miRNA-93在PCOS大鼠血清中的表達

邢瑩瑩，李青春，韓艷艷，李小琳

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是生殖功能障礙與糖代謝異常并存的一種特殊疾病。多以高雄激素血癥、持續(xù)性無排卵或排卵障礙、胰島素抵抗和高脂血癥為主要特點[1]。目前對PCOS的研究多借助于動物實驗，PCOS的造模方法有很多，其中脫氫表雄酮(dehydroepi androsterone，DHEA)造模是比較理想的造模方法[2]，從生殖和代謝方面全面評估模型動物的表型特征，為PCOS模型的建立奠定研究基礎。

微小RNA(miRNA)是一類約由19～25個核苷酸組成內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達或促進靶基因mRNAs降解發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3]。每個miRNA都可以調(diào)控上百個基因的表達，據(jù)推測，人類基因組上約有1/3基因的表達都受到miRNA的調(diào)控[4]。近年來，血液中的miRNA又稱為循環(huán)miRNA，血清中miRNA含量豐富，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐核酸酶并且容易檢測到[5-6]，在疾病的早期篩查、區(qū)分高危人群等方面具有廣闊的應用前景。循環(huán)miRNA的含量變化可作為多種疾病的診斷標志物。本文旨在研究miRNA-93及靶基因血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor, VEGFA)在PCOS大鼠模型血清中的表達及相關作用，以期為PCOS的診斷和治療提供新的靶點，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選用3周齡雌性SD清潔級大鼠40只，體質(zhì)量(50±20) g，由河南省動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于河南科技大學第一附屬醫(yī)院新區(qū)醫(yī)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于IVC專用籠，喂食標準飼料，飲用水使用大鼠專用水，籠內(nèi)墊料每周更換2次，動物實驗中心溫度維持在(22±1) ℃，濕度為50%左右，明暗交替周期設為12 h。

1.1.2主要試劑及儀器DHEA購于索萊寶公司，注射用大豆油購于RUBIO公司。miRNA提取試劑盒、miRNA Cdna Synthesis Kit、miRNA qPCR Assay Kit，均購于康為世紀生物科技有限公司。50%葡萄糖注射液大鼠胰島素(insulin,INS)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，大鼠VEGFA酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，INS酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。熒光定量PCR儀器(美國伯樂公司，Thermo Heraeus Multifuge X1R臺式高速冷凍離心機(美國Thermo公司)。羅氏優(yōu)越型血糖儀(德國ROCHE公司)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建動物模型將40只雌性SD大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組20只，觀察組大鼠每日頸背部皮下注射DHE6 mg·100 g-1體質(zhì)量+0.2 mL無菌注射用油，對照組每日頸背部皮下注射0.2 mL無菌注射用油劑。均于上午10時，連續(xù)皮下注射28 d。

1.2.2標本取材在造模28 d結(jié)束后，5%水合氯醛腹腔注射麻醉后摘眼球法，取5～10 mL血，室溫放置1 h，以2 000 r·min-1離心10 min，分離血清后進行解剖，取雙側(cè)卵巢，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS)溶液清洗，顯微鏡下分離卵巢多余的脂肪組織，并稱重。固定于中性福爾馬林溶液中，進行石蠟包埋切片，用于HE染色。

1.2.3觀察內(nèi)容及方法①每日記錄大鼠體質(zhì)量，解剖后用電子體質(zhì)量測量儀、電子精密天平及游標卡尺測量子宮、卵巢質(zhì)量。卵巢質(zhì)量為左、右卵巢之和。②動情周期：連續(xù)2個周期(每個周期4～5 d)進行陰道脫落細胞涂片，采用巴氏染色法觀察大鼠動情周期。③酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒(購于武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)檢測大鼠血清INS、VEGFA。④觀察兩組大鼠雙側(cè)卵巢大體解剖，石蠟包埋卵巢組織，進行HE染色，光鏡下觀察其組織形態(tài)。⑤口服胰島素耐量實驗(insulin tolerance test,ITT)：大鼠禁食不禁水12 h，分別以0.5 U·kg-1的劑量腹腔注射50%胰島素，鼠尾尖取血，用羅氏優(yōu)越型血糖儀(德國 ROCHE 公司)測定大鼠灌胰島素后0、15、30、60、120 min的血糖值。⑥口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test,OGTT)：大鼠禁食不禁水12 h，以3 g·kg-1劑量灌服50% 葡萄糖溶液，尾尖取血，用血糖儀測定大鼠灌糖后0、15、30、60、120 min的血糖值。⑦計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：HOMA-IR=空腹血糖(mmol·L-1)×空腹胰島素(mIU·L-1)/22.5。⑧血脂測定：應用全自動免疫發(fā)光儀(西門子DPC IMMULITE 2000)測定大鼠黃體生成激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇 (E2)及代謝指標血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。⑨RT-PCR檢測大鼠血清miRNA-93表達引物借助https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站進行設計，委托上海生工有限公司合成。具體步驟按miRNA提取試劑盒、miRNA Cdna Synthesis Kit、實時定量熒光PCR試劑盒檢測說明書操作(均購于康為世紀生物科技有限公司)，miRNA-93上游引物：5’-TGCGCCAAAGTGCTGTTCGTGCA-3’，miRNA-93下游引物為試劑盒通用引物，擴增產(chǎn)物為：100bp，內(nèi)參為U6，上游引物為5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游為5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’，擴增產(chǎn)物為：110 bp，采用2-△△Ct法進行分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量、腹圍、卵巢、子宮質(zhì)量及比較觀察組大鼠體質(zhì)量、子宮質(zhì)量明顯高于對照組，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大鼠腹圍、卵巢模型組略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠體質(zhì)量，腹圍，卵巢、子宮質(zhì)量及比較

注：①與對照組比較，P<0.01。

2.2大鼠動情周期的變化對大鼠進行2個周期(1個周期4～5 d)的陰道涂片巴氏染色觀察動情周期，觀察組大鼠動情周期不規(guī)律，提示無排卵；對照組動情周期規(guī)律(見圖1)。動情前期(A)以小、圓、有核上皮細胞為主，持續(xù)時間12 h左右。動情期(B)持續(xù)時間9～15 h以不規(guī)則狀無核上皮細胞為主。動情后期(C)有核上皮細胞，無核上皮細胞，白細胞均存在為主，持續(xù)時間14～18 h。間情期(D)白細胞為主，持續(xù)時間60～70 h。

圖1 大鼠動情周期的變化(巴氏染色，×200)

2.3大鼠血清FSH、LH、T、E2水平變化觀察組大鼠血清FSH、T、LH水平較對照組明顯升高，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組LH比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，E2水平較對照組明顯降低，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠血清 FSH、LH、T水平比較

注：①與對照組比較，P<0.01。FSH:促卵泡成熱激素；LH黃體生成激素；T：睪酮；E2:雌二醇。

2.4大鼠血脂變化觀察組大鼠血清甘油三酯(TG)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。觀察組與對照組膽固醇(TC)水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 兩組大鼠血清TC、TG比較

注：①與對照組比較，P<0.01。TG:甘油三酯；TC:膽固醇。

2.5卵巢形態(tài)學變化觀察組大鼠卵巢表面蒼白，體積增大；鏡下見卵泡多呈囊性擴張，變成囊泡即空卵泡，顆粒細胞層數(shù)減少多為2～3層、排列疏松，各級卵泡及黃體少見。對照組大鼠卵巢色澤紅，表面多個紅點或紫點；鏡下可見各級發(fā)育卵泡及多個黃體，卵泡內(nèi)顆粒細胞呈多層，多為8～9層，結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠卵巢切片(HE染色，×40)

2.6OGTT與ITT結(jié)果檢測大鼠0、15、30、60、120 min血糖值。結(jié)果表明與對照組相比觀察組大鼠不能診斷為糖尿病，而胰島功能受損，結(jié)果見圖3-4。

2.7兩組大鼠空腹血糖、HOMAI-IR比較觀察組空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)值明顯高于對照組(P<0.01)，觀察組大鼠空腹胰島素(fasting insulin,FINS)、HOMAI-IR明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明大鼠存在胰島素抵抗，結(jié)果見表4。

圖3 糖耐量實驗

圖4 胰島素耐量實驗

組 別nFBG/(mol·L-1)FINS/(mIU·mL-1)HOMAI-IR觀察組204.45±0.76①4.14±0.86①0.82±0.41①對照組203.65±0.50 1.34±0.34 0.22±0.05 t3.776.456.35P0.000.000.00

注：①與對照組比較，P<0.01。FBG:空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HOMAI-IR：胰島素抵抗指數(shù)。

2.8ELISA檢測血清中VEGFA的表達觀察組VEGFA的表達較對照組顯著增加，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：觀察組卵巢組織中VEGFA的表達增加(P<0.01)，結(jié)果見表5。

表5 兩組VEGFA水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05。VEGFA:血管內(nèi)皮生長因子。

2.9大鼠血清miRNA-93的表達量miRNA-93相對基因表達的結(jié)果顯示：觀察組與對照組中相對表達量分別為1.55∶1；SD為0.097、0.032。與對照組比較，miRNA-93在觀察組大鼠血清中的表達升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,n=6)，結(jié)果見圖6。

A:觀察組；B:對照組。1：mark；4～8：觀察組；10～14：對照組。圖6 熒光定量PCR檢測miRNA-93結(jié)果

3 討論

PCOS是育齡期女性常見的內(nèi)分泌疾病，患病率為5%～10%，占無排卵性不孕患者的70%～80%[7]。病因至今尚未闡明，研究認為其可能是由于某些遺傳基因與環(huán)境因素相互作用所致[8-9]。此外，一些細胞因子，如VEGFA也與不孕有關。有研究顯示卵巢血管的生成與PCOS的發(fā)病機制密切相關[10]。PCOS的診斷標準在國際上一直存在較大的爭議，目前比較廣泛運用于臨床的診斷標準主要有：2003年5月歐洲人類生殖和胚胎學會和美國生殖醫(yī)學會(ESHRE/ASRM)鹿特丹會議提出的PCOS診斷標準[11]。2010年中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科分會內(nèi)分泌學組專家學者制定的PCOS診斷標準[12]。現(xiàn)階段臨床醫(yī)學關于PCOS的診斷方法有基礎體溫測定、B超、診斷性刮宮、腹腔鏡以及內(nèi)分泌測定等[13]。由于PCOS患者臨床取材困難，大鼠具有價格低廉、遺傳背景穩(wěn)定、動情周期規(guī)律、便于集中管理監(jiān)測等優(yōu)點。采用雄激素誘導動物使其產(chǎn)生伴有胰島素抵抗的PCOS模型已經(jīng)成為經(jīng)典可靠的實驗模型[14]。本實驗采用脫氫表雄酮造模方法構(gòu)建PCOS大鼠模型，結(jié)果顯示模型組中大鼠體質(zhì)量增加、性周期紊亂、卵巢呈多囊狀改變、卵泡成熟障礙，伴有高雄激素血癥的同時還出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂、血糖紊亂及胰島素抵抗、高胰島素血癥。這與人類PCOS有很多相似之處，與國內(nèi)外一些研究結(jié)果是一致的。

循環(huán)miRNA是一類在血清、血漿等體液中穩(wěn)定存在的miRNA分子，具有差異表達明顯、檢測靈敏、取材方便等特點。大量研究表明循環(huán)miRNA在疾病診斷中也具有一定參考價值，可作為一種新型診斷標志物分子。近年來，人們發(fā)現(xiàn)在子宮、卵巢、輸卵管等女性生殖器官中均有miRNA的表達，并廣泛參與調(diào)控女性卵泡發(fā)育成熟、受精、著床及胚胎發(fā)育等生理過程，對維持女性正常生育功能起重要作用[15]。miRNA在PCOS性激素合成分泌、胰島素抵抗、卵泡發(fā)育及成熟、細胞凋亡、炎癥等方面均有一定調(diào)節(jié)作用[16]。PCOS患者脂肪組織中miRNA-93的高表達可導致GLUT4基因的表達下調(diào)，miRNA-93的高表達與胰島素抵抗指數(shù)有很大的相關性[19]。研究表明miRNA-93可通過結(jié)合靶基因細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑1A(CDKN1A)3′-UTR位點在PCOS患者中呈高表達，影響卵泡正常發(fā)育及成熟，導致排卵障礙及不孕[18]。PCOS患者血清中miRNAs表達譜存在差異，其異常的miRNAs表達通過影響基因轉(zhuǎn)錄后的水平，參與PCOS的發(fā)生發(fā)展。

VEGFA是一種特異的與血管內(nèi)皮細胞結(jié)合而發(fā)揮作用的因子，其功能包括誘導血管生成、增加血管通透性[20]。VEGFA對血管的再生、卵泡血管化、卵泡內(nèi)的氧化都發(fā)揮著重要作用，因此影響卵泡成熟、卵母細胞質(zhì)量、受孕及胚胎的生長發(fā)育[21]。miRNA可以通過調(diào)節(jié)數(shù)個靶基因發(fā)揮不同作用，而一個靶基因則可被數(shù)個miRNA調(diào)控，其相互作用的互聯(lián)網(wǎng)絡十分復雜。Long等證實miRNA-93的靶基因是血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)[19]。本實驗采用RT-PCR、ELISA分別檢測PCOS大鼠血清中miRNA-93及靶基因VEGFA的表達水平，結(jié)果顯示觀察組與對照組相比血清中miRNA-93及靶基因VEGFA表達一致呈高表達，提示VEGFA在卵巢內(nèi)異常表達、分泌并釋放入血，可能是卵巢間質(zhì)血管化增加的基礎，最終導致PCOS患者無優(yōu)勢卵泡發(fā)育的原因之一。miRNA-93可通過結(jié)合靶基因VEGFA在PCOS患者中呈高表達，影響卵泡正常發(fā)育及成熟，導致排卵障礙及不孕。

綜上所述，PCOS大鼠模型血清中miRNA-93及靶基因VEGFA表達上調(diào)，miRNA-93可能通過轉(zhuǎn)錄水平導致VEGFA蛋白增多，從而參與PCOS的發(fā)生發(fā)展，循環(huán)miRNA-93可許可以作為PCOS的一種新型的非侵入性的診斷標志物。然而miRNA在促進顆粒細胞增生、加速顆粒細胞凋亡、阻礙卵泡正常發(fā)育及成熟、影響性激素合成及分泌和增強胰島素抵抗等方面的作用并不完善，仍需進一步深入研究，以揭示miRNA在PCOS中的作用機理，為今后PCOS的診斷和治療提供新的依據(jù)和治療靶點。

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