基于等溫滴定量熱技術(shù)探究黃芩質(zhì)量表征新方法

李桐　張昊　田學(xué)浩　王輝　任廣喜　荊文　光徐冰　褚福浩　王鵬龍　雷海民

[摘要]黃芩黃連藥對水煎自沉淀現(xiàn)象已被廣泛關(guān)注，產(chǎn)生自沉淀現(xiàn)象的本質(zhì)是藥對中酸堿性活性成分相互作用形成難溶性分子復(fù)合物，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)基于中藥配伍后有效成分間的相互作用，探索將等溫滴定量熱技術(shù)（isothermal titration calorimetry， ITC）應(yīng)用于表征黃芩藥材質(zhì)量的可行性，建立以活性成分群為指標(biāo)衡量藥材質(zhì)量的新方法。以不同批次黃芩藥材（包括市售的3批黃芩藥材和市場上常用做以次充好的黃芩苗）作為研究對象，應(yīng)用ITC分別測定黃連中代表性功效成分小檗堿（25 mmol·L-1）與不同批次黃芩水煎液間相互作用能量值，將小檗堿滴定空白水溶液的能量變化（251 μJ）作為空白對照，結(jié)果顯示以小檗堿為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，滴定不同批次黃芩水煎液中黃芩苷類成分的熱量變化由高到低依次為黃芩A（-31720 μJ）、黃芩B（-29283 μJ）、黃芩C（-20895 μJ）、黃芩苗（-2153 μJ）。其中小檗堿滴定黃芩苗的熱量變化顯著低于3批黃芩藥材。應(yīng)用紫外分光光度法以黃芩苷計(jì)測定不同批次黃芩水煎液在最大吸收波長處的吸光度值。紫外測定結(jié)果顯示，相同稀釋條件的不同批次藥材吸光度由高到低依次為黃芩A（0372）、黃芩B（0333）、黃芩C（0272）、黃芩苗（0124），且黃芩苗吸光度顯著低于前三組。ITC滴定與紫外測定結(jié)果相吻合，證明ITC能用于表征黃芩藥材質(zhì)量，基于ITC建立的以一類活性成分為指標(biāo)評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量的方法是簡便、科學(xué)且可行的，此試驗(yàn)為構(gòu)建更加全面、系統(tǒng)地表征藥材質(zhì)量提供了新思路。

[關(guān)鍵詞]等溫滴定量熱； 分子相互作用； 紫外分光光度法； 黃芩； 質(zhì)量

[Abstract]It has been focused on that there will be precipitates when decoction of Scutellariat Radix mixed with Coptidis Rhizoma Precipitation was derived from interaction between acidic and basic compounds This study was based on the interaction between active ingredients after compatibility， strived to explore whether it was feasible to judge the qualities of different Scutellariat Radix by isothermal titration calorimetry （ITC）， build a new method established to characterize the qualities of traditional Chinese medicine by taking a series of active ingredients as index We selected Scutellariat Radix （including three batches of different Scutellariat Radix bought from market and immature Scutellariat Radix which usually was used as adulterant） in different batches as the samples First， we used ITC to determine the binding heat of the reactions between berberine and the decoctions of different Scutellariat Radix The test showed that the binding heat of berberine titrated Scutellariat Radix was Scutellariat Radix A （-31720 μJ）， Scutellariat Radix B （-29283 μJ）， Scutellariat Radix C （-20895 μJ） and immature Scutellariat Radix （-2153 μJ）， respectively We chose deionized water titrated by berberine （251 μJ） as control The heat change of berberine titrated immature Scutellariat Radix was much less than berberine titrated Scutellariat Radix Then we determined the absorbance of different decoctions of Scutellariat Radix by UV Spectrophotometry on the maximum absorption wavelength， and the result is： Scutellariat Radix A （0372）， Scutellariat Radix B （0333）， Scutellariat Radix C （0272）， immature Scutellariat Radix （0124） The absorbance of immature Scutellariat Radix was also less than Scutellariat Radix The result of ITC assay was corresponded to UV spectrophotometry test In conclusion， ITC could be used to characterize the quality of Scutellariat Radix The new method to characterize the qualities of traditional Chinese medicine by taking a kind of active ingredients as index building by ITC was simple， scientific and feasible.endprint

[Key words]isothermal titration calorimetry （ITC）； UV spectrophotometry； molecular interaction； Scutellaria baicalensis； quality control of traditional Chinese medicine

中藥是世界公認(rèn)的復(fù)雜體系，其化學(xué)成分多樣，作用機(jī)制復(fù)雜，單味藥經(jīng)配伍組成復(fù)方用于臨床，更是中藥的一大特色。在中藥現(xiàn)代化、國際化的進(jìn)程中，最大的障礙就是中藥的質(zhì)量難以標(biāo)準(zhǔn)化。近年來，越來越多的學(xué)者提出，以單一成分來判斷和檢測中藥質(zhì)量的好壞是有很大局限性的，不能體現(xiàn)中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，需要建立一種整體的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[14]。

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。臨床上用于治療呼吸道感染、急性菌痢、病毒性肝炎、過敏性疾病和婦科疾病等[5]。由于產(chǎn)地、采收、加工、貯藏等諸多因素的影響，導(dǎo)致市場上黃芩質(zhì)量良莠不齊。

黃芩黃連藥對在中醫(yī)臨床上的使用非常廣泛，如黃連解毒湯、葛根黃連湯等。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為黃芩、黃連二藥皆為苦寒，屬相須配伍，有瀉火解毒的功效。諸多研究表明黃芩黃連藥對水煎液會(huì)產(chǎn)生明顯自沉淀現(xiàn)象[6]，并且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該自沉淀主要是黃連中的小檗堿類成分和黃芩中黃酮類成分（黃芩苷、漢黃芩苷、木蝴蝶苷等）發(fā)生非共價(jià)鍵結(jié)合的締合反應(yīng)，生成酸堿復(fù)合物沉淀，且該沉淀具有很好的神經(jīng)保護(hù)活性[7]。因此，根據(jù)小檗堿與黃芩中眾多黃酮類化合物的相互作用為切入點(diǎn)，以反應(yīng)過程中釋放的能量變化為指標(biāo)，通過ITC技術(shù)測定不同黃芩水煎液與小檗堿水溶液相互作用的大小，表征不同黃芩中多種活性成分含量高低，從而判斷黃芩藥材質(zhì)量的好壞。

ITC通過微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地檢測和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，通過成分間相互作用的能量變化，計(jì)算反應(yīng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。目前，主要應(yīng)用于分子之間的相互作用特征鑒定、酶動(dòng)力學(xué)以及中藥注射液用藥相容性的研究[810]，本文旨在利用ITC技術(shù)測定的熱量曲線表征黃芩中能與小檗堿反應(yīng)的黃酮類成分的含量。

1材料

NANO ITC等溫滴定量熱儀和脫氣站Degassing Station（美國TA公司）； 電子天平（YP3002，上海佑科儀器儀表有限公司）；1/10萬電子天平（型號(hào)ME55，瑞士梅特勒托利多公司）；京立牌LD52B型臺(tái)式低速離心機(jī)；紫外可見分光光度計(jì)（日立UH5300，日立高新技術(shù)公司）；3批市售黃芩（由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系劉春生教授鑒定均為唇形科植物黃芩S baicalensis的干燥根）；黃芩苗（由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系劉春生教授鑒定為未到采收期的唇形科植物黃芩S baicalensis 的干燥根）。

2方法與結(jié)果

21藥材水煎液的制備

將購得的4批市售藥材分別編號(hào)為：黃芩A、黃芩B、黃芩C、黃芩苗。等量稱取2 g，加10倍量水冷凝回流煎煮30 min后水煎液趁熱離心，分取上清液即得黃芩水煎液。

22應(yīng)用ITC測定成分相互作用

221供試品溶液的制備為了使擬合得到的熱力學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，應(yīng)用ITC進(jìn)行分子熱力學(xué)參數(shù)測定過程中，需要反應(yīng)池樣品充分消耗，最終得到S形等溫線[11]。因此，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的摸索，將上述水煎液用去離子水稀釋32倍，微孔濾膜濾過備用。稱取小檗堿588 mg用水稀釋到10 mL配成25 mmol·L-1的小檗堿水溶液備用。供試品溶液滴定前放入脫氣站（degassing station）中30 ℃恒溫脫氣處理20 min。

222檢測條件及操作過程在樣品池中注入被滴定溶液（黃芩水煎液供試品溶液）300 μL，進(jìn)樣針吸入滴定溶液（小檗堿溶液）50 μL，恒溫至30 ℃，控制攪拌速率為250 r·min-1，待儀器自動(dòng)平衡后開始滴定小檗堿溶液，連續(xù)滴定20滴，每滴25 μL，間隔時(shí)間為180 s。

223數(shù)據(jù)處理及分析在滴定過程中，ITC Run軟件會(huì)自動(dòng)采集每次滴定的熱量變化，每滴的熱量變化由峰面積積分得到，能量變化值曲線峰朝上代表滴定過程反應(yīng)放熱，能量變化為負(fù)值[1213]。將4組滴定所得的能量變化分別取平均值，由于提取條件、滴定條件、稀釋倍數(shù)完全一致，因此可通過對比平均值來判斷不同試驗(yàn)組反應(yīng)程度的差別，即不同黃芩藥材質(zhì)量的差別。

224滴定試驗(yàn)及結(jié)果用25 mmol·L-1小檗堿分別滴定空白去離子水、黃芩A，B，C及黃芩苗供試品溶液，滴定過程的能量變化值，見圖1～5，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制出的能量變化折線圖，見圖6，計(jì)算出的能量變化平均值，小檗堿溶液滴定黃芩A，B，C及黃芩苗的能量變化依次為：-31720，-29283，-20895，-2153 μJ。由圖1～6可知，小檗堿滴定去離子水的過程為稀釋吸熱過程，小檗堿滴定黃芩水煎液的過程與小檗堿滴定水相比均為明顯的放熱過程，指示小檗堿與黃芩成分間發(fā)生了明確的放熱反應(yīng)，滴定過程的熱量變化由高到低依次為：黃芩A、黃芩B、黃芩C、黃芩苗，說明不同批次黃芩中能與小檗堿發(fā)生締合反應(yīng)的黃酮類化合物（以黃芩苷為主）含量由高到低依次為：黃芩A、黃芩B、黃芩C、黃芩苗。

小檗堿溶液滴定黃芩A，B，C及黃芩苗的能量變化依次為：-31720，-29283，-20895，-2153 μJ。其中，黃芩苗的能量變化顯著低于其

23紫外分光光度法測定

231對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備稱取黃芩苷370 mg，溶于50 mL水中，移入500 mL量瓶并稀釋至刻度，搖勻，得黃芩苷溶液作為對照品。

232供試品溶液的制備分別精密量取黃芩A、黃芩B、黃芩C和黃芩苗水煎液300 μL，微孔濾膜濾過，置于500 mL量瓶中，加去離子水定容至刻度，搖勻既得4批藥材的供試品溶液。endprint

233對照品及供試品最大吸收波長及吸光度測定量取等量標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液，以試劑為空白對照，在200～600 nm波長范圍內(nèi)測定對照品及供試品的最大吸收波長及吸光度，黃芩苷（黃色）的最大吸收波長為276 nm，黃芩水煎液供試品的最大吸收波長均為276 nm，最大吸收波長處的吸光度從大到小依次為黃芩苷（0440±0019）、黃芩A（0374±0015）、黃芩B（0333±0012）、黃芩C（0272±0012）、黃芩苗（0124±0008），也即黃芩水煎液中含黃酮類化合物（以黃芩苷為主）含量的梯度順序，其中黃芩苗的吸光度顯著低于其他3組，說明黃芩苗中以黃芩苷為代表的黃酮類化合物含量顯著低于其他3組黃芩水煎液，與ITC試驗(yàn)結(jié)果相吻合，見圖7。

234穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取黃芩苷對照品溶液按上述方法操作，在室溫下放置2，4，8，12，24 h分別測定吸光度，吸光度依次為0440，0438，0439，0440，0441，RSD為023%。說明溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，不影響含量測定。

235精密度試驗(yàn)精密吸取黃芩苷對照品溶液，在276 nm波長處測定吸光度，重復(fù)測定5次，吸光度依次為0440，0441，0441，0442，0440。計(jì)算RSD為017%。說明本試驗(yàn)精密度良好。

3討論

本試驗(yàn)通過ITC技術(shù)和紫外分光光度法分別對4批黃芩藥材進(jìn)行測定，結(jié)果表明ITC測定結(jié)果與紫外測定的黃酮類化合物含量順序完全吻合，說明ITC檢測小檗堿滴定黃芩水煎液的能量變化幅度可以代表黃芩中黃酮類化合物的含量多少，即在相同滴定條件下，滴定的平均能量值越高，提示黃芩中的能與小檗堿反應(yīng)的黃酮類化合物含量越高；反之，滴定的平均能量越低，提示黃芩中能與小檗堿反應(yīng)的黃酮類化合物含量越低。此外，隨著黃芩藥材批次的改變，ITC測定能量波動(dòng)幅度明顯大于紫外測定吸光度值變化，提示該方法較紫外法具有更高的靈敏度；經(jīng)證實(shí)ITC能用于表征黃芩的質(zhì)量，基于ITC建立的以一類活性成分為指標(biāo)評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量的方法是簡便、科學(xué)且可行的。

相比傳統(tǒng)方法，本試驗(yàn)主要有兩點(diǎn)創(chuàng)新。一是引入ITC技術(shù)，通過熱力學(xué)手段測定黃芩中活性成分的含量。二是受啟發(fā)于中醫(yī)配伍原理，基于黃芩黃連藥對的中醫(yī)臨床使用現(xiàn)狀，選用小檗堿作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。從黃芩黃連水煎液反應(yīng)有大量沉淀并且沉淀有很好的神經(jīng)保護(hù)活性出發(fā)，不再以單一成分的含量多少來評(píng)價(jià)一個(gè)藥材的好壞，而是通過一類活性成分的反應(yīng)強(qiáng)度來判斷藥材質(zhì)量，這種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的思路是具有創(chuàng)新性的。

本試驗(yàn)的不足在于只對藥材質(zhì)量做了半定量分析，尚需確定小檗堿與黃芩中黃酮類化合物的反應(yīng)比例，建立相關(guān)模型分析，通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小檗堿的消耗量計(jì)算出黃芩中活性成分含量，因此對于藥材質(zhì)量的完全定量分析還需進(jìn)一步探索。此外，本實(shí)驗(yàn)只是初步探究ITC技術(shù)表征黃芩質(zhì)量的可行性，尚缺少應(yīng)用更多批次藥材建立滴定數(shù)據(jù)庫，以便對藥材質(zhì)量做更好的分級(jí)評(píng)定。

本研究的應(yīng)用前景十分廣泛，對于中藥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化、檢測手段的多樣化具有深遠(yuǎn)意義。不但可以用于黃芩質(zhì)量的評(píng)價(jià)，還能用于很多具有典型酸堿性中藥配伍的質(zhì)量研究。關(guān)于本試驗(yàn)的定量完善以及本思路對其他藥物質(zhì)量研究的進(jìn)展，將會(huì)后續(xù)報(bào)道。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint