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    二甲雙胍提高吡柔比星對(duì)膀胱癌殺傷活性的研究

    2017-11-08 08:15:44陳峰徐慶康
    浙江實(shí)用醫(yī)學(xué) 2017年4期
    關(guān)鍵詞:吡柔比星膀胱癌孵育

    陳峰,徐慶康

    (武警浙江省總隊(duì)嘉興醫(yī)院,浙江 嘉興 314000)

    ·實(shí)驗(yàn)研究·

    二甲雙胍提高吡柔比星對(duì)膀胱癌殺傷活性的研究

    陳峰,徐慶康

    (武警浙江省總隊(duì)嘉興醫(yī)院,浙江 嘉興 314000)

    目的研究二甲雙胍對(duì)吡柔比星抗膀胱癌活性的改變并探討其機(jī)制。方法CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吡柔比星和二甲雙胍對(duì)膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞的殺傷活性;免疫共沉淀及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二甲雙胍及吡柔比星處理后T24細(xì)胞中XIAP表達(dá)水平及其與caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍及吡柔比星處理后T24細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果(1)二甲雙胍能顯著增強(qiáng)吡柔比星對(duì)T24細(xì)胞的殺傷活性;(2)二甲雙胍抑制T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá)及其與caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用;(3)二甲雙胍顯著促進(jìn)吡柔比星對(duì)T24細(xì)胞caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化和凋亡的誘導(dǎo);(4)轉(zhuǎn)染XIAP表達(dá)質(zhì)粒后,二甲雙胍聯(lián)合吡柔比星引起的caspases的活化和凋亡的誘導(dǎo)受到明顯抑制。結(jié)論二甲雙胍通過抑制XIAP的表達(dá)提高吡柔比星對(duì)膀胱癌的殺傷活性。

    二甲雙胍;XIAP;吡柔比星;膀胱癌

    吡柔比星是治療膀胱癌的常規(guī)化療藥物,能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,但長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)降低其對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性,并引起肉眼血尿、腎毒性等嚴(yán)重的不良反應(yīng)[1-2]。因此提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)吡柔比星治療的敏感性有十分重要的意義。本研究目的在于探討二甲雙胍對(duì)吡柔比星的協(xié)同抗膀胱癌效應(yīng)及分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 試劑 二甲雙胍、吡柔比星和凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó) Gibco公司。XIAP、caspase-9、caspase-7、caspase-3和β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。pcDNA3.1真核表達(dá)質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

    1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞系T24購(gòu)于美國(guó)模式菌種保存中心(ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中并通入5%CO2。細(xì)胞每2~3天傳代1次,傳代時(shí)用胰酶消化液使細(xì)胞進(jìn)入懸浮狀態(tài),并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次,將細(xì)胞懸液按1:3稀釋后傳代。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 XIAP基因過表達(dá) 將XIAP基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后,以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接,構(gòu)建成XIAP重組過表達(dá)質(zhì)粒。將重組的XIAP質(zhì)?;?qū)φ湛召|(zhì)粒 (終濃度為2μg/mL)用Lipofectamine 2000按試劑操作說明書步驟進(jìn)行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。將貼壁的T24細(xì)胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6小時(shí),之后棄去無血清培養(yǎng)基加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。XIAP過表達(dá)T24細(xì)胞或空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 相對(duì)細(xì)胞活力測(cè)定 將細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板中。實(shí)驗(yàn)分組和處理方法如表1。藥物處理完畢后,按照CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒操作說明書步驟將T24細(xì)胞加入10μL CCK-8溶液并在37°C恒溫培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)。孵育完成后在450nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。T24相對(duì)細(xì)胞活力用以下公式計(jì)算:相對(duì)細(xì)胞活力=OD藥物處理組/OD對(duì)照組。相對(duì)細(xì)胞活力越低說明藥物對(duì)T24細(xì)胞的殺傷活性越強(qiáng)。

    表1 實(shí)驗(yàn)分組和處理方法

    1.2.3 免疫共沉淀 將T24細(xì)胞按上述分組處理后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),各組取2×106數(shù)量的細(xì)胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質(zhì),等量分成兩份,一份在蛋白提取液中加入XIAP抗體孵育過夜,之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2小時(shí)。孵育完成后離心收集管底的瓊脂糖珠。瓊脂糖珠加入Western blot上樣緩沖液,沸水浴煮5分鐘使蛋白質(zhì)與糖珠分離,用于Western blot實(shí)驗(yàn)。另一份用作免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的對(duì)照(Input)直接進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),檢測(cè)caspase-9、caspase-7和caspase-3的總量。

    1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 將T24細(xì)胞按上述分組處理后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),取2×106的各組細(xì)胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)或3.3所得樣品用12%SDS-PAGE電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到 PVDF 膜 上 , 用 XIAP、caspase-9、caspase-7、caspase-3和β-actin抗體孵育過夜,之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2小時(shí),蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

    1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) T24細(xì)胞按上述分組處理后按照凋亡試劑盒說明書步驟,將PI(碘化丙啶)和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20分鐘,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡,Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

    2 結(jié)果

    2.1 二甲雙胍增強(qiáng)吡柔比星對(duì)T24細(xì)胞的殺傷活性 對(duì)照組和二甲雙胍組相對(duì)細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明二甲雙胍(2μmol/mL)單獨(dú)處理對(duì)T24細(xì)胞活力的抑制作用不明顯。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,吡柔比星+二甲雙胍組T24的細(xì)胞的凋亡率顯著高于吡柔比星組和二甲雙胍組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,二甲雙胍在體外可以顯著增強(qiáng)吡柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)率。詳見表2。

    2.2 二甲雙胍下調(diào)T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá)水平Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,二甲雙胍能顯著降低T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá)水平(圖1)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組T24細(xì)胞中caspase-9、caspase-7和 caspase-3的總蛋白量無差別 (圖2A),但二甲雙胍能顯著抑制XIAP與caspase-9、caspase-7和 caspase-3的結(jié)合(圖2B),表明二甲雙胍能顯著抑制T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá),從而減弱XIAP與caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用。

    圖1 二甲雙胍抑制T-24細(xì)胞XIAP蛋白的表達(dá)

    2.3 二甲雙胍通過抑制T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá)增強(qiáng)吡柔比星的凋亡誘導(dǎo)活性 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIAP質(zhì)粒后,吡柔比星聯(lián)合二甲雙胍對(duì)T24細(xì)胞的殺傷活性受到明顯抑制;流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示,轉(zhuǎn)染XIAP質(zhì)粒能顯著抑制吡柔比星聯(lián)合二甲雙胍對(duì)T24細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(表2)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,二甲雙胍能增強(qiáng)吡柔比星對(duì)T24細(xì)胞caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化,但轉(zhuǎn)染XIAP質(zhì)粒能顯著抑制兩者聯(lián)合對(duì)T24細(xì)胞caspases的活化(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,二甲雙胍通過抑制T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá)增強(qiáng)吡柔比星的凋亡誘導(dǎo)活性。

    圖2 二甲雙胍減弱XIAP與caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用(2A:各組T24細(xì)胞中caspase-9、caspase-7和caspase-3的總蛋白量無差異;2B:二甲雙胍顯著抑制了XIAP與caspase-9、caspase-7和caspase-3的結(jié)合)

    表2 各組細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活力和凋亡誘導(dǎo)活性(±s)

    表2 各組細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活力和凋亡誘導(dǎo)活性(±s)

    與對(duì)照組比較 *P<0.05; 與吡柔比星組比較 #P<0.05;與吡柔比星+二甲雙胍組比較△P<0.05

    組別 n/孔 相對(duì)細(xì)胞活力 凋亡誘導(dǎo)率(%)對(duì)照組 3 1.0 0±0.0 7 1.7±0.3二甲雙胍組 3 0.9 5±0.0 7 2.0±0.3吡柔比星組 3 0.8 4±0.0 6* 7.4±0.6*吡柔比星+二甲雙胍組 3 0.4 9±0.0 4# 2 8.7±1.7#吡柔比星+二甲雙胍+X I A P質(zhì)粒組 3 0.7 3±0.0 6△ 1 1.5±0.9△

    圖3 二甲雙胍通過抑制T24細(xì)胞中XIAP的表達(dá),增強(qiáng)吡柔比星對(duì) caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化。

    3 討論

    治療膀胱癌主要包括腫瘤手術(shù)切除和化療[3],然而化療藥物的長(zhǎng)期大劑量使用會(huì)造成腫瘤細(xì)胞對(duì)其敏感性降低,并引起嚴(yán)重的不良反應(yīng),因此提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性非常重要。二甲雙胍是一種經(jīng)典的2型糖尿病治療藥物,然而最近的研究發(fā)現(xiàn),服用二甲雙胍可以減少腫瘤的復(fù)發(fā)率,一些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,二甲雙胍能在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)和細(xì)胞周期[4-5]。本研究提示,二甲雙胍能顯著增強(qiáng)吡柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性,而單獨(dú)采用二甲雙胍效果不明顯,表明二甲雙胍與吡柔比星存在協(xié)同效應(yīng),能提高吡柔比星對(duì)膀胱癌的治療效果。

    XIAP屬于抗凋亡蛋白家族成員,它能與天冬內(nèi)切酶caspases結(jié)合,從而阻止caspases的活化,抑制凋亡的發(fā)生[6]。研究表明,腫瘤細(xì)胞中XIAP的過度表達(dá)能引起腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗,影響癌癥患者的預(yù)后。因此XIAP目前已成為腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍能顯著下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中XIAP蛋白的表達(dá),抑制XIAP與caspase-9、caspase-7和caspase-3的相互作用。游離的caspases能在凋亡信號(hào)(吡柔比星)的作用下發(fā)生活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,二甲雙胍發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制可能和XIAP的抑制有關(guān)。用表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)膀胱癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá),二甲雙胍對(duì)吡柔比星的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制,證明二甲雙胍是通過下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中XIAP的蛋白表達(dá)來增強(qiáng)吡柔比星介導(dǎo)的caspase-9、caspase-7和caspase-3的活化,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡。

    綜上所述,二甲雙胍對(duì)吡柔比星有協(xié)同抗膀胱癌效應(yīng),其機(jī)制可能與二甲雙胍能下調(diào)膀胱癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá)水平有關(guān)。本文結(jié)果為降低吡柔比星的使用劑量并提高其療效提供了新的策略和思路。

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