蓯蓉總苷膠囊對AD大鼠行為學障礙的影響*

鄭德俊 高俊鵬 方穗雄 張彥紅 張麗華

（廣州市第一人民醫(yī)院·510180）

蓯蓉總苷膠囊對AD大鼠行為學障礙的影響*

鄭德俊 高俊鵬 方穗雄 張彥紅 張麗華

（廣州市第一人民醫(yī)院·510180）

目的：探討蓯蓉總苷膠囊對阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）大鼠行為學障礙的影響。方法：用水迷宮法分別測試AD大鼠造模前后及給予蓯蓉總苷膠囊干預后的學習記憶功能改善情況。結果：模型組AD大鼠在水迷宮找到平臺的時間明顯延長，經過的路程明顯增加，給予蓯蓉總苷膠囊2w后行為學改善明顯。結論：蓯蓉總苷膠囊可改善AD大鼠行為學障礙。

早老性癡呆 蓯蓉總苷膠囊 行為學障礙

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)，又稱早老性癡呆，統(tǒng)計表明，80歲以上老年人中AD患病率達到30%，全球AD患者數量為2600萬左右。老年期癡呆，屬中醫(yī)學“老年呆證”、“文癡”“癲”、“言語錯亂”、“郁證”等范圍。既往研究表明蓯蓉總苷膠囊治療老年性癡呆取得較好療效，本研究探討了蓯蓉總苷膠囊膠囊對AD老齡鼠行為學障礙的影響，了解其對AD作用及機理。蓯蓉總苷膠囊可以有效改善癡呆患者的認知功能、行為生活能力[1]，但其機制目前未明。因此，本研究擬在前期研究基礎上，以AD大鼠模型為研究對象，通過蓯蓉總苷膠囊對AD模型鼠水迷宮試驗進行檢測，以期在動物模型中探索蓯蓉總苷膠囊治療AD的效果，為該藥的進一步臨床應用提供堅實的分子生物學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

大于20個月齡雄性SD大鼠60只，清潔級，體重360±20g運到實驗室，置于安靜清潔環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，室內溫度控制在24±2℃，定時給予清潔飲水和大鼠專用飼料。適應性喂養(yǎng)一周后，無不良反應，飲食、飲水正常，即開始進行Y型水迷宮篩選，剔除不合格(即反應過于遲鈍或特別敏感)的大鼠，再將合格大鼠分別稱重后隨機分為4組：正常組、假手術組、模型組、蓯蓉總苷組，每組10只。

1.2 分組及受試對象給藥方式

正常組：作為實驗對照組，自由攝食及飲水，不作任何處理，待其余3組造模結束后與之同時進行Morris水迷宮定位航行實驗和空間探索實驗。

模型組：不進行任何治療，自由攝食及飲水8周，即行造模(具體方法見后AD大鼠模型制備)，造模完畢后，大鼠正常喂養(yǎng)兩周(以便藥物的吸收)即行行為學檢測。

假手術組：顱內注射與Aβ1-42等量生理鹽水，余同模型組。

蓯蓉總苷組：造模完畢后,大鼠正常喂養(yǎng)兩周進行行為學檢測。

1.3 模型制備

Aβ1-42孵育：試劑首先被溶解到0.4到4mol的二甲基亞砜溶液里，然后此溶液稀釋在10mmol的磷酸二氫鈉緩沖液中，37℃下孵育一周后使用。

造模方法：大鼠稱重，用10%的水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉后，固定于顱腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平，剪開頭皮，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進行定位，在前囟后方3.3mm，中線左右各旁開1.5mm，用牙科鉆各鉆一小孔穿顱(直徑約1mm),垂直插入微量注射器，使針尖自顱骨表面緩慢進針3.3mm至海馬。用微量注射器分別注入5μlAβ1-42，5min內注完，注射后留針5min，按1.0mm/min速度緩慢拔針。以免拔針時藥物溢出。術后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，局部外敷青霉素G粉，并于術后三日內(包括當日)每日肌注青霉素G80萬單位預防感染。

1.4 行為學檢測方法

參照有關文獻[1]操作，測試大鼠在Morris水迷宮（Morris water maze,MWM）實驗中逃避潛伏期的長短和跨越原平臺區(qū)位置的次數，以了解大鼠的學習和記憶能力。而此過程又分為定位航行實驗與空間探索實驗。

1.4.1 定位航行實驗 實驗前1天(即在造模完成第14天)將大鼠放入水池自由游泳2min，讓其熟悉水迷宮環(huán)境。正式水迷宮實驗測試共歷時5天，每天時間固定。實驗開始時，將平臺置于一個固定的象限，每個時間段分別從池壁四個起始點將大鼠面向池壁放入水池，大鼠入水點順序為：第一天，E-S-W-N；第二天，S-W-N-E；第三天，W-N-E-S;第四天，N-E-W-S；第五天，E-W-N-S。記錄每次找到平臺的時間(即逃避潛伏期，以秒為單位計時)和距離（單位為cm）。如大鼠在120s內找不到平臺，由實驗者將其引上平臺，潛伏期記為120s，每次間隔5min讓大鼠休息，再行下次實驗。

1.4.2 空間探索實驗 定位航行實驗第5天(既造模完成后第19天)的最后一次結束時撤除平臺，將大鼠從任選的非平臺象限入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠2min內跨越原平臺的次數。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件，計算大鼠定位航行實驗中平均找到平臺時間的均數，以及探索實驗中跨越平臺的次數。所得數據進行方差分析，根據方差結果，再選擇相應的統(tǒng)計分析方法。

2 結果

2.1 造模后大鼠的一般情況

造模后發(fā)現大多數大鼠眼瞼下垂，活動能力低下，自發(fā)運動減少；也有些大鼠術后自發(fā)運動增加。術后第2天所有存活的大鼠都恢復正常。在實驗造模和飼養(yǎng)過程中部分大鼠死亡，最終完成實驗各組例數見表1

2.2 造模對大鼠學習記憶的影響

在進行水迷宮實驗前，用攀繩實驗測定了全部大鼠的運動功能，結果表明全部大鼠的運動功能比較無統(tǒng)計學意義。

2.3 定位航行試驗

從表1可見，與正常組相比，模型組的反應時間最長，(P＜0.01)；蓯蓉組動物的反應時間顯著短于模型組，有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組大鼠找到平臺時間及平臺距離比較

表1 各組大鼠找到平臺時間及平臺距離比較

注：1）與正常組比較，P＜0.01；2）與模型組比較P＜0.01

組別n找到平臺時間（s）找到平臺距離（cm）第1天第5天第1天第5天正常組1064.7±0.8041.6±0.861945.3±10.731145.76±10.09假手術組1071.63±0.911,2)64.8±0.651,2)2102.7±11.551,2)1843.7±10.641,2)模型組9100.3±2.321)97.9±1.311)4645.9±11.061)4169.7±11.341)蓯蓉組1066.74±0.601,2)53.12±0.751,2)2167.58±12.241,2)1789.21±10.711,2)

2.4 空間探索實驗

從表2中可見蓯蓉組跨越平臺次數明顯多于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)

表2 大鼠2min內跨越原平臺的次數

3 討論

阿爾茲海默病（Alzheimer’s Disease）又稱早老性癡呆，是一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現為進行性的認知功能減退，預后不良，患者一般死于肺栓塞和繼發(fā)感染。阿爾茲海默病常散發(fā)，其臨床發(fā)病率女性是男性的1.5-3倍。神經病理學特征主要包括β樣淀粉樣蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉積形成的細胞外老年斑（senile plaque,SP）、tau蛋白的過度磷酸化形成的神經細胞內神經原纖維纏結以及神經元的丟失伴隨著膠質細胞的增生等，其發(fā)病機制與氧自由基損傷、炎癥反應、蛋白質構象異常等有關。提示早期對高血壓、高血脂等血管危險因素進行干預有助于預防AD。

阿爾茲海默病屬中醫(yī)學“老年呆證”、“癲”等范圍。本病病位在腦與心、腎、肝、脾關系密切，其共同病因為痰瘀阻絡、肝腎不足、脾腎不足或氣虛血弱，兼風火、痰熱為特點，證候多實或虛實并見，其治療不宜一味進補，補則壅滯更甚[2]。蓯蓉總苷膠囊具有補腎陽、益精血、潤腸通便之功效，現代廣泛運用于老年性癡呆、陽痿、習慣性便秘等。現代藥理學表明，肉蓯蓉具有抗衰老、增強記憶、提高免疫力等多種功能。補腎中藥肉蓯蓉的有效成分蓯蓉總苷可有效改善癡呆患者的認知功能、生活能力、行為及中醫(yī)癥狀[4]。

本實驗結果顯示，阿爾茲海默病模型大鼠在水迷宮找到平臺的時間明顯延長，經過的路程明顯增加，蓯蓉總苷膠囊組大鼠在水迷宮找到平臺的時間明顯減少，經過的路程明顯縮短，給予蓯蓉總苷膠囊2w后行為學改善明顯，表明蓯蓉總苷膠囊可顯著改善阿爾茲海默病模型大鼠的行為學障礙和學習記憶功能。

綜上所述，我們認為，蓯蓉總苷膠囊在早老性癡呆治療中起到改善行為學障礙的作用。目前中藥治療早老性癡呆研究應突破局限于穩(wěn)定血管，維持腦灌注方面，進一步可以通過對細胞周期蛋白CDK2、p21/cip的角度進一步闡明蓯蓉總苷改善AD行為學障礙的可能機制，最終有助于中藥在臨床上更積極有效的應用于AD的早期干預。

[1] Wolozin, Benjamin. Cholesterol and the Biology of Alzheimer's Disease[J]. Neuron.2004,(41):7-10.

[2] 林志宏，朱丹妮，嚴永清，等.當歸芍藥散防治老年期癡呆的物質基礎與作用機理研究I—組方作用協(xié)同性與選擇性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2002,8(1):16-18.

[3] 楊建華,胡君萍,熱娜·卡斯木，等.基于酵母雙雜交技術篩選肉蓯蓉降血脂活性成分[J].藥效與毒理學研究.2011,22(3):252-255.

[4] 張彥紅,朱磊,梁偉雄.蓯蓉總苷膠囊治療髓海不足型輕中度血管性癡呆40例[J].中醫(yī)研究,2012;6(25):41-44.

廣東省中醫(yī)藥管理局科研課題（項目編號：20141214）