改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)方法的建立*

井中旭 張妍妍 馮宇飛

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·150040）

改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)方法的建立*

井中旭 張妍妍 馮宇飛**

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·150040）

目的：對(duì)被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)影響因素佐劑種類(lèi)、劑量、致敏次數(shù)、間隔時(shí)間等進(jìn)行考察，建立靈敏、可靠的過(guò)敏反應(yīng)體內(nèi)試驗(yàn)方法，為中藥注射劑過(guò)敏性檢測(cè)提供可靠的方法。方法：將大鼠進(jìn)行多次致敏后得到抗血清后，將抗血清背部注射于空白大鼠后激發(fā)。結(jié)果：卵白蛋白劑量為5mg/只，隔日致敏1次，共免疫3次，末次致敏后15天，制備抗血清，于被動(dòng)皮膚致敏后24h用抗原與伊文思蘭的混合溶液激發(fā)為最佳的PCA方法。結(jié)論：建立了可靠、靈敏的被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)方法，為中藥注射劑過(guò)敏性檢測(cè)及過(guò)敏原的篩選提供了可靠方法。

改良 被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn) 方法 建立

目前，中藥注射劑的過(guò)敏性問(wèn)題較為突出，被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（PCA）是進(jìn)行中藥注射劑過(guò)敏性檢測(cè)常用的體內(nèi)研究方法，其評(píng)價(jià)指標(biāo)可量化，不易受主觀判斷的影響，但靈敏度不高，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果[1]，因此，本研究主要針對(duì)中藥注射劑的過(guò)敏性檢測(cè)的臨床前與臨床反應(yīng)不符這個(gè)問(wèn)題，立足于前人研究基礎(chǔ)[2-5]對(duì)中藥注射劑經(jīng)典的體內(nèi)評(píng)價(jià)方法被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（PCA）進(jìn)行方法學(xué)研究，對(duì)其主要影響因素佐劑種類(lèi)、致敏劑量、致敏次數(shù)、間隔時(shí)間以及激發(fā)時(shí)間等因素進(jìn)行考察，通過(guò)優(yōu)化各影響因素，旨在建立可靠、靈敏的中藥注射劑過(guò)敏性檢測(cè)以及致敏物質(zhì)篩方法，并采用所建立的PCA方法對(duì)雙黃連粉針和刺五加注射液的過(guò)敏性進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、伊文思蘭（進(jìn)口分裝）；卵白蛋白（進(jìn)口分裝）均購(gòu)于sigma公司；生理鹽水（廣東大冢制藥有限公司，批號(hào)：1410111）；氫氧化鋁佐劑（自制）；雙黃連粉針（批號(hào)為1412211、1504209、1502202，×××制藥有限公司）；刺五加注射液（批號(hào)為20140308、20140704、20140917，×××制藥有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大白鼠，雄性，體重180±20g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供，合格證號(hào)為SCXK(黑)2008004號(hào)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗血清的制備

根據(jù)選擇的佐劑種類(lèi)、劑量、致敏次數(shù)、間隔時(shí)間的不同將SD大鼠隨機(jī)分為16組，每組6只，處理方式見(jiàn)表1，每組分別于末次致敏后第14、15天眼眶采血，室溫自然凝固，6000rpm、離心20min，分離血清并按組合并，置-60℃冰箱備用。

表1 抗血清制備分組處理方法Table 1 Different methods of preparation of antiserium

1.3.2 被動(dòng)致敏及抗原激發(fā)方法

取上述抗血清，加生理鹽水稀釋為1:2、1:4等不同比例的抗血清稀釋液。分別將抗血清原液和稀釋液分別皮內(nèi)注射于空白大鼠背部，每組6只，分別于24和48小時(shí)后用1%伊文思蘭和抗原的混合溶液激發(fā)。

1.3.3 結(jié)果判定方法

激發(fā)后半小時(shí)處死大鼠，剪取背部皮膚，測(cè)量?jī)?nèi)層皮膚藍(lán)斑直徑。直徑大于5mm者判定為陽(yáng)性，不規(guī)則斑點(diǎn)直徑按長(zhǎng)徑和短徑之和的一半計(jì)算。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)直觀結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。圖1為卵白蛋白第15天抗血清致敏激發(fā)組，大鼠背部抗血清原液和1:2抗血清稀釋液被動(dòng)皮膚致敏處，呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色橢圓形斑點(diǎn)，長(zhǎng)短直徑分別為10mm、6mm、4.7mm、7.7mm，圖2為卵白蛋白第14天抗血清致敏激發(fā)組，大鼠背部抗血清原液和1:2抗血清稀釋液被動(dòng)皮膚致敏處，同樣呈現(xiàn)藍(lán)色橢圓形斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)顏色變淡，長(zhǎng)短直徑分別為7mm、5mm，3mm、5mm，由圖1、圖2可知抗血清效價(jià)最高時(shí)間為末次致敏后第15天。

圖1 卵白蛋白第15天抗血清所得結(jié)果

圖2 卵白蛋白第14天抗血清所得結(jié)果

圖3 刺五加注射液致敏后所得結(jié)果

圖4 雙黃連粉針致敏后所得結(jié)果

2.2 改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)藍(lán)斑直徑結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。由統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，不同的佐劑致敏條件下各組間存在顯著性差異（p＜0.05），致敏間隔時(shí)間不同、致敏次數(shù)不同各組間存在顯著性差異（p＜0.05）。

抗血清原液致敏激發(fā)后，處理組2-6，14-16組的 24h與48h的藍(lán)斑直徑有顯著性差異（p＜0.05），24h的藍(lán)斑直徑顯著高于48h的藍(lán)斑直徑，抗血清原液1:2稀釋液致敏激發(fā)后，處理組2、5、9組的 24h與48h的藍(lán)斑直徑有顯著性差異（p＜0.05）。24h的藍(lán)斑直徑顯著高于48h的藍(lán)斑直徑。

當(dāng)卵白蛋白劑量為5mg/只，致敏時(shí)間為隔日1次，免疫次數(shù)為3次，抗血清制備時(shí)間為末次致敏后15天，激發(fā)時(shí)間為被動(dòng)皮膚致敏后24h時(shí)，該條件下原液斑點(diǎn)的陽(yáng)性反應(yīng)率為100%，1:2稀釋斑點(diǎn)的陽(yáng)性反應(yīng)率為66.7%。

表2 不同抗血清被動(dòng)皮膚致敏后大鼠皮膚藍(lán)斑直徑（，mm，n=3)Table 2 Diameter of blue spot after rat skin was sensitized passively by antiserum (,mm, n=3)

注：同種抗血清間，不同激發(fā)時(shí)間差異顯著*：P＜0.05；不同處理組間原液斑點(diǎn)直徑差異顯著△：P＜0.05

4 改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)檢驗(yàn)雙黃連粉針和刺五加注射液過(guò)敏性

健康SD大鼠，隨機(jī)分為8組，每組6只，分別為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照生理鹽水組、雙黃連粉針2960mg/kg給藥組，刺五加注射液批號(hào)為34ml/kg 給藥組溶于生理鹽水配制成各藥液與弗氏完全佐劑混合，按陽(yáng)性藥的方法將大鼠致敏，末次致敏后第15天眼眶采血，室溫自然凝固，6000rpm、離心20min，分離血清并按組合并，置-20℃冰箱備用，將抗血清原液加生理鹽水稀釋為1:2、1:4等不同比例的抗血清稀釋液。分別將抗血清原液和稀釋液分別皮內(nèi)注射于空白大鼠背部，每組6只，分別于24小時(shí)后用1%伊文思蘭和抗原的混合溶液激發(fā)，30min后取背部皮膚觀察藍(lán)斑情況，結(jié)果見(jiàn)圖3，4，雙黃連粉針組藍(lán)斑直徑均小于5mm，無(wú)陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，刺五加注射液批號(hào)為20100702組出現(xiàn)藍(lán)斑直徑大于5mm陽(yáng)性結(jié)果，藍(lán)斑直徑陽(yáng)性率為84%。

5 討論

5.1 被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)（PCA）是一種常用的注射劑過(guò)敏物質(zhì)篩選方法。將受試物致敏動(dòng)物的血清（含豐富的IgE抗體）給正常動(dòng)物皮內(nèi)注射，IgE的Fc端與皮膚的肥大細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合，形成IgE的復(fù)合物，使肥大細(xì)胞致敏。當(dāng)抗原攻擊時(shí)，抗原與肥大細(xì)胞表面上IgE的Fab端結(jié)合，導(dǎo)致IgE分子結(jié)構(gòu)的改變，引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放過(guò)敏介質(zhì)如組胺、慢反應(yīng)物質(zhì)等，使皮膚局部血管的通透性增加，使靜脈注射抗原的同時(shí)注入的伊文思藍(lán)染料在該皮膚處滲出著色。根據(jù)局部皮膚藍(lán)染范圍或程度，可判定血管通透性變化的大小，繼而判定皮膚過(guò)敏反應(yīng)的程度[6]。其中佐劑種類(lèi)、致敏劑量、致敏次數(shù)、間隔時(shí)間以及激發(fā)時(shí)間等因素是PCA方法成功的關(guān)鍵，本研究通過(guò)對(duì)上述各影響因素的考察，建立靈敏、可靠的改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)方法，以明確是否因試驗(yàn)方法的不足而無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)中藥注射劑臨床應(yīng)用的過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生。

5.2 PCA試驗(yàn)中多采用豚鼠及大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2-5]，本實(shí)驗(yàn)初期，也將豚鼠作為研究對(duì)象對(duì)其PCA試驗(yàn)條件進(jìn)行摸索，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，多數(shù)豚鼠死亡，分析原因可能是因?yàn)殡嗍髮?duì)弗氏佐劑的毒性不耐受，因此，最終只選擇大鼠進(jìn)行PCA試驗(yàn)，筆者建議，PCA試驗(yàn)中動(dòng)物的選擇以大鼠為宜。

5.3 通過(guò)對(duì)佐劑種類(lèi)的考察發(fā)現(xiàn)，選擇弗氏佐劑作為佐劑時(shí)，大鼠對(duì)抗原較為敏感；對(duì)致敏劑量以及致敏次數(shù)考察發(fā)現(xiàn)，致敏效果與致敏劑量成正比，但與致敏次數(shù)不呈依賴(lài)關(guān)系；對(duì)致敏間隔時(shí)間及激發(fā)時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，其致敏間隔時(shí)間以1天為宜，激發(fā)時(shí)間為背部皮膚致敏后24h為最佳時(shí)間。

5.4 近年來(lái)，隨著中藥注射劑應(yīng)用范圍擴(kuò)大和使用人群的增加，不良反應(yīng)也日漸增多，其不良反應(yīng)臨床報(bào)道呈日趨增多之勢(shì)，甚者造成了過(guò)敏性休克而死亡[7]。因此，建立一套能夠快速檢測(cè)中藥注射劑致敏原的方法不但可以減少過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生、指導(dǎo)臨床用藥，更主要的是可以制定中藥注射劑雜質(zhì)定性定量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)今后中藥注射劑安全性問(wèn)題給予根本性的解決，也為傳統(tǒng)中藥和中藥現(xiàn)代化的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過(guò)臨床調(diào)查，本研究選擇了在臨床上發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的三個(gè)批號(hào)的兩種中藥注射劑作為研究對(duì)象，采用改良被動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)對(duì)其致敏性進(jìn)行了研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)致敏批號(hào)雙黃連粉針劑，但發(fā)現(xiàn)臨床上存在過(guò)敏反應(yīng)的某些批號(hào)的刺五加注射液可引起大鼠產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。

5.5 分析臨床上高頻率報(bào)道的雙黃連粉針過(guò)敏反應(yīng)，多為類(lèi)過(guò)敏現(xiàn)象，而刺五加注射液的過(guò)敏癥狀主要是由免疫系統(tǒng)參與的過(guò)敏反應(yīng)。因此，分別采用靈敏、可靠的類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)方法和過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè)方法對(duì)雙黃連粉針及刺五加注射液進(jìn)行研究，篩選其中的致敏物質(zhì)是十分必要的。5.6 通過(guò)本研究，建立了中藥注射劑過(guò)敏反應(yīng)更為靈敏的體內(nèi)評(píng)價(jià)方法，這為我們進(jìn)行中藥注射劑的過(guò)敏性研究以及對(duì)其致敏物質(zhì)進(jìn)行篩選提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

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黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（ZHY16-095）；黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（ZHY16-098）；黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（LBH-Z14203）

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