5×106/mL，50 μL/孔并接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4.0～6.0 h后每孔加入50 μL 2×HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)[23]。

1.3.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

細(xì)胞融合后生長(zhǎng)10 d左右，檢測(cè)克隆陽(yáng)性孔，對(duì)陽(yáng)性克隆的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)三輪有限稀釋法進(jìn)一步篩選，獲得5株雜交瘤細(xì)胞株，分別利用PD-L1蛋白和經(jīng)過(guò)固定處理NCL-H1048細(xì)胞(高表達(dá)PD-L1蛋白)作為包被抗原，篩選獲得一株最優(yōu)雜交瘤細(xì)胞株[25]。

1.3.4 腹水單克隆抗體制備與純化

提前一周將400 μL弗氏不完全佐劑注射到小鼠體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)，擴(kuò)大培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度8×105個(gè)/mL，取1 mL腹腔注射小鼠體內(nèi)，一周后，收取腹水，8000 rpm離心10 min；ELISA法確定單克隆抗體的亞型，二抗羊抗鼠分型二抗1∶5000稀釋使用，確定抗體亞型，選擇Protein G填料(索萊寶)純化抗體，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，Western blotting技術(shù)鑒定。

1.4 PD-L1特異性CAR基因的構(gòu)建

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

注：表中下劃線(xiàn)部分為EcoR I和NotI。

將輕鏈(κ鏈)編碼區(qū)和重鏈恒定區(qū)的序列由人源IgG編碼區(qū)輕鏈(κ鏈)和重鏈恒定區(qū)序列替換，將人源化單克隆抗體基因與CD28、4-1BB、CD3-ζ鏈的基因序列組合。PD-L1特異性CAR基因載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖1所示，產(chǎn)生編碼嵌合抗原受體的CAR基因，由蘇州泓訊生物技術(shù)有限公司合成，克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體上。

圖1 PD-L1特異性CAR基因載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖注：pCMV為CMV啟動(dòng)子；pEF1為EF1啟動(dòng)子。

1.5 CAR-T細(xì)胞的制備

使用脂質(zhì)體3000將穿梭載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CAR與pLP1、pLP2、pLP-VSVG參照試劑盒(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光細(xì)胞百分比，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集上清液，PEG法濃縮并純化慢病毒，感染293T細(xì)胞進(jìn)行滴度測(cè)定，滴度等于細(xì)胞數(shù)、感染率、稀釋倍數(shù)的乘積，病毒濃縮液按MOI為10感染CD8+T細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基使用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(IL-2為60 U/mL，IL-7為30 U/mL)，培養(yǎng)5 d后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR的表達(dá)率。

1.6 CAR-T細(xì)胞的體外殺傷活性檢測(cè)

ELISA法檢測(cè)毒性殺傷上清液中IFN-γ的分泌量：A549細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞，NCL-H1048細(xì)胞作為陽(yáng)性靶細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)效靶細(xì)胞比為1∶1，每個(gè)反應(yīng)孔各100 μL，細(xì)胞濃度1×106/mL，細(xì)胞板在37 ℃孵育10～20 h，1500 rpm離心4 min，檢測(cè)毒性殺傷后上清液中IFN-γ的分泌量，可參照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.001表示存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建的pETduet-PD-L1(73-739)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1，涂板，挑選pETduet-PD-L1(73-739)單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，目的條帶大小與預(yù)期的一致，因此重組質(zhì)粒pETduet-PD-L1(73-739)構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定注：M：DL10000，泳道1：pETduet-PD-L1的雙酶切產(chǎn)物。

2.2 His-PD-L1融合蛋白純化產(chǎn)物的鑒定

收集擴(kuò)大培養(yǎng)的pETduet-PD-L1(73-739)菌體，采用切膠回收的方法純化His-PD-L1融合蛋白，并對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行15% SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)和Western blotting驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，目的條帶與預(yù)期相符。

圖3 PD-L1割膠回收產(chǎn)物鑒定注：圖(a)中電泳凝膠檢測(cè)M1：26610 marker，泳道1：割膠回收的蛋白純化產(chǎn)物；圖(b)中鑒定M2：26616 marker，泳道2：蛋白純化產(chǎn)物。

2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

免疫后小鼠，分離脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)獲得雜交瘤細(xì)胞株，三輪有限稀釋后，共得到五株穩(wěn)定表達(dá)PD-L1單克隆抗體的細(xì)胞株，分別為B10-8、B4-F3、B4-E1、B10-A4、A4-E6。ELISA檢測(cè)，結(jié)果如圖4(a)中所示，B10-8與B4-F3相對(duì)較高，其他三種也顯示相對(duì)較高的水平；圖4(b)是利用高表達(dá)PD-L1的NCL-H1048細(xì)胞株進(jìn)行處理作包被抗原，結(jié)果顯示B10-8與B10-A4兩株細(xì)胞株顯示出較高的水平。綜上所述，選擇細(xì)胞株B10-8進(jìn)行單克隆抗體腹水制備抗體。

圖4 雜交瘤細(xì)胞的篩選

2.4 單克隆抗體的制備與鑒定

將制備的雜交瘤細(xì)胞腹腔注射到小鼠體內(nèi)，一周后獲得腹水，將腹水按1∶200，1∶1000，1∶5000，1∶10000，1∶20000，1∶60000，1∶240000；用PBS等比例稀釋后，測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果如圖5所示，B10-8的效價(jià)可達(dá)到1∶240000。

圖5 PD-L1單克隆抗體的腹水效價(jià)

利用ELISA，檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液中的抗體亞型，抗體使用羊抗鼠分型二抗，以及1∶5000稀釋的兔抗羊HRP，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm讀數(shù)，結(jié)果如圖6所示。細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體IgG2b亞型，輕鏈為κ鏈，因此確定選用親和層析填料Protein G純化抗體。

圖6 B10-8單克隆抗體的亞型分析

利用原核表達(dá)純化的PD-L1蛋白與篩選得到的單克隆抗體腹水進(jìn)行Western blotting鑒定。樣品與PBS按1∶100稀釋?zhuān)Y(jié)果如圖7所示，純化后的單克隆抗體與PD-L1蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，目的條帶的顯示位置與預(yù)期相符。

圖7 PD-L1單克隆抗體Western blotting鑒定注：M：26616 marker；泳道1：B10-8單克隆抗體純化產(chǎn)物。

2.5 病毒包裝與滴度測(cè)定

將慢病毒質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CAR與PLP1、PLP2、PLP-VSVG四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后，收集細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定綠色熒光細(xì)胞百分比，293T細(xì)胞的病毒感染率如圖8所示。從圖8中可以看出，可達(dá)到95.66%(R2區(qū)域所示)，攜帶目的基因的穿梭載體對(duì)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率每板均能達(dá)到90%以上，四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，滿(mǎn)足慢病毒包裝前提。

收集含有病毒上清液100 mL，經(jīng)PEG8000濃縮后得到病毒濃縮液300 μL，取適量病毒濃縮液，梯度稀釋至10倍、100倍、1000倍、2000倍用于感染293T細(xì)胞，未感染的293T細(xì)胞作為空白對(duì)照，用于感染CD8+T細(xì)胞。病毒濃縮液稀釋10倍的感染率為88%，稀釋100倍感染率為75.88%，稀釋1000倍感染率為40.53%，稀釋2000倍感染率為26.45%(圖9)。濃縮后病毒滴度約為5×107TU/mL。

圖8 293T細(xì)胞的病毒感染率

圖9 梯度稀釋病毒濃縮液對(duì)293T細(xì)胞的感染率

2.6 慢病毒感染T細(xì)胞CAR的表達(dá)率

選取數(shù)目為0.5×106個(gè)CD8+T細(xì)胞，作為初始細(xì)胞進(jìn)行激活誘導(dǎo)，誘導(dǎo)1～2 d后，加入病毒濃縮液感染，4 d后，測(cè)定感染率結(jié)果表明：表達(dá)率達(dá)到22%，隨著T細(xì)胞的不斷擴(kuò)增，培養(yǎng)20 d后，CAR的表達(dá)率僅達(dá)到不足10%，分析原因，可能為未感染病毒T細(xì)胞擴(kuò)增速度較快，CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增速度相對(duì)將慢，因此表達(dá)率有所降低。感染20 d后，對(duì)照組細(xì)胞擴(kuò)增近50倍，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞擴(kuò)增不足40倍，原因可能是在加入病毒感染后，病毒以及病毒液中混著的蛋白雜質(zhì)對(duì)T細(xì)胞的有影響，且在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，尤其在病毒感染4 d后，換液處理時(shí)觀(guān)察到CAR-T實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有不同程度細(xì)胞死亡裂解存在。

圖10 CAR的表達(dá)率

2.7 CAR-T細(xì)胞體外毒性檢測(cè)

通過(guò)ELISA檢測(cè)效靶細(xì)胞上清液的IFN-γ的分泌量，分泌量越大，證明CAR-T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞作用越明顯。IFN-γ的分泌量如圖11所示，從圖中可以看出，在各組效靶細(xì)胞的殺傷過(guò)程中釋放的IFN-γ量有著很大的差距，其中以CAR-T細(xì)胞對(duì)NCL-H1048細(xì)胞的殺傷中分泌的IFN-γ量最大，證明殺傷力最強(qiáng)；CAR-T對(duì)A549細(xì)胞顯示一定殺傷活性，而T細(xì)胞對(duì)于兩種靶細(xì)胞顯示極微弱的殺傷活性，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，兩者的殺傷活性差異極其顯著。

圖11 IFN-γ的分泌量注：***，p<0.001。

3 討 論

在腫瘤的免疫治療中，解決腫瘤微環(huán)境免疫抑制的難題也越來(lái)越引起關(guān)注，目前，阻斷PD-1/PD-L1途徑的療法已成為重要的手段，并取得一定的進(jìn)展，PD-L1單克隆抗體在臨床試驗(yàn)中治療效果明顯，在NSCLC的治療中表現(xiàn)出良好的耐受性，對(duì)PD-L1陽(yáng)性病患治療效果更顯著[21,26]。經(jīng)大量研究和臨床數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)階段，PD-L1仍為PD-1/PD-L1通路阻斷劑類(lèi)藥物最有前景的生物標(biāo)志物之一。本文制備了PD-L1單克隆抗體，制備單克隆抗體的抗原選擇多樣，本文利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PD-L1蛋白作為免疫原，為提高融合蛋白的水溶性及表達(dá)量，促進(jìn)靶蛋白正確折疊等，在表達(dá)載體pETduet上插入了SUMO標(biāo)簽[27-28]，獲得質(zhì)量相對(duì)高的PD-L1蛋白。免疫小鼠后，利用細(xì)胞融合技術(shù)，融合小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)克隆、篩選獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌特異性抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株B10-8，腹水純化抗體效價(jià)達(dá)1∶240000，亞型分析屬I(mǎi)gG2b，輕鏈為κ鏈，并證實(shí)單克隆抗體與高表達(dá)PD-L1蛋白的肺癌細(xì)胞NCL-H1048有較強(qiáng)的親和力。然而，隨著臨床應(yīng)用的發(fā)展，鼠源單抗用于人體治療容易被人類(lèi)免疫系統(tǒng)所識(shí)別，產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)[29]，因此，本文將單克隆抗體的基因片段在保留對(duì)特異抗原表位高親和力的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了人源化的改造，減少異源抗體的免疫原性，有效解決傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)所存在的問(wèn)題。

隨著免疫治療策略的推進(jìn)，大量研究表明，聯(lián)合療法策略的開(kāi)展為機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)獲得更好的療效[30-32]。本文將PD-L1單克隆抗體免疫檢查點(diǎn)抑制劑技術(shù)與CAR-T療法結(jié)合，應(yīng)用于肺癌的治療，構(gòu)建了PD-L1特異性的CAR基因，以CAR修飾T細(xì)胞增強(qiáng)了T細(xì)胞的靶向性、殺傷性和持久性。該基因中包含CD28和CD137共刺激因子結(jié)構(gòu)域，在腫瘤微環(huán)境中，激活T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，CD28可以使T細(xì)胞產(chǎn)生耐受，CD137可有效增強(qiáng)T細(xì)胞的繁殖，進(jìn)一步提高T細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞毒性和存活時(shí)間等[7,33]。CAR-T細(xì)胞的制備過(guò)程中，需要將抗體序列及T細(xì)胞受體信號(hào)途徑的編碼分子相關(guān)的序列導(dǎo)入至T細(xì)胞中，目前用于臨床試驗(yàn)導(dǎo)入外源基因的方式大致有逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、mRNA電轉(zhuǎn)入等方式。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的主要是分裂期細(xì)胞，對(duì)于非分裂細(xì)胞感染能力極弱。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的慢病毒，則對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均具有較好的感染能力，采用傳統(tǒng)直接轉(zhuǎn)染的方式難以將外源基因?qū)胫罷淋巴細(xì)胞中，因此絕大部分CAR-T細(xì)胞制備時(shí)，采用的慢病毒系統(tǒng)[34]。本文選用慢病毒質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到95.66%，轉(zhuǎn)染效率很高。包裝后獲得慢病毒，感染T細(xì)胞效率達(dá)到22%，感染效率較低，在以后的研究中，應(yīng)對(duì)此改進(jìn)，提高CAR靶點(diǎn)的密度。CD8+T細(xì)胞，主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫功能，使T細(xì)胞分化成細(xì)胞毒性的T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)ELISA檢測(cè)效靶細(xì)胞上清液的IFN-γ的分泌量，結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞對(duì)NCL-H1048細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)，與對(duì)照組相比，殺傷作用明顯，進(jìn)而說(shuō)明，PD-L1特異性的CAR-T細(xì)胞對(duì)PD-L1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷力。

CAR-T療法是當(dāng)前過(guò)繼性淋巴細(xì)胞回輸治療最新的免疫技術(shù)，該技術(shù)受到廣泛的關(guān)注和研究，并從基礎(chǔ)免疫研究發(fā)展為臨床應(yīng)用，有望成為徹底治愈癌癥的免疫新療法。本文選擇PD-L1作為CAR-T細(xì)胞靶點(diǎn)可能會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，因?yàn)镻D-L1雖在腫瘤組織上高表達(dá)，但在一些正常組織上也有表達(dá)，存在T細(xì)胞在體內(nèi)攻擊正常組織的憂(yōu)患。但隨著CAR-T研究的深入和技術(shù)的改進(jìn)，比如控制回輸CAR-T細(xì)胞的數(shù)量，引進(jìn)自殺基因，或在PD-L1CAR基因上引進(jìn)另一種腫瘤抗原基因形成特異性更強(qiáng)、無(wú)脫靶效應(yīng)的雙頭CAR-T等[35-36]，PD-L1 CAR-T細(xì)胞可能的副作用可以被控制或減少。本文制備PD-L1特異性的CAR-T細(xì)胞，可有效識(shí)別并殺傷肺癌細(xì)胞，為CAR-T細(xì)胞療法提供了很好的細(xì)胞模型，但尚需進(jìn)一步在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，為腫瘤的治療提供一種更有效的CAR-T細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本文首先制備PD-L1單克隆抗體，運(yùn)用基因改造技術(shù)合成PD-L1特異性的第三代CAR基因，并制備PD-L1特異性的CAR-T細(xì)胞。PD-L1靶向的腫瘤細(xì)胞殺傷作用分析顯示，該CAR-T細(xì)胞能夠有效地識(shí)別并殺傷表達(dá)PD-L1蛋白的NCL-H1048肺癌細(xì)胞，為下一步構(gòu)建肺癌實(shí)體瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)奠定研究基礎(chǔ)。

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ConstructionofPD-L1CARGeneandResearchofFunctionalActivityofCART-Cells

BAIJinga,b,ZHANGJiewena,b,SHIWeixinga,CHENJiana,b,LüZhengbinga,b

(a.College of Life Science; b.Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine of Zhejiang Province, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

In view of that great breakthrough has made in clinical experiment of applying Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T) therapy, programmed death ligand-1 (PD-L1) specific CAR-T cells were designed to realize killing lung cancer cells in vitro. PD-L1 monoclonal antibody was obtained by cloning and expression ofPD-L1(73-739)and purifying PD-L1 protein with immune BALA/c mice; the variable region fragmentation of PD-L1 monoclonal antibody was cloned, fused with genes ofCD28, 4-1BBandCD3-ζchains to construct the third generation ofCARgene, and cloned onto lentiviral vector pCDH-CMV-EF1-copGFP to package as lentivirus. The lentivirus was infected with CD8+T cells, amplified for 5 days, and determined CAR expression (the expression rate can reach up to 22%). The analysis of the function of PD-L1 target of killing tumor cells showed that anti-PD-L1 CAR-T cells are of certain in vitro cytotoxicity.

lung cancer； PD-L1； CAR； monoclonal antibody； adoptive cell therapy

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.11.023

2017-03-03 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-10-10

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012ZX09102301-009)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(13H090015)

白 靜(1990-)，女，河北滄州人，碩士研究生，主要從事細(xì)胞免疫療法方面的研究。

呂正兵，E-mail：zhengbingl@126.com

Q28

A

1673- 3851 (2017) 06- 0901- 08

(責(zé)任編輯：唐志榮)