野生獼猴桃鴨梨利口酒工藝的研究

王洪，羅惠波，2，*，廖玉琴，鄧露，劉藺，李芬

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

野生獼猴桃鴨梨利口酒工藝的研究

王洪1，羅惠波1，2，*，廖玉琴1，鄧露1，劉藺1，李芬1

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

為提高野生獼猴桃和鴨梨資源的利用率，增加其附加值，以獼猴桃和鴨梨混合發(fā)酵釀制一款酒度適中，果香濃郁，酸甜適口的利口酒。通過單因素試驗和正交試驗，得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)：獼猴桃∶鴨梨汁為5∶100（g/mL）、發(fā)酵溫度21℃、酵母接種量3×107（cfu/mL），發(fā)酵5 d。并通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（Solid phase micro-extraction-Gas chromatograph-Mass spectrometer，SPME-GC-MS）聯(lián)用儀，成品酒中共有28種揮發(fā)性成分被檢出，包括16種酯類，6種醇類，2種酮類，4種烷烴類。

利口酒；工藝參數(shù)；色譜分析；揮發(fā)性成分

利口酒主要以發(fā)酵酒、蒸餾酒為酒基，加入新鮮果汁、植物香料等具有芳香或保健功效的原料，通過精心調(diào)配而成。利口酒種類繁多，酒度適中，芳香濃郁，顏色美觀，還能增進(jìn)食欲、幫助消化等功效[1]。其中，水果利口酒不僅具有水果的天然香味而且富含多種維生素和氨基酸，在提倡健康生活的現(xiàn)代社會深受青睞[2]。

野生獼猴桃屬漿果類水果，味美多汁，含多種營養(yǎng)成分和微量元素，其中VC含量最為豐富，具有抗氧化衰老的作用[3]。野生獼猴桃一般長在大山里，沒有受到污染，是真正意義上的天然有機(jī)水果，但由于其果實小，賣相差，直接食用不能充分發(fā)掘其先天優(yōu)勢；釀造獼猴桃果酒是一個不錯的選擇，但單一釀酒的品質(zhì)欠佳，通過與其他水果混釀是改善口感的一個有效途徑[4-6]。鴨梨味甘涼，微酸，具有生津、清熱、化痰等功效，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，所釀梨酒能夠調(diào)節(jié)人體的新陳代謝，促進(jìn)血液循環(huán)、控制體內(nèi)膽固醇水平、抗衰老等保健作用[7-8]。本試驗通過將野生獼猴桃和鴨梨進(jìn)行混合發(fā)酵，研制一款利口酒；以感官評分為指標(biāo)，通過優(yōu)化試驗得到其最佳工藝條件，并采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Solid phase micro-extraction-Gas chromatograph-Mass spectrometer，SPME-GC-MS）對成品酒揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生獼猴桃：宜賓市某農(nóng)貿(mào)市場；鴨梨：自貢市一對山農(nóng)貿(mào)市場；活性干酵母：法國LAFFORT FX10；果膠酶：市售；NaCl：分析純；維生素 C、檸檬酸、蔗糖、偏重亞硫酸鉀：均為市售食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

HR1833型飛利浦榨汁機(jī)：飛利浦（中國）投資有限公司；手持式折光儀：成都青羊化瑞光學(xué)儀器廠；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JE2002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；STARTER2100型實驗室pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；XSP-24型光學(xué)顯微鏡：成都市蘇凈科學(xué)器材有限公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：常州普天儀器制造有限公司；YC-260L型中科美菱醫(yī)用冷藏箱：大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司；Alcomat Super酒精度測試儀：意大利蓋博分析儀器公司；HT300A系列自動固相微萃取儀：意大利HTA公司；Agligent 7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 利口酒的釀制

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點

果肉護(hù)色：鴨梨去皮去核后，將果肉切成小塊并放入含0.1%VC和0.2%檸檬酸的溶液中，浸泡5 min；果汁防氧化：經(jīng)榨汁機(jī)榨汁后，立刻向果汁中加入90 mg/L偏重亞硫酸鉀，可有效防止果汁氧化和起殺菌作用，這是由于梨中的單寧物質(zhì)可在氧、多酚氧化酶和過氧化酶的作用下生成黑色素[9]，嚴(yán)重影響感官；酶解澄清：將0.02%果膠酶加入溫水中溶解，靜止1 h后將酶液加入梨汁中，在40℃下酶解45 min[10]；酵母活化：將400 mg/L活性干酵母溶解在5%的蔗糖溶液中，在35℃～40℃水浴下活化30 min[11]；終止發(fā)酵：當(dāng)還原糖含量達(dá)到25 g/L～45 g/L時，加入梨白蘭地基酒（80°）進(jìn)行終止發(fā)酵處理，將果酒酒精度數(shù)調(diào)到20%，并及時放入低溫環(huán)境下；陳釀：在4℃條件下冷處理10 d后，于20℃條件下陳釀60 d。

1.3.2 指標(biāo)測定

糖度：手持折光儀；還原糖（葡萄糖計）：斐林法[12]；pH值：pH計法；總酸（酒石酸計）：酸堿滴定法[12]；酒精度數(shù)：酒精計法[12]；蔗糖添加量：蔗糖添加量/g=m×12.7×（X1－X2），（式中：m 為梨汁的重量，kg；X1為預(yù)調(diào)發(fā)酵汁糖度；X2為梨汁的糖度；12.7為比例系數(shù)，g/kg）；出汁率：出汁率=m/M，（式中：m為果汁重量，g；M為原果實重量，g）；白蘭地添加量：白蘭地添加量/L=[（Y1－Y2）×V]/（80－Y1），（式中：Y1為預(yù)調(diào)酒度，%vol；80 為白蘭地基酒度數(shù)，%vol；Y2為果酒酒度，%vol；V 為果酒體積，mL）。

1.3.3 單因素優(yōu)化試驗

1.3.3.1 原料比對利口酒感官的影響

鴨梨榨汁后，以獼猴桃∶鴨梨汁分別為10∶100、20 ∶100、30 ∶100、40 ∶100、50 ∶100（g/mL）進(jìn)行混合，酶解澄清后將果汁糖度調(diào)到20°BX，酵母接種量為5×107cfu/mL，再次調(diào)整糖度于24℃下發(fā)酵，當(dāng)還原糖濃度降為25 g/L～45 g/L時，加入白蘭地基酒（80°）終止發(fā)酵，并最終調(diào)整酒度為20%vol，隨后放入冷藏箱中進(jìn)行冷處理（也起終止發(fā)酵的作用），最后對其進(jìn)行感官評定，找到最佳的原料比。

1.3.3.2 發(fā)酵溫度對利口酒感官的影響

以獼猴桃∶鴨梨汁為 10 ∶100（g/mL）進(jìn)行混合，酶解澄清后將果汁糖度調(diào)到20°BX，酵母接種量為5×107cfu/mL，分別于 20、22、24、26、28 ℃下恒溫發(fā)酵，當(dāng)還原糖濃度降為25 g/L～45 g/L時，加入白蘭地基酒終止發(fā)酵，并調(diào)整酒度為20%vol，隨后進(jìn)行冷處理，最后對其進(jìn)行感官評定找到最佳發(fā)酵溫度。

1.3.3.3 酵母接種量對利口酒感官的影響

以獼猴桃∶鴨梨汁為 10 ∶100（g/mL），酶解澄清后將果汁糖度調(diào)到20°BX，酵母接種量分別為1×107、3×107、5×107、7×107、9×107cfu/mL，于 22 ℃下發(fā)酵，當(dāng)還原糖濃度降為25 g/L～45 g/L時，加入白蘭地基酒終止發(fā)酵，并調(diào)整酒精度數(shù)為20%vol，隨后進(jìn)行冷處理，最后對其進(jìn)行感官評定，找到最佳的酵母接種量。

1.3.4 工藝優(yōu)化的正交試驗

由單因素試驗得到原料比、發(fā)酵溫度、酵母接種量對利口酒酒體風(fēng)味的影響，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗，以感官評定為指標(biāo)，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)。利用正交表L9（34）進(jìn)行試驗，正交試驗的因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3.5 感官品評

選10名有經(jīng)驗的果酒品評員進(jìn)行參品，感官評定要求、評分標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)用語參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，評分標(biāo)準(zhǔn)如表2，評分標(biāo)準(zhǔn)用語如表3所示。

表2 評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The standard for evaluation

表3 評分標(biāo)準(zhǔn)用語Table 3 The standard phrase for grading

1.3.6 揮發(fā)性成分分析[13]

固相微萃?。⊿PME）條件：向頂空瓶（20 mL）中加入1.5 g NaCl，5 mL成品酒樣，并將頂空瓶放入全自動固相微萃取儀中，65℃平衡10 min后，插入萃取針萃取30 min。

氣相色譜條件：DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度230℃；不分流；程序升溫：40℃保持1 min，5℃/min升到180℃保持1 min，再以8℃/min升到230℃保持7 min；載氣：99.999%氦氣，載氣流速：1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離電壓70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式EI，質(zhì)量掃描范圍20 amu～500 amu，溶劑延遲 3 min。

樣品定性定量分析：GC-MS數(shù)據(jù)利用NIST數(shù)據(jù)庫、RTLPEST數(shù)據(jù)庫及參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對分析出物質(zhì)的種類；已知濃度的乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，采用半定量法對其組分進(jìn)行定量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

文中圖示采用Origin.8.5軟件作圖，感官評分以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（誤差線）表示，多重比較采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)方差分析采用SPSS.10.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳原料比的確定

原料比例的不同對發(fā)酵狀態(tài)和最終口感影響較大，原料比例對感官評分的影響見圖1。

圖1 原料比例對感官評分的影響Fig.1 The ratio of kiwi to pear effect on the sensory score

如圖1所示，隨著獼猴桃添加比例的增加，感官評分的總體趨勢是緩慢下降的。隨著獼猴桃比例的增大，初始pH值降低，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時酸度較高，口感不協(xié)調(diào)；當(dāng)獼猴桃∶鴨梨汁為10∶100（g/mL）時感官評分最高為90分，此時，發(fā)酵初始pH值為4.0、發(fā)酵4 d、殘?zhí)菫?5 g/L、酸度為4.5 g/L，口感協(xié)調(diào)，酸甜適中。獼猴桃的添加量對果酒發(fā)酵影響較大，主要影響發(fā)酵初始pH值，未添加獼猴桃時梨汁pH值為4.5，以獼猴桃∶鴨梨汁為 10 ∶100（g/mL）添加時 pH 值為 4.0，此 pH值條件有利于酵母的生長和代謝[14-16]，使得最終利口酒口感較好。

2.2 發(fā)酵溫度對利口酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對酵母的生長和產(chǎn)香影響較大，發(fā)酵溫度對感官評分的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對感官評分的影響Fig.2 The fermentation temperature effect on the sensory score

如圖2所示，感官評分隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在發(fā)酵22℃時達(dá)到最大值91分，此條件下，初始pH值為4.0、發(fā)酵5 d、殘?zhí)?2 g/L、酸度5.3 g/L，成品酒酒香優(yōu)雅，果香濃郁。發(fā)酵溫度過高，容易造成酵母衰老，還會導(dǎo)致果香味物質(zhì)損失；相反，適宜的低溫發(fā)酵會使得果酒果香濃郁，口感協(xié)調(diào)柔和[16-17]。

2.3 不同酵母接種量對感官評分的影響

酵母接種量對起酵時間和代謝速率影響較大，接種量對感官評分的影響見圖3。

圖3 酵母接種量對感官評分的影響Fig.3 The inoculating yeast quantity effect on the sensory score

如圖3所示，隨著酵母接種量的增加，感官評分先增后減，當(dāng)接種量為3×107cfu/mL時感官評分最大為89分，此時，發(fā)酵初始pH值為4.0、發(fā)酵 5 d、殘?zhí)?8 g/L、酸度5.6 g/L。接種量小，起酵慢易染菌，接種量大，酵母繁殖消耗糖分過多，不僅影響產(chǎn)酒還會影響風(fēng)味[18]。

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

以感官評分為指標(biāo)，得到正交試驗的結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 The results of orthogonal test

由表4可知，野生獼猴桃鴨梨利口酒最佳工藝組合為 A1B1C2D1，即獼猴桃∶鴨梨汁為 5∶100（g/mL）、發(fā)酵溫度21℃、酵母接種量3×107cfu/mL，此組合沒在試驗組，需進(jìn)行驗證，通過后面驗證試驗得到感官評分為93分。由各因素的極差可知，對感官評分影響大小為獼猴桃∶鴨梨汁﹥發(fā)酵溫度﹥酵母接種量。

通過SPSS軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。

表5 方差分析表（α=0.05）Table 5 The analysis of variance（α=0.05）

由方差分析（表5）可知，原料比和發(fā)酵溫度對利口酒的品質(zhì)影響顯著（p＜0.05），其中原料比影響更大。因此，在工藝中要著重注意原料比的變化。

2.5 主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)

圖4為利口酒揮發(fā)性成分的GC－MS總離子流色譜圖，通過檢索和分析，組分如表6所示。

圖4 揮發(fā)性成分的GC－MS總離子流色譜圖Fig.4 GC－MS total ion chromatogram of volatile components

表6 主要揮發(fā)性成分Table 6 The principal volatile components

由表6可知，共鑒定出28種化合物，其中酯類16種，醇類6種，酮類2種，烷烴類4種。含量排前十位的化合物為癸酸乙酯、異戊醇、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸-3-甲基丁酯、異丁醇、己酸乙酯、苯乙醇、棕櫚酸乙酯、苯甲酸乙酯。其中癸酸乙酯含量最為豐富，異戊醇次之，與前人[19-21]所報道的異戊醇含量最豐富不同，且含量差距也較大，可能原因是使用原料不同且工藝也有所不同所致。苯甲酸乙酯具有依蘭花香和水果香氣，己酸乙酯具有果香、草莓香、茴香味[22]；異戊醇具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味，辛酸乙酯具有白蘭地酒香味，月桂酸乙酯具有花果香氣，棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香和奶油香氣，苯乙醇呈愉悅的玫瑰香氣[19]。此利口酒酯類物質(zhì)種類豐富且含量較高，使得酒體果香濃郁、酒香馥郁。

2.6 利口酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

該利口酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如表7所示。

表7 利口酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Table 7 The standard of quality for the liqueur

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗得到混合果酒利口酒的最佳發(fā)酵工藝：獼猴桃∶鴨梨汁為 5∶100（g/mL）、發(fā)酵溫度21℃、酵母接種量3×107cfu/mL，在此條件下所得成品利口酒酒體棕黃，澄清透明有光澤，酒香優(yōu)雅，果香濃郁，酒體飽滿，酸甜適口，回味悠長。通過SPME-GC-MS技術(shù)分析，得到28種揮發(fā)性成分，其中，酯類化合物種類較多（16種），且含量豐富，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，彌補(bǔ)了果酒香氣平淡的不足。以野生獼猴桃和鴨梨為原料釀造利口酒，可以增加果農(nóng)收益，提高產(chǎn)品附加值，還可以豐富國內(nèi)市場水果利口酒的種類，滿足消費者的需求。

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Research on the Technology of Liqueur of Mixing Wild Kiwi with Pear

WANG Hong1，LUO Hui-bo1，2，*，LIAO Yu-qin1，DENG Lu1，LIU Lin1，LI Fen1
（1.College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China；2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to enhance the utilization ratio and increase added value of wild kiwi and pear，combined wild kiwi with pear produced a kind of liqueur with moderate alcohol degree，abundant fruity odor，sour and sweetness were balanced.By single factor test and orthogonal test obtained optimal technology parameters were the ratio of wild kiwi to pear 5∶100（g/mL），fermentation temperature 21℃，inoculating yeast quantity 3×107cfu/mL，fermentation time 5 d.Meanwhile，in this liqueur 28 kinds of volatile components were detected through Solid phase micro-extraction-Gas chromatograph-Mass spectrometer，including 16 kinds of esters，6 kinds of alcohols，2 kinds of ketones，4 kinds of alkanes.

liqueur；technology parameters；chromatographic analysis；volatile components

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.023

四川理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項目（y2016003）

王洪（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用。

*通信作者：羅惠波（1969—），男（漢），教授,碩士生導(dǎo)師，碩士，研究方向：釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用。

2017-04-06