楤木皂苷A在大鼠體內(nèi)的組織分布研究

郭東艷　翟秉濤　呂楊　史亞軍　范妤　王露　王媚

[摘要]楤木皂苷A為太白楤木中的主要活性成分之一。該文通過建立SD大鼠主要臟器中楤木皂苷A的LCMS/MS分析方法，同時(shí)口服灌胃楤木皂苷A 50 mg·kg-1，測定大鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦）中的楤木皂苷A含量，探討體內(nèi)的組織分布特征。結(jié)果顯示楤木皂苷A在SD大鼠主要臟器中的方法學(xué)考察符合要求，口服灌胃楤木皂苷A 50 mg·kg-1，在心、肝、脾、肺、腎、腦組織均有分布且在1 h或2 h 時(shí)達(dá)到最大值。在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)楤木皂苷A的組織分布情況不同：給藥20 min各組織含量：肝>心>脾>肺>腎>腦；給藥1 h各組織含量：肝>脾>腎>肺>心>腦；給藥2 h各組織含量：肝>腎>心>脾>肺>腦；給藥4 h各組織含量：腎>肝>脾>心>肺>腦；給藥8 h各組織含量：脾>心>肝>腎>肺>腦。提示楤木皂苷A主要分布于肝組織，這也與太白楤木常用于治療肝臟疾病具有一定的相關(guān)性。另外，楤木皂苷A在腦組織中雖含量低但有明顯分布，提示藥物可能會透過血腦屏障，也為楤木皂苷A在腦組織的研究提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]楤木皂苷A； 組織分布； HPLCMS/MS

[Abstract]Araloside A is one of the main active ingredients of Aralia taibaiensis In this study， HPLCMS/MS analysis method of araloside A in the main organs of SD rats was established At the same time， the content of araloside A in the main organs （heart， liver， spleen， lung， kidney， brain） after oral administration with araloside A （50 mg·kg-1） were determined to explore the tissue distribution characteristics of araloside A in vivo The results showed that the methodological study of araloside A in the main organs of SD rats met the requirements， araloside A distributed in heart， liver， spleen， lung， kidney and brain tissues reached peak at 1 h or 2 h after oral administration with 50 mg·kg-1The distributions of araloside A at different time points after administration were distinct as follows： the content of araloside A at 20 min：liver>heart>spleen>lung>kidney>brain； the content of araloside A at 1 h： liver>spleen>kidney>lung>heart>brain； the content of araloside A at 2 h： liver>kidney>heart>spleen>lung>brain； the content of araloside A at 4 h： kidney>liver>spleen>heart>lung>brain； the content of araloside A at 8 h： spleen>heart>liver>kidney>lung>brain Therefore， araloside A was mainly distributed in liver tissue， which had a certain correlation with the common use of Aralia taibaiensis in the treatment of hepatic disease In addition， araloside A shows a low content but an obvious distribution in brain tissues， which indicates that the drug can pass through bloodbrain barrier， and provides the basis for the study of araloside A in brain tissue

[Key words]araloside A； tissue distribution； HPLCMS/MS

楤木皂苷A（araloside A）為楤木屬植物太白楤木Aralia taibaiensis的主要活性成分之一，含量約占太白楤木藥材質(zhì)量的12%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。具有抗?jié)?、抗腫瘤、促纖溶、降血糖、抑制腎素活性等藥理作用[15]。1961年，楤木皂苷A首次被前蘇聯(lián)學(xué)者Kochetkov N K等[6]從遼東楤木中分離得到，并運(yùn)用化學(xué)法初步確定其結(jié)構(gòu)。隨后的幾十年，有關(guān)楤木皂苷A的研究報(bào)道主要集中在藥效方面，而相關(guān)的藥代動力學(xué)研究僅有2篇報(bào)道，1篇是Iskenderov G B等[7]1991年發(fā)表，而另1篇Qi D等[8]以楤木皂苷A作為指標(biāo)成分之一，對竹節(jié)參提取物進(jìn)行藥動學(xué)研究。眾所周知，1個藥物能否發(fā)揮藥效，在一定程度上是由胃腸道的吸收和靶器官的濃度決定。藥物口服吸收進(jìn)入機(jī)體后，將通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體的各組織臟器中，藥物分布的特征不僅與機(jī)體各部位的生理特征有關(guān)，而且與組織親和力，化合物自身的理化因素等密切相關(guān)。這將使藥物在體內(nèi)各組織分布產(chǎn)生差異性，從而影響藥物的治療效果和藥物的蓄積以及毒副作用[9]。課題組前期已對楤木皂苷A的體內(nèi)吸收進(jìn)行了相關(guān)研究。本文擬在前期研究基礎(chǔ)上，探討楤木皂苷A的組織分布特征，了解其在體內(nèi)各主要器官的濃度，為藥物的研究、開發(fā)及藥物作用至靶器官或更理想的靶部位提供參考。endprint

1材料與方法

11儀器與試劑

島津Nexera XR LC20AD 高效液相色譜儀（日本Shimadzu；Dgu20A3RDegassing Unit；SIL20AXRAutosampler；CTO20A Prominence Column Oven）；AB Sciex Qtrap 4500型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；GeneSpeed X1型微量離心機(jī)（香港基因有限公司）；BT25s型電子分析天平（天美控股有限公司）；miVac樣品濃縮儀（英國GeneVac公司）。

楤木皂苷A（批號150916，純度>98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司 ）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ（批號160211，純度>98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；甲醇和乙腈（Adamas Reagent，色譜級）。

健康的SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量（230±20） g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)動物試驗(yàn)中心，動物合格號SCXK（軍）20120007。

12色譜質(zhì)譜條件

121色譜條件色譜柱采用Hypurity C18（46 mm×150 mm，5 μm）；柱溫35 ℃，流速08 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，流動相A 01%甲酸水，B為乙腈，洗脫程序：0～6 min，35%～50% B；6～8 min，35% B；在203 nm波長下測定。

122質(zhì)譜檢測條件離子源采用ESI源；檢測方式為負(fù)離子檢測；采用MRM方式進(jìn)行掃描；離子化電壓-4 500 V，氣簾氣35 psi（1 psi=6895 kPa），離子源溫度550 ℃，噴撞氣Medium，噴霧氣150 psi，輔助加熱氣250 psi。楤木皂苷A和內(nèi)標(biāo)的離子對及質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

13樣品溶液的配制

楤木皂苷A儲備液：精密稱量楤木皂苷A 1 mg，用50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度約為1 000 mg·L-1的儲備液。楤木皂苷A工作液：精密量取儲備液5，10，25，50，100，250，500，1 000 μL于離心管中，加入50%甲醇配制成不同系列濃度工作液，使得楤木皂苷A的質(zhì)量濃度為50～1萬mg·L-1。川續(xù)斷皂苷Ⅵ儲配液：精密稱量內(nèi)標(biāo)川續(xù)斷皂苷Ⅵ 05 mg，用50%甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度約為50 mg·L-1的儲備液。川續(xù)斷皂苷Ⅵ工作液：精密量取儲備液適量于離心管中，加入50%甲醇，制成質(zhì)量濃度約為2 mg·L-1的工作液。質(zhì)量控制樣品：精密量取楤木皂苷A 10 μL，添加川續(xù)斷皂苷Ⅵ工作液10 μL于15 mL離心管內(nèi)經(jīng)濃縮儀干燥，再添加200 μL空白組織液，制得質(zhì)量濃度約為5，500，4 000 mg·L-1的質(zhì)量控制溶液。

14組織樣品采集[1012]

清潔級雌雄各半的SD大鼠30只，給藥前15 h禁食不禁水。以楤木皂苷A 50 mg·kg-1灌胃給藥（給藥體積為10 mL·kg-1），給藥后分別在033，1，2，4，8 h處死，立即解剖采集心、肺、肝、脾、腎、腦；生理鹽水洗凈，置于-20 ℃冷凍保存。

15組織樣品的處理[1315]

精密稱取各組織05 g，用生理鹽水洗凈，2倍量蒸餾水勻漿，從中取200 μL組織液，添加10 μL的川續(xù)斷皂苷Ⅵ，再添加乙腈600 μL渦旋2 min，13 000 r·min-1離心10 min后吸上清經(jīng)濃縮儀干燥，200 μL色譜甲醇復(fù)溶殘?jiān)筮^022 μm濾膜，吸5 μL進(jìn)樣分析。

16數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理。數(shù)據(jù)測定值采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果

21方法學(xué)考察[1618]

211專屬性取空白肝臟、空白肝臟組織中添加楤木皂苷A（50 μg·L-1）和內(nèi)標(biāo)川續(xù)斷皂苷Ⅵ（2 mg·L-1），實(shí)測肝臟組織樣品（口服楤木皂苷A 2 h），按相應(yīng)方法處理后進(jìn)行分析，考察方法的特異性。結(jié)果表明，空白肝臟組織中沒有物質(zhì)干擾楤木皂苷A及川續(xù)斷皂苷Ⅵ的測定，表明該方法的特異性良好，見圖2。

212線性范圍與定量下限精密吸取一定量的楤木皂苷A溶液，加入10 μL內(nèi)標(biāo)川續(xù)斷皂苷Ⅵ溶液和200 μL空白組織液，配制成5，10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L-1的楤木皂苷A標(biāo)準(zhǔn)添加組織樣品，處理后進(jìn)行加權(quán)（1/X2）計(jì)算，見表2。

最低檢測限（LLOD）的S/N≥3；定量下限（LLOQ）的S/N≥10。取LLOQ濃度質(zhì)控樣品，按相應(yīng)方法求出楤木皂苷A的濃度。

213精密度與準(zhǔn)確度取3個不同濃度質(zhì)控溶液，按相應(yīng)方法求出楤木皂苷A的濃度。于1 d內(nèi)測6次，3 d測3批，計(jì)算批內(nèi)、批間 RSD（%）和RE（%），見表3。

214基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率取空白組織液200 μL，先加入楤木皂苷A，再加入600 μL乙腈，渦旋離心后吸上清用濃縮儀干燥，取200 μL甲醇復(fù)溶殘?jiān)筮^022 μm濾膜，吸5 μL進(jìn)行分析，所得峰

A 空白肝組織勻漿液；B空白肝組織勻漿液加對照品及內(nèi)標(biāo)；C大鼠口服灌胃2 h后肝組織勻漿液；1楤木皂苷A；2川續(xù)斷皂苷Ⅵ。

。

面積記為A。取空白組織液200 μL，先加入600 μL乙腈，渦旋離心后吸上清用濃縮儀干燥，再加入一定量楤木皂苷A，渦旋混勻2 min后過022 μm濾膜，吸5 μL進(jìn)行分析得數(shù)據(jù)記為B。取用流動相配制的楤木皂苷A 50 μL，混合均勻，吸5 μL進(jìn)行分析得數(shù)據(jù)記為C。楤木皂苷A的提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%，見表4。

215穩(wěn)定性①反復(fù)凍融：取3個不同濃度質(zhì)控溶液，在-20 ℃和室溫之間分別凍融 3 次，按相應(yīng)endprint

方法算出楤木皂苷A的濃度，考察組織樣品是否有影響；②進(jìn)樣室放置穩(wěn)定性：取3個不同濃度質(zhì)控樣品，按相應(yīng)方法在進(jìn)樣室放置6 h進(jìn)樣，考察組織樣品是否受影響；③-20 ℃保存：取-20 ℃放置的3個不同濃度質(zhì)控樣品，在放置30 d后按相應(yīng)方法在當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出楤木皂苷A的濃度，考察藥物在組織中是否有影響；④4 ℃保存：取4 ℃保存的3個不同濃度質(zhì)控樣品，在放置24 h后按樣品處理方法操作，在當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出楤木皂苷A的濃度，考察藥物在組織中是否有影響，見表5。

22組織分布研究

SD大鼠口服給藥楤木皂苷A（50 mg·kg-1），在各組織中的CT數(shù)據(jù)見表6。SD大鼠口服給藥 50 mg·kg-1后，在心、肝、脾、肺、腎、腦組織均有分布且在1 h或2 h 時(shí)達(dá)到最大值。在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)楤木皂苷A的組織分布情況不同，給藥033 h各組織含量：肝>心>脾>肺>腎>腦；給藥1 h各組織含量：肝>脾>腎>肺>心>腦；給藥2 h各組織含量：肝>腎>心>脾>肺>腦；給藥4 h各組織含量：腎>肝>脾>心>肺>腦；給8 h各組織含量：脾>心>肝>腎>肺>腦。結(jié)果表明，楤木皂苷A在肝臟中的含量較其他組織高，在腦中的濃度相對較少。

3討論

實(shí)驗(yàn)中組織樣品的處理比較了甲醇、乙腈以及二者混合的沉淀效果，發(fā)現(xiàn)乙腈能夠提供更高的回收率和更好的重現(xiàn)性，且組織勻漿液無其他物質(zhì)干擾，而方法分析速度快，專屬性好，操作簡便，故最終選用色譜乙腈沉淀蛋白作為組織液的前處理方法。

本實(shí)驗(yàn)研究了口服灌胃楤木皂苷A后8 h內(nèi)5個時(shí)間點(diǎn)的組織分布情況，包含組織分布的吸收、平衡和消除相。大鼠灌胃楤木皂苷A后，原型藥物在不同組織的分布有著不同的速度與程度，脾、肺在給藥1 h達(dá)峰，而心、肝、腎、腦在給藥2 h達(dá)峰?？诜髽B木皂苷A在肝臟中的藥物濃度較高，提示與藥物可能在肝臟中代謝有關(guān)；其次是腎臟，提示與藥物主要在腎臟排泄相關(guān)，也可能與肝腎組織的血流大、循環(huán)好有關(guān)，因此楤木皂苷A的轉(zhuǎn)運(yùn)量也相應(yīng)較大；接著依次為脾臟、心臟和肺。楤木皂苷A主要分布于肝臟，也與太白楤木常用于治療肝臟疾病具有一定的相關(guān)性。另外，楤木皂苷A在腦組織中雖含量低但有明顯分布，提示藥物可能會透過血腦屏障，也為楤木皂苷A在腦組織的研究提供了依據(jù)。

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[責(zé)任編輯張燕]endprint