UPLC-MS/MS法檢測黃草烏中毒人體肝臟中的主要生物堿成分

李繼印，洪仕君，黃舒柏清，劉青青，任國印，李樹華

草烏為毛茛科烏頭屬植物，主要分為北草烏和黃草烏兩種。云南烏頭屬(Aconitum)植物資源豐富，有66種[1-2]，主要以黃草烏或滇南草烏為基源植物[3]，多分布于滇西及滇中部；其主要成分為滇烏堿、粗莖烏頭堿甲、塔拉薩敏等[4]，因產(chǎn)地不同、種屬間生物堿的含量差別較大[5]。黃草烏塊根具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、消腫止痛的功效，民間廣泛用于治療風(fēng)濕和跌打損傷等病癥[6]，但黃草烏毒性較強(qiáng)，安全范圍窄，中毒案件頻繁發(fā)生。由于對黃草烏的認(rèn)識不充分，法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中對草烏中毒案件的鑒定主要關(guān)注烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測。對黃草烏中毒案(事)件中毒性成分的檢測報道較少，未見測定人體生物檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的文獻(xiàn)報道。因此，本研究建立的粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的UPLC-MS/MS檢測方法對黃草烏中藥物成分分析及法醫(yī)學(xué)鑒定均具有應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98.0%)；8-去乙酰基滇烏堿對照品(云南中醫(yī)學(xué)院馬曉霞提供，純度為94.5%)；乙腈和甲醇(色譜純)，甲酸和乙醚(分析純)，pH 9.2硼酸鹽緩沖溶液，娃哈哈純凈水等。

1.1.2儀器UPLC-MS/MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent1290型液相色譜儀和AB SCIEX 4000Q TRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀)，電子天平(賽多利斯BT125D)，臺式高速離心機(jī)(Thermo Mx120)。

1.1.3檢驗(yàn)材料公安機(jī)關(guān)送檢的檢材：疑為黃草烏中毒死者肝臟組織及現(xiàn)場提取的黃草烏(經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊耀文副教授鑒定證實(shí)為黃草烏)干燥塊根5 g。

1.2方法

1.2.1色譜質(zhì)譜條件UPLC條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸(含5 mmoL乙酸銨)水溶液，梯度洗脫(0～0.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%；0.5～5.0 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)5%→95%；5.0～5.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為95%；5.5～5.6 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)95%→5%；5.6～7.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)5%)；流速0.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。Mass條件：電噴霧離子源，正離子模式，三重四極桿檢測器，MRM檢測模式；粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的監(jiān)測離子對及錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。

表1 待測物的監(jiān)測離子對和電壓參數(shù) V

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制分別精密稱取10.0 mg粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解定容至刻度線，振搖均勻后分別得到1.0 mg·mL-1粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4 ℃冰箱保存。

1.2.3樣品處理黃草烏的處理：稱取送檢黃草烏干燥塊根2 g，粉碎后用甲醇浸泡5 d，得到20 mL浸泡液。取適量黃草烏浸泡液，經(jīng)甲醇稀釋1 000倍后，離心(10 000 r·min-1)3 min，上清液經(jīng)有機(jī)濾膜(13 mm×0.22 μm)過濾后得到黃草烏樣品。肝組織的處理：準(zhǔn)確稱取1 g肝組織，勻漿后，用硼酸鹽緩沖液(pH為9.2)浸泡60 min，離心(15 000 r·min-1)3 min，上清液經(jīng)乙醚萃取后氮?dú)獯蹈?，甲醇定容? mL，經(jīng)有機(jī)濾膜(13 mm×0.22 μm)過濾，得到送檢肝組織樣品。

2 結(jié)果

2.1方法適用性驗(yàn)證在1.2.1分析條件下，分別對空白人體肝組織對照樣品、粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及送檢肝組織樣品和黃草烏樣品進(jìn)行檢測；各以目標(biāo)物對照品的兩對離子對和保留時間對送檢肝組織樣品和黃草烏樣品中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示：空白對照無干擾，方法專屬性好(見圖1)。

圖1 樣品中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的MRM圖

2.2線性范圍和檢出限取空白人體肝組織，按“1.2.3”方法處理后，用粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的混標(biāo)溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列基質(zhì)加標(biāo)溶液，并配制質(zhì)量

濃度分別為1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列混標(biāo)溶液，按“1.2.1”分析條件測定，以定量離子對的積分峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C，ng·mL-1)進(jìn)行線性回歸(表2)。取線性最低點(diǎn)溶液逐級稀釋后測定，檢出限以信噪比(S/N)﹥3作為評價標(biāo)準(zhǔn)，定量限以信噪比﹥10為評價標(biāo)準(zhǔn)，粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的線性方程(線性范圍1～100 ng·mL-1)及檢出限見表2。

2.3精密度、回收率及穩(wěn)定性配制低、中、高3個濃度的空白人體肝臟添加樣品(n=6)，按“1.2.3”方法處理樣品，在“1.2.1”節(jié)條件下測定，記錄粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的定量離子對的峰面積As，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，計算日間精密度；取空白肝臟組織，按“1.2.3”方法處理樣品后，配制成低、中、高3個濃度的基質(zhì)加標(biāo)溶液(n=6)，在“1.2.1”條件下測定，記錄峰面積為Am；另取上述3個濃度的混標(biāo)溶液直接進(jìn)樣，記錄峰面積為Astd。以As/Am計算提取回收率，Am/Astd計算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表3。配制低、中、高3個濃度的肝臟質(zhì)控樣品(n=6)，在室溫放置24 h及3次凍融循環(huán)后，按“1.2.3”方法處理樣品，在“1.2.1”條件下測定，計算精密度，考察其短期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明，粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的RSD%均低于5.0%，說明樣品在上述條件下穩(wěn)定。

表2 粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的線性方程及檢出限(n=6)

表3 待測物的精密度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

2.4樣品測定將“1.2.3”處理得到的送檢肝組織樣品和黃草烏樣品，在“1.2.1”條件下測定，送檢肝組織樣品中定性檢出粗莖烏頭堿甲和滇烏堿，未檢出塔拉薩敏和8-去乙?；釣鯄A；其中粗莖烏頭堿甲的含量為54.25 ng·g-1，滇烏堿的含量為125.0 ng·g-1。送檢黃草烏塊根中定性檢出粗莖烏頭堿甲、滇烏堿、塔拉薩敏和8-去乙?；釣鯄A，其中粗莖烏頭堿甲的含量為0.16 mg·g-1，滇烏堿的含量為0.43 mg·g-1，塔拉薩敏的含量為0.52 mg·g-1。

3 討論

目前，用HPLC[8]或LC/MS[9-10]法測定草烏中的烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的報道較多，對黃草烏及黃草烏中毒案件生物檢材中的主要毒性成分的檢測報道鮮見，赫偉等[11]采用HPLC法測定長喙烏頭中的滇烏堿、草烏甲素和黑烏弱堿；張盼盼等[12]用LC-MS/MS法檢測了尿液中滇烏堿、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿成分；劉偉等[13]用LC-MS/MS法檢測了血液中的草烏甲素、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿；李繼印等[5]用UPLC-MS/MS法檢測了云南5種不同產(chǎn)地的黃草烏中滇烏堿、粗莖烏頭堿甲和塔拉薩敏的含量；未見檢測黃草烏中毒人體生物檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的報道。本文建立的UPLC-MS/MS檢測人體肝臟中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的方法，經(jīng)驗(yàn)證同樣適用于8-去乙?；釣鯄A、烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測。本研究也對死者肝臟組織和對照檢材黃草烏塊根進(jìn)行了烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的檢測，均未檢出這3種生物堿成分，進(jìn)一步驗(yàn)證了本案涉及的草烏塊根為黃草烏。此外，從案件涉及的黃草烏塊根中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的含量可以看出：3種成分相比，塔拉薩敏的含量最高，而中毒尸體肝臟組織中卻未檢出塔拉薩敏成分，原因可能是塔拉薩敏化學(xué)性質(zhì)不如滇烏堿和粗莖烏頭堿甲穩(wěn)定，或者塔拉薩敏在體內(nèi)代謝較快。因此，涉及黃草烏中毒案件的檢驗(yàn)鑒定應(yīng)優(yōu)先考慮滇烏堿和粗莖烏頭堿甲的檢驗(yàn)。

本文建立的方法適用于各類檢材中粗莖烏頭堿甲、滇烏堿和塔拉薩敏的分析檢測，本研究為黃草烏中毒案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供更多的檢測目標(biāo)物，為案(事)件的死亡原因分析及定性判定提供更多的依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志(第11卷)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:108.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:220.

[3] 云南省衛(wèi)生廳.云南生藥品標(biāo)準(zhǔn)[M].昆明:云南大學(xué)出版社,1997:76.

[4] 袁梅,馬曉霞,楊樹德,等.滇西烏頭化學(xué)成分研究[J].中藥材,2013,36(6):938-940.

[5] 李繼印,李紹鵬,張瑞林,等.UPLC-MS/MS法同時測定云南黃草烏中滇烏堿、粗莖烏頭堿甲和塔拉薩敏的含量[J].云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2017,39(4):650-655.

[6] 中國科學(xué)院植物所,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1979:245.

[7] 郭志俊,段小花,陳翠玲,等.制黃草烏中滇烏堿及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物8-去乙?；釣躅^堿藥效和毒性的初步研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(10):60-63.

[8] 趙翡翠,姜林,劉淑敏,等.新疆烏頭屬植物中雙酯型生物堿的含量測定[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2012,32(20):1603-1606.

[9] 馬芳，趙東,吳曉霞,等.利用LC/MS/MS方法檢測附子水提液中烏頭堿的含量方法學(xué)研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011,17(5):564-565.

[10]Wang X,Wang H,Zhang A,et a1.Metabolomics study on the toxicity o f aconite root and its processed products using ultraperformance liquid-chromatography/electrospray-ionization synapt high-definition mass spectrometry coupled with pattern recognition approach and ingenuity pathways analysis[J].J Proteome Res,2012,11(2):1284-1301.

[11]赫偉,馬曉霞,張彬若,等.HPLC法同時測定長喙烏頭中3種主要二萜類生物堿含量[J].藥物分析雜志,2015,35(10):1829-1832.

[12]張盼盼,張福成,王朝虹,等.超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定尿樣中4種痕量的烏頭類生物堿[J].色譜,2013,31(3):211-217.

[13]劉偉,沈敏,沈保華,等.LC-MS/MS-MRM篩選血液中22種有毒生物堿成分[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(5):349-352.