SPE-HPLC-MS/MS檢測動物源性食品中金剛烷胺殘留

云雅光，池永紅，王碩

（1．天津科技大學(xué)，天津300457；2.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014035）

SPE-HPLC-MS/MS檢測動物源性食品中金剛烷胺殘留

云雅光1，2，池永紅2，王碩1，*

（1．天津科技大學(xué)，天津300457；2.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014035）

建立一種固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Solid phase extraction coupled to high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，SPE-HPLC-MS/MS）檢測動物源性食品中金剛烷胺殘留的方法。研究采用Oasis MCX固相萃取小柱為基質(zhì)凈化柱，以Agilent SB-C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）為液相分離柱，0.1%甲酸-乙腈為（體積比，80∶20）為流動相，流速0.2 mL/min。用電噴霧離子源正離子多反應(yīng)監(jiān)測（Multi-reaction monitoring，MRM）模式進行檢測，外標法定量。在0.1 μg/L～100.0 μg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)＞0.999。該方法檢出限（Limit of detection，LOD）為 1.0 μg/kg，定量限（Limit of quantitation，LOQ）為 3.0 μg/kg，對 3 個添加濃度（30.0、60.0、90.0 μg/kg）下的雞胸，雞肝，雞蛋，豬肉，羊肉5種樣品中金剛烷胺殘留的檢測具有較高的準確度（回收率在83.6%～94.2%之間）和重現(xiàn)性（RSD＜4.0%，n=3）。

金剛烷胺；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取；動物源性食品；檢測

金剛烷胺是人工合成飽和三環(huán)癸烷的氨基衍生物，用于亞洲A型流感病毒的預(yù)防和早期治療，也可用于治療帕金森病引起的神經(jīng)障礙和預(yù)防動物常見的病毒類疾病如禽流感等[1-4]。由于價格低廉，曾廣泛運用于禽獸養(yǎng)殖業(yè)，長期使用會形成藥物殘留，從而導(dǎo)致抗藥性[5]，神經(jīng)過敏，焦慮，夢魘，間歇性的幻覺等[6]一系列的負作用。我國于2005年12月發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，禁止金剛烷胺等抗病毒藥作為獸用藥[7]，F(xiàn)DA規(guī)定禁止將人類抗病毒藥物用于畜禽類的防治[8]。因此，為了減少對人類的潛在危害，建立一種簡單，廉價，高靈敏性的方法來檢測動物源性食品中金剛烷胺的殘留是非常必要的。

固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）是近年發(fā)展起來一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，主要用于樣品的分離、純化和富集，目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度。與傳統(tǒng)的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過程，操作簡單、省時、省力。廣泛的應(yīng)用在食品中農(nóng)獸藥及食品添加劑殘留、環(huán)境及藥物代謝等領(lǐng)域的檢測。

目前公開發(fā)表的檢測金剛烷胺殘留的文獻方法主要有氣相色譜法[9-11]、高效液相色譜[12-15]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[16-19]，分光光度法[20-22]和電位滴定法[23-24]。HPLC-MS/MS法因具有高效分離和集組分定性、定量于一體等優(yōu)異性能，成為近年來獸藥殘留檢測方法研究的主要方向。本研究采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，分別對樣品前處理條件（提取劑，固相萃取小柱）及金剛烷胺質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，建立了一種簡單、快速、準確測定動物源性食品中金剛烷胺殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent LC-1200，Agilent 6410，Triple Quad LC/MS高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜體系：美國Agilent公司；AM-6勻漿組織破碎機：日本NISSEI公司；Centrifuge5804R臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；QL-901振蕩器：海門其林貝爾儀器制造有限公司；Oasis MCX，Oasis PCX，Oasis MAX 固相萃取柱：3 cc，60 mg，Waters公司；超純水系統(tǒng)（18.2 MΩ cm）：美國Labconco公司。

金剛烷胺標準品：美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙醇、乙腈（色譜純）有機溶劑：天津化學(xué)試劑一廠。雞胸、雞肝、雞蛋、豬肉、羊肉：天津某超市。

1.2 液相色譜及質(zhì)譜條件

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜體系（Agilent LC-1200；Agilent 6410，Triple Quad LC/MS；USA）。

色譜條件：色譜柱為Agilent SB-C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm；），流速為0.2 mL/min，柱溫為25℃。流動相由乙腈和0.1%甲酸的混合溶液（體積比：20/80）組成。進樣量為1 μL。此外，流動相在使用前需要經(jīng)過0.22 μm濾膜進行過濾處理。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），干燥器溫度350℃，霧化氣為N2，流速10 L/min，霧化氣壓力40 psi（1 psi=6.895×103Pa），毛細管電壓 4.0 kV，碰撞氣為 N2，多反應(yīng)檢測模式（MRM）。金剛烷胺的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 金剛烷胺[M+H]+的分子離子質(zhì)譜圖Fig.1 Product ion mass spectrum diagram of amantadine

1.3 標準溶液的配制

準確稱金剛烷胺標準品0.010 g，溶解于10 mL甲醇中，并定容到100 mL，搖勻即得100.0 mg/L標準品儲備液，4℃冷藏，儲存期一個月。

準確量取金剛烷胺標準品儲備液1.0 mL，用甲醇稀釋定容至100 mL，即得1.0 mg/L標準工作液。取8個10 mL容量瓶，分別加入標準工作液1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1 000 μL，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得到濃度為 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L 系列標準溶液。

1.4 樣品前處理

本研究選用5種不同的樣品基質(zhì)（雞胸，雞肝，雞蛋，豬肉，羊肉）均購于天津本地某超市。

樣品預(yù)處理過程如下：準確稱取2.00 g（精確到0.01 g）粉碎的樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-1%三氯乙酸（體積比，1∶1）溶液。然后將獲得的混合物渦旋2 min，超聲30 min，在-4℃下10 000 r/min離心10 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移到試管中用于固相萃取凈化。

凈化過程如下：先用3.0 mL甲醇和3.0 mL雙蒸水活化萃取柱，流速均為15 mL/min。取5.0 mL提取液上柱，流速為1.0 mL/min。依次用2%鹽酸和甲醇各3.0 mL來淋洗，流速為1.0 mL/min。然后用5.0 mL氨水-甲醇-異丙醇（體積比，5∶90∶5）來洗脫，流速為1.0 mL/min。將洗滌液轉(zhuǎn)移到試管中，氮氣吹干。獲得的殘渣用1.0 mL甲醇進行復(fù)溶，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

對濃度為1.0 μg/L的金剛烷胺標準溶液，在相同的實驗條件下，分別使用甲醇-1%三氯乙酸（體積比，1∶1）、乙腈-1%三氯乙酸（體積比，1∶1）、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、甲醇和乙腈作為提取液，通過回收率來對比提取效果，結(jié)果如圖2。

圖2 不同提取溶劑對金剛烷胺提取效果的影響（n=3）Fig.2 The influence of different extraction solvents on the amantadine extraction efficiency（n=3）

可見，采用乙腈-1%三氯乙酸（體積比，1∶1）和純乙腈的提取的回收率最高，但考慮到實際樣品中存在蛋白及脂肪，因而本方法選擇乙腈-1%三氯乙酸（體積比，1 ∶1）作為提取液。

試驗采用空白樣品加標的方式，比較了WatersOasis PCX（3 mL，60 mg）、Waters Oasis MCX（3 mL，60 mg）、Waters Oasis MAX（3 mL，60 mg）3種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明，在 0.5，2.0，20.0 μg/kg 3 個加標水平下，Waters Oasis PCX、Waters Oasis MAX小柱的平均回收率分別為83.7%和73.0%，而Oasis MCX的平均回收率均在96.5%以上，試驗結(jié)果見表1。最終試驗選擇采用Waters Oasis MCX（3 mL，60 mg）固相萃取小柱凈化樣品。

表1 金剛烷胺回收率和相對標準偏差（RSD）（n＝3）Table 1 Recoveries and RSDs of amantadine standard with different SPE column（n=3）

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化與選擇

金剛烷胺鹽酸鹽溶于水后，極易得到H+，形成穩(wěn)定的[M+H]+準分子離子，選擇正離子電離（ESI+）方式，對金剛烷胺進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。先對金剛烷胺進行一級質(zhì)譜掃描，得到相應(yīng)的母離子峰；再對其進行二級質(zhì)譜掃描，得到子離子信息。然后，在選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下對得到離子對進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，在電噴霧正離子模式下，金剛烷胺可以生成[M+H]+（m/z152.1）分子離子峰，試驗對噴霧電壓，錐孔電壓，碰撞電壓等質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，得到定性離子對 152.1/135.1，152.1/93.1，152.1/79.1 效果較好，試驗結(jié)果見表2。金剛烷胺的二級質(zhì)譜圖見圖3。

表2 金剛烷胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometer conditions of Amantadine

2.3 標準曲線的繪制及實際樣品檢測

按照1.3所示方法配制不同濃度（X，μg/L）的金剛烷胺分析物的標準工作液，并按試驗所列色譜及質(zhì)譜條件進行分析測定。在0.1 μg/L~100.0 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R2＞0.999），標準曲線分別為：Y=1.021X+0.111。試驗數(shù)據(jù)確定本方法的定量限（LOQ）為 3.0 μg/kg。

研究中以雞胸，雞肝，雞蛋，豬肉，羊肉為代表的動物源性食品進行添加回收試驗，以考察所建立的基質(zhì)凈化方法及金剛烷胺檢測方法的實際應(yīng)用能力。準確稱取的雞胸，雞肝，雞蛋，豬肉，羊肉樣品各2.0 g，分別進行金剛烷胺濃度為 30.0、60.0、90.0 μg/kg的濃度添加，每個濃度平行3個，樣品前處理過程如上所述?；|(zhì)提取液上機分析取峰面積根據(jù)標準曲線計算目標分析物的濃度，以加入量與測得量之比計算回收率及相對標準偏差。結(jié)果如表3所示。

圖3 金剛烷胺的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Product ion mass spectrum diagram of amantadine

表3 樣品中金剛烷胺的回收率及相對標準偏差（n=3）Table 3 Recoveries and relative standard deviation（RSDs）of amantadine in different samples（n=3）

3 結(jié)論

本研究建立了一種固相萃取結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞胸，雞肝，雞蛋，豬肉，羊肉中金剛烷胺殘留的方法。通過對各項參數(shù)的試驗，找出最佳的提取和凈化方法，對各項參數(shù)的調(diào)諧，使儀器檢測靈敏度達到最優(yōu)化。對于分析物的線性范圍在0.1 μg/L～100.0 μg/L時的相關(guān)系數(shù)大于0.999；選定的5種動物源性食品中金剛烷胺的加標回收率在83.6%～94.2%之間；相對標準偏差小于4.0%。該方法具有簡便、快捷、精密度和準確性高的特點，可以作為檢驗檢疫行業(yè)動物源性食品中金剛烷胺殘留量的檢測方法。

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Determination of Amantadine in Animal-derived Food by Combining SPE with HPLC-MS/MS

YUN Ya-guang1，2，CHI Yong-hong2，WANG Shuo1，*
（1.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014035，Inner Mongolia，China）

An accurate and sensitive method for the detection of amantadine（AM）residues in animal-derived food products was developed by combining solid-phase extraction with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（SPE-HPLC-MS/MS）.The Oasis MCX solid-phase extraction column was used for complex matrix purification and Agilent SB-C18 column（2.1 mm ×150 mm，3.5 μm）was employed for separation in liquid chromatography using a mobile phase consisting of 0.1%formic acid and acetonitrile（80∶20，volume ratio）with the flow rate 0.2 mL/min.The electrospray ionization （ESI）source in the positive mode and the multiple-reaction monitoring（MRM）mode were used for the quantitative analysis with external standard method.The results showed that the calibration curves were in good linearity for the AM ranged from 0.1 μg/L to 100 μg/L with the correlation coefficients（R2）＞ 0.999．The limits of detection（LODs）and the limits of quantification （LOQs）of this method were 1.0 μg/kg and 3.0 μg/kg respectively．The average recovery rates were from 83.6%to 94.2%with the good relative standard deviations （RSDs，RSD＜4.0%，n=3）in chosen chicken mus cle，chicken liver，egg，beef and mutton samplesat three standard addition levelsof 30.0，60.0，and 90.0 μg/kg．

amantadine（AM）；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLCMS/MS）；solid-phase extraction（SPE）；animal-derived food；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.034

云雅光（1981—），女（蒙古），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)和食品檢測。

*通信作者：王碩（1969—），男，教授，博導(dǎo)，研究方向：食品科學(xué)。

2017-03-14