液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法法快速檢測(cè)豬肉中鹽酸克倫特羅

陳蕾，石盼盼，魏法山，朱凱，吳麗

（1.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南鄭州450000；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450000）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法法快速檢測(cè)豬肉中鹽酸克倫特羅

陳蕾1，石盼盼1，魏法山1，朱凱1，吳麗2，*

（1.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南鄭州450000；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450000）

建立豬肉中鹽酸克倫特羅的快速提取方法，優(yōu)化了液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）的分析條件，實(shí)現(xiàn)了豬肉中鹽酸克倫特羅的快速檢測(cè)分析。試驗(yàn)確定了利用乙腈快速提取豬肉中鹽酸克倫特羅，研究了樣品經(jīng)乙腈快速提取后的凈化方法，對(duì)比了填充料的類型，填充料的加入量及無水MgSO4的加入量3方面對(duì)提取凈化效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法鹽酸克倫特羅在0.15 μg/L~1.5 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限可達(dá)到0.5 μg/L，平均回收率在80%~120%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Rlative SandardDeviation，RSD）為0.47%。本方法可縮短檢測(cè)時(shí)間，方法快速、簡(jiǎn)單、可靠，可用于豬肉中鹽酸克倫特羅的快速測(cè)定。

鹽酸克倫特羅；快速提??；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；豬肉

鹽酸克倫特羅，化學(xué)名2[（叔丁氨基）甲基]-4-氨基3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，簡(jiǎn)稱克倫特羅，俗語稱“瘦肉精”。20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅添加到動(dòng)物飼料中會(huì)改變動(dòng)物體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)的代謝途徑，降低動(dòng)物體內(nèi)脂肪含量，使瘦肉率提高9%~14%。鹽酸克倫特羅是腎上腺類神經(jīng)興奮劑，屬于β-興奮劑類藥物，與其他β-興奮劑類藥物相比其藥理性質(zhì)穩(wěn)定，進(jìn)入動(dòng)物體后，會(huì)以原藥形態(tài)殘留在肌肉和內(nèi)臟組織中。長期食用含鹽酸克倫特羅的豬肉會(huì)嚴(yán)重影響人的身體健康[1]。

我國農(nóng)業(yè)部公告第176號(hào)《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥品目錄》、第193號(hào)《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》、第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中均將鹽酸克倫特羅列為第一位。其他類似藥物還有沙丁胺醇（salbutamol）和特布他林（terbutaline）等，均能起到瘦肉作用，統(tǒng)稱為“瘦肉精”。瘦肉精曾在上海引發(fā)了幾百人的中毒事件[2]，但某些養(yǎng)殖戶為了縮短出欄時(shí)間，降低成本，提高利潤，仍然在飼料中非法添加鹽酸克倫特羅。

目前測(cè)定豬肉中鹽酸克倫特羅的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、酶聯(lián)免疫吸附法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）[3-8]。但這些方法的檢測(cè)時(shí)間均較長，而豬肉的出欄和市場(chǎng)的銷售卻是在很短時(shí)間內(nèi)完成的，因此市場(chǎng)需要更為快速的檢測(cè)方法來滿足實(shí)際需求。隨著GC-MS/MS技術(shù)的成熟，樣品的分析條件基本已達(dá)到最優(yōu)，近年來的研究主要致力于前處理方法的革新[9-14]。本文用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉中的鹽酸克倫特羅，與國標(biāo)GB/T22286-2008《動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》相比[15]，采用乙腈提取、吸附劑凈化的快速前處理方法，省去了國標(biāo)方法中12 h的酶解時(shí)間，并且優(yōu)化了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的分析條件，方法兼顧了效率與準(zhǔn)確。本法可用于豬肉樣品中鹽酸克倫特羅的快速檢測(cè)，提高大宗食品的檢驗(yàn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品購自某大型超市。

鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、同位素內(nèi)標(biāo)物克倫特羅-D9：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；中性氧化鋁、無水硫酸鎂（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；N-丙基乙二胺填料（PSA填料）、C18填料、氨基填料（NH2填料）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290-6460A）：美國安捷倫公司；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；CT14RD臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；IKA渦旋混勻器：上海人和科學(xué)儀器有限公司；電子天平（d=0.0001g）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；勻漿機(jī)：上海臣迅信息科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 提取

將成塊的豬肉樣品用粉碎機(jī)粉碎成肉糜狀，準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確到0.1 mg）于50 mL離心管中，吸取鹽酸克倫特羅外標(biāo)液50 μL，同位素內(nèi)標(biāo)物克倫特羅-D9配制成的內(nèi)標(biāo)液50 μL（內(nèi)外標(biāo)濃度均為100 ng/mL）于離心管內(nèi)，準(zhǔn)確加入5.0 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取30 min，加入2.5 g中性氧化鋁，渦旋混勻，以10 000 r/min，4℃，高速離心5 min，上清液即為鹽酸克倫特羅提取液。

1.3.1.2 凈化

取1.5mL樣品提取液，轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，加入一定量的吸附劑和無水硫酸鎂后渦旋混勻，12000r/min離心5 min，取上清液用有機(jī)濾膜過濾后取1 mL加入進(jìn)樣品瓶中。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制[15]

1.3.2.1 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱內(nèi)避光保存。再用甲醇稀釋1000倍配制成100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.3.2.2 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

分別吸取100 ng/mL的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.150、0.375、0.70、1.50 mL 于 100.0 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別配制成0.15、0.375、0.75、1.5 ng/mL的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)使用液。臨用時(shí)配制。

1.3.3 同位素內(nèi)標(biāo)物的配制[14]

1.3.3.1 同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物克倫特羅-D9標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.3.3.2 同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液（100 ng/mL）

吸取同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液1.0 mL于1 000 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。配制成100 ng/mL的克倫特羅-D9同位素內(nèi)標(biāo)工作液，于-18℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.3.4 LC-MS/MS分析條件

色譜分析條件：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃，始終保持；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；梯度程序：0~3 min,B：98%~30%；3 min~3.5 min，B：30%保持不變；3.5 min~4.5 min，B：30%~98%；4.5 min~6 min,B：98%保持不變。

質(zhì)譜條件：電離模式：ESI+檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；干燥器溫度：320℃；干燥器流量：10 mL/min；霧化器壓力：3.1×105Pa；鞘流氣溫度：350℃；鞘流氣流量：11 mL/min，毛細(xì)管電壓：3 500 V，噴嘴電壓：500 V；MRM參數(shù)見表1，安捷倫Mass Hunter軟件用于定性和定量分析。

表1 MRM主要參數(shù)Table 1 The main parameters of MRM

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了EclipsePlusC18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），Extend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和 SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）3種不同類型的色譜柱，以及柱子溫度,流動(dòng)相的配比和流速對(duì)樣品分離效果的影響，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在1.3.4的條件下，鹽酸克倫特羅的分離效果最佳。

2.2 凈化條件的選擇

2.2.1 不同吸附劑吸附效果結(jié)果

在液相色譜試驗(yàn)中，吸附劑的選擇非常關(guān)健。以1.3.1.1的方法提取樣品后,在提取液中加入100 mg無水硫酸鎂，平均分成3份，分別添加100 mg的PSA、100 mg的C18和100 mg的NH2吸附劑凈化提取液，每種處理取3個(gè)平行，處理好后，依照1.3.4的分析條件上LC-MS/MS，結(jié)果如圖1~圖3所示。

圖1 C18凈化后的樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of C18as adsorbent

C18和NH2作為吸附劑時(shí)，其目標(biāo)峰附近雜質(zhì)較多，凈化效果不理想；而PSA作為吸附劑時(shí)，雜質(zhì)較少。此外，PSA作為吸附劑時(shí)其樣品平均回收率為93.41%，高于C18的85.95%和NH2的91.16%。因此，3種吸附劑中，PSA凈化效果最佳。

圖2 NH2凈化后的樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of NH2as adsorbent

圖3 PSA凈化后的色譜圖Fig.3 Chromatogram of PSA as adsorbent

2.2.2 不同含量PSA凈化結(jié)果

不同吸附劑的吸附效果不同，同一種吸附劑添加量不同，所表現(xiàn)出的吸附效果也有差異。用1.3.1.1的方法提取樣品后，在提取液中加入100 mg無水硫酸鎂，然后分別添加 50、100、150、200 mg的 PSA 吸附劑凈化提取液，每個(gè)處理取3個(gè)平行，結(jié)果如表2所示。

表2 不同含量PSA凈化后的加標(biāo)回收率（n=3）Table 2 Recovery with different content PSA（n=3）

從表2中可以看出，隨著PSA加入量的增多，樣品的回收率逐漸增大，但從150 mg~200 mg變化很小，故選擇PSA的最優(yōu)添加量為150 mg。

2.3 添加不同含量無水硫酸鎂的結(jié)果

無水硫酸鎂可以吸收提取液中的水分，添加量的多少會(huì)對(duì)同等條件下的試驗(yàn)產(chǎn)生影響。用1.3.1.1的方法提取樣品后，在提取液中加入150 mg PSA，然后分別添加 50、100、150、200、250 mg 的無水硫酸鎂去除水分后按照1.3.4設(shè)置的參數(shù)上機(jī)測(cè)試，每個(gè)處理取3個(gè)平行，結(jié)果見表3。

表3 不同含量無水MgSO4凈化后的加標(biāo)回收率（n=3）Table 3 Recovery with different content anhydrous MgSO4（n=3）

由表3可知，當(dāng)無水硫酸鎂的量為100 mg時(shí)，回收率最大，隨著無水硫酸鎂量的增加，回收率下降趨勢(shì)明顯，因而無水硫酸鎂最佳添加量為100 mg。

2.4 回歸曲線

用濃度梯度為 0.15、0.375、0.75、1.5 ng/mL 的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 μL按照1.3.4設(shè)置的參數(shù)上機(jī)，以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試驗(yàn)條件下，克倫特羅的濃度與峰面積在濃度范圍0~1.5 ng/mL之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)超過r=0.997 7，結(jié)果較為滿意。

2.5 回收率與精密度試驗(yàn)

在空白樣品（不含克倫特羅）中，加入克倫特羅外標(biāo)液 10 μL，內(nèi)標(biāo)液 10 μL（內(nèi)外標(biāo)濃度均為 100 ng/mL）進(jìn)行加標(biāo)回收，在1.3.4設(shè)置的參數(shù)條件下測(cè)定，重復(fù)6次，克倫特羅的平均回收率是115.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.47%。

3 結(jié)論

本文建立了豬肉中鹽酸克倫特羅的快速提取方法，并對(duì)提取物進(jìn)一步凈化處理，整個(gè)前處理時(shí)間不到1 h。本法操作簡(jiǎn)便，與標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T 22286-2008《動(dòng)物源性食品中多重β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》）僅提取酶解時(shí)間就需要12 h相比提高了檢驗(yàn)效率。在以下分析條件下：色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；梯度程序：0~3 min，B：98%~30%；3 min~3.5 min，B：30%保持不變；3.5 min~4.5 min，B：30%~98%；4.5 min~6 min，B：98%保持不變。電離模式：ESI+檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；干燥器溫度：320℃；干燥器流量：10 mL/min；霧化器壓力：3.1×105Pa；鞘流氣溫度：350℃；鞘流氣流量：11 mL/min，毛細(xì)管電壓：3 500 V，噴嘴電壓：500 V；裂解電壓90V；碰撞能5，15 V。鹽酸克倫特羅可在0.15 ng/mL~1.5 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限可以達(dá)到現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)要求。添加量為0.5 ng/g時(shí)，回收率為115.32%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.47%。本方法對(duì)促進(jìn)肉及肉制品中β-興奮劑類藥物的快速檢測(cè)方法的開發(fā)有一定的借鑒意義。

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Rapid Detection of Clenbuterol in Pork with LC-MS/MS Methods

CHEN Lei1，SHI Pan-pan1，WEI Fa-shan1，ZHU Kai1，WU Li2，*
（1.Institute of ProductsQuality Supervision and Inspection in Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China；2.College of Animal Husbandry and Economics in Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China）

This paper established an rapid clenbuterol extraction method from pork by LC-MS/MS（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry）.LC-MS/MS analysis parameters were optimized，it can detect clenbuterol in pork rapidly.The extraction method with acetonitrile was determined.The type and amount of filling material and anhydrous MgSO4dosage for purification were studied.The results showed clenbuterol had a good liner relationship in the 0.15 μg/L-1.5 μg/L range.Detection limit can reach 0.5 μg/L，and average recovery was in the range of 80%-120%；relative standard deviation（RSD）was 0.47%.our method can shorten the time.It was rapid，simple and reliable，can be used to detect clenbuterol in pork rapidly.

clenbuterol；rapiddetectionmethod；liquidchromatography-massspectrometry/massspectrometry；pork

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.033

河南省重大科技專項(xiàng)“高溫肉制品加工關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（161100110700）

陳蕾（1985—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要研究方向：食品質(zhì)量與安全。

*通信作者

2017-04-21