櫻桃番茄果脯中矮壯素檢測方法的建立

趙炳喃，韓悅，尹仁，張雙靈，*

（1.青島市城陽第一高級(jí)中學(xué)，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

櫻桃番茄果脯中矮壯素檢測方法的建立

趙炳喃1，韓悅2，尹仁2，張雙靈2，*

（1.青島市城陽第一高級(jí)中學(xué)，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

櫻桃番茄果脯為我國的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品，矮壯素殘留逐漸成為制約其出口的瓶頸，研究建立一種矮壯素殘留的檢測方法。以櫻桃番茄果脯為研究對(duì)象，通過甲醇提取矮壯素，對(duì)提取物采用強(qiáng)陽離子柱固相萃?。⊿PE）分離凈化，采用高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜進(jìn)行檢測，并對(duì)檢測方法的可靠性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，建立的檢測方法檢出限和定量下限分別為0.01 mg/kg和0.02 mg/kg，加標(biāo)回收率在73.33%～90.60%之間，精密度在3.34%～7.87%之間。該檢測方法為調(diào)查番茄加工品中矮壯素本底含量以及為后續(xù)降解矮壯素殘留提供方法基礎(chǔ)。

櫻桃番茄；矮壯素；固相萃?。⊿PE）；檢測方法

矮壯素（Chlormequat chloride）是2-氯乙基三甲銨氯化物的商品名稱，因其抗倒伏、矮化農(nóng)作物的作用而得名，在常溫下是白色晶體，有魚腥味，原藥為淡黃色晶體，在中性和微酸性溶液中穩(wěn)定，遇堿易分解[1-3]。矮壯素能抑制植物細(xì)胞伸長，但不抑制細(xì)胞分裂，具有增加番茄、橄欖、葡萄和梨的坐果率等功能[4-6]。矮壯素為內(nèi)吸性農(nóng)藥，由于其提高作物產(chǎn)量的顯著作用而被作為植物生長調(diào)節(jié)劑大量使用。

隨著矮壯素的逐步推廣使用，其殘留的毒性危害在國內(nèi)外被廣泛研究。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量的矮壯素對(duì)受試動(dòng)物的生殖能力有毒害作用，即使動(dòng)物每天攝入的矮壯素低于人類每日允許攝入量（Allowable Daily Intake，ADI），也會(huì)對(duì)其生殖能力產(chǎn)生不良的影響[7-9]。美國國立職業(yè)安全與健康研究所將矮壯素列為潛在內(nèi)分泌干擾物[10]。歐盟（EU）根據(jù)矮壯素的毒性制定了矮壯素在食物中的最大殘留量[11-12]。由于我國種植業(yè)的散亂分布現(xiàn)狀，水果中矮壯素的使用非常普遍，已經(jīng)出現(xiàn)多例番茄果脯中矮壯素殘留超標(biāo)被退回的案例[13-14]。矮壯素超標(biāo)成為我國農(nóng)產(chǎn)加工品出口創(chuàng)匯的新出現(xiàn)瓶頸。

目前，我國尚未制定檢測水果及其加工品中矮壯素殘留的檢測方法。近年，有文獻(xiàn)探討了番茄中矮壯素的檢測方法，主要有氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]。但采用氣相色譜時(shí)需衍生化處理，衍生效率易受基質(zhì)的影響[17]。而液相色譜不需要衍生可直接測定[18-20]。本研究在國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選用櫻桃番茄加工品為研究對(duì)象，采用強(qiáng)陽離子固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）進(jìn)行分離凈化，強(qiáng)陽離子固相萃取小柱可鍵合帶有季銨鹽官能團(tuán)的陽離子[21]，建立了水果加工品中矮壯素的高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法，其中質(zhì)譜測量結(jié)果用于矮壯素的定性，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃番茄：煙臺(tái)某食品有限公司；氯化鈣、蔗糖：食品級(jí)，市售；矮壯素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：sigma公司；偏磷酸（分析純）：萊陽康德化工有限公司；乙腈、甲醇、甲酸胺（色譜純）：德國Merck公司；固相萃取柱：Wa ters Oasis MCX（60 mg/3 cc）：天津德祥茂隆科技有限公司；0.45 μm有機(jī)微孔濾膜：上海興亞凈化材料廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；JYL-C021九陽料理機(jī)：九陽股份有限公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽：上海一恒科技有限公司；減壓抽濾裝置（配AP-01P型真空泵）：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HSE-12D型固相萃取儀：天津恒奧科技發(fā)展有限公司；VORTEX振蕩器：IKA集團(tuán)；ZMQ S5V001超純水系統(tǒng)：美國密理博；1290高效液相色譜儀（配紫外檢測器）、6460電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；常規(guī)實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器若干。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃番茄果脯的制作

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品風(fēng)險(xiǎn)分析實(shí)驗(yàn)室自制櫻桃番茄果脯，工藝如下。

1）原料挑選：選取500 g新鮮、成熟度一致、無病蟲害的櫻桃番茄作為原料。

2）去蒂：去掉櫻桃番茄的蒂。

3）扎孔：使用牙簽均勻扎孔，孔間距為1 mm。

4）清洗：流水沖洗1 min。

5）硬化：2 L1%氯化鈣浸泡硬化18 h。

6）水煮：置于沸水中，水溫為100℃時(shí)，水煮2min。

7）浸糖：分別使用糖度為 15、23、28 °BX 糖液浸泡24 h。

8）烘烤：65℃干燥，10 h。至不黏手，得櫻桃番茄果脯成品，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

矮壯素標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取1 mL 1 000 μg/L矮壯素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（由標(biāo)準(zhǔn)品配制）于10 mL容量瓶中，用超純水定容，得100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋制備成 0.5、1、5、10、15 μg/L 的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)使用液。取各濃度的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)使用液上機(jī)測定，得矮壯素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取100.0g（精確至0.01g）實(shí)驗(yàn)室自制果脯加工品，研磨成勻漿。準(zhǔn)確稱取5.00 g（精確至0.000 1 g）于具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇：1%偏磷酸（1∶1，體積比），振蕩提取10 min，減壓過濾。取10 mL甲醇：1%偏磷酸（1∶1，體積比）清洗殘?jiān)?，合并濾液，用甲醇：1%偏磷酸（1∶1，體積比）溶液定容至50 mL容量瓶中，混勻。

矮壯素的分離純化：取2.5 mL濾液于小燒杯中并加入5 mL蒸餾水。分別使用5 mL甲醇和蒸餾水活化固相萃取柱，上樣，然后分別用5 mL蒸餾水和甲醇淋洗。準(zhǔn)確使用2.5 mL甲酸銨（含有1 mol/L乙腈）：水（體積比為1∶3）洗脫，接收洗脫液，振蕩混勻10 min。使用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，濾液上機(jī)檢測。

1.3.4 高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定

HPLC條件：色譜柱：Agilent ZORBAX RX-SIL柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；檢測器：紫外檢測器，波長275 nm；流動(dòng)相：含1 mol/L甲酸銨的乙腈∶水（體積比為 1 ∶3）；流速：0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

MS/MS條件：電噴霧正離子（ESI+）掃描模式；毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化器壓力 276 KPa。

1.3.5 矮壯素殘留量的計(jì)算

矮壯素殘留量的計(jì)算公式為：

式中：X為樣品中矮壯素的殘留量，mg/kg；m為樣品勻漿的質(zhì)量，g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得矮壯素的質(zhì)量濃度，μg/L；v為固相萃取后的樣液體積，L；v1為樣品勻漿準(zhǔn)確定容體積，mL；v2為純化的樣品濾液體積，mL。

1.3.6 檢測方法的可靠性

1.3.6.1 回收率和精密度

向5.00 g（精確至0.000 1 g）實(shí)驗(yàn)室自制的果脯加工品中加入相當(dāng)于0.01、0.05、0.50 mg/kg 3個(gè)水平濃度的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和精密度。

式中：P為樣品的加標(biāo)回收率；R1為未加標(biāo)樣品中矮壯素的殘留量，mg/kg；R2為加標(biāo)樣品中矮壯素的殘留量，mg/kg；R0為加標(biāo)量，mg/kg。

1.3.6.2 測定方法的檢出限

對(duì)果脯加工品的矮壯素提取液逐級(jí)稀釋，以3倍信噪比（S/N≥3）設(shè)定儀器檢出限，5倍信噪比（S/N≥5）設(shè)定儀器定量下限，得出方法的檢出限和定量下限。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品液質(zhì)圖

矮壯素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜圖如圖1、圖2所示。

圖1 矮壯素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of chlormequat chloride

圖2 矮壯素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Fig.2 MS of chlormequat chloride

由圖1高效液相色譜圖可以得出，1.3.4試驗(yàn)條件下，矮壯素保留時(shí)間為3.151 min。矮壯素為脂肪胺鹽類物質(zhì)，在進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后能產(chǎn)生穩(wěn)定的[M-Cl]分子離子（122.0），[M-Cl]離子作為母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜發(fā)生α斷裂后，接著發(fā)生氫重排及i斷裂并產(chǎn)生有顯著豐度的m/z58.1及63.1的離子碎片，由圖2可見，定性離子選擇豐度較高的m/z58.1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

矮壯素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

根據(jù)回歸方程y=2 134.1x+161.35和線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，可知此方法在0～15 μg/L的濃度范圍具有良好的線性關(guān)系。

2.3 番茄加工品矮壯素殘留量

經(jīng)3次重復(fù)測定并計(jì)算，得果脯中矮壯素殘留量為0.150 mg/kg。以此含量為實(shí)驗(yàn)室自制櫻桃番茄果脯中矮壯素的本底含量，并進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

圖3 矮壯素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curve of chlormequat chloride

2.4 檢測方法的可靠性

2.4.1 加標(biāo)回收率和精密度

加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見表1。

表1 矮壯素加標(biāo)回收率及精密度（n=3）Table 1 Average recoveries and RSD of chlormequat chloride（n=3）

續(xù)表1 矮壯素加標(biāo)回收率及精密度（n=3）Continue table 1 Average recoveries and RSD of chlormequat chloride（n=3）

由表1可知，方法的加標(biāo)回收率在73.33%～90.60%之間，精密度在3.34%～7.87%之間，說明該方法測量櫻桃番茄加工品中矮壯素殘留量較為可靠。

2.4.2 方法的檢出限

根據(jù)前述方法得出的檢出限和定量下限分別為0.01 mg/kg和 0.02 mg/kg。

3 結(jié)論

以櫻桃番茄加工品為研究對(duì)象，采用甲醇提取，強(qiáng)陽離子固相萃取方式分離純化了矮壯素，并使用液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜方式進(jìn)行了檢測。方法的加標(biāo)回收率為73.33%～90.60%，精密度為3.34%～7.87%，檢出限低至0.01 mg/kg。該方法能夠滿足目前矮壯素的檢測需求，為摸清番茄加工品中矮壯素的本底含量和果脯中矮壯素的脫除奠定了方法基礎(chǔ)。

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The Detection Method of Chlormequat Chloride in Cherry Tomato Preserves

ZHAO Bing-nan1，HAN Yue2，YIN Ren2，ZHANG Shuang-ling2，*
（1.Chengyang NO.1 High School of Qingdao，Qingdao 266109，Shandong，China；2.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

Cherry tomato preserves are agricultural products for export in China，and the residues of chlormequat chloride have become a bottleneck restricting its export，therefore，a detection method of the residues was established.The processed products of cherry tomato preserves were selected as the research object，the chlormequat chloride was extracted through the methanol，then the extraction was separated and purificated by strong cation solid-phase extraction （SPE）and detected by HPLC/MS/MS，the reliability of detection method was analyzed at the same time.The results showed that the detection and quantification limit of the method was 0.01 mg/kg and 0.02 mg/kg respectively，the recovery was 73.33%-90.60%and the precision was 3.34%-7.87%.The method provided a basis for the investigation of the content of chlormequat chloride in tomato and the degradation of chlormequat chloride residues.

cherry tomato；chlormequat chloride；solid-phase extraction（SPE）；detection method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.037

趙炳喃（2000—），男（漢），高中在讀，研究方向：飲食安全。

*通信作者：張雙靈（1974—）女，副教授，博士，主要從事食品安全檢測方面的相關(guān)研究。

2017-03-04