前列腺大組織切片技術(shù)在生物樣本庫(kù)中的應(yīng)用

王麗萍，顧學(xué)文，丁雪飛，肖芹，關(guān)乃富，黃天寶，徐嘉男，金鑫，潘云龍

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前列腺大組織切片技術(shù)在生物樣本庫(kù)中的應(yīng)用

王麗萍，顧學(xué)文，丁雪飛，肖芹，關(guān)乃富，黃天寶，徐嘉男，金鑫，潘云龍

225001 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)（王麗萍、金鑫、潘云龍），病理科（顧學(xué)文、肖芹），泌尿外科（丁雪飛、黃天寶、徐嘉男）；213000 常州市第二人民醫(yī)院病理科（關(guān)乃富）

生物樣本庫(kù)主要是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲(chǔ)存和應(yīng)用健康和疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等樣本[5]，包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經(jīng)處理過(guò)的生物樣本（DNA、RNA、蛋白等）以及與這些生物樣本相關(guān)的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用的系統(tǒng)。江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)目前存儲(chǔ)設(shè)備可滿(mǎn)足大規(guī)模科研樣本存儲(chǔ)需求，能夠?yàn)榍傲邢侔┑木珳?zhǔn)治療提供強(qiáng)有力的支持[6]。

1 材料與方法

1.1 設(shè)施設(shè)備

江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)占地面積約 400 m2，設(shè)有標(biāo)本取材室、體液處理室、組織處理室、核酸提取室、資料室及低溫存儲(chǔ)室。主要設(shè)備–196 ℃液氮罐購(gòu)自美國(guó) Taylor-wharton 公司；Forma 907 型–86 ℃超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；VIP6-E2 型全自動(dòng)組織脫水機(jī)和全自動(dòng)封片染片機(jī)購(gòu)自日本 Sakura 公司；REM-71 型大組織切片機(jī)購(gòu)自日本 Yamato 公司；NDP20 型數(shù)字病理掃描儀購(gòu)自日本 NanoZoomer 公司；U-COOL 24 h 溫控系統(tǒng)購(gòu)自青島海爾公司；TFA 型室溫石蠟切片柜購(gòu)自南京優(yōu)賽斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 標(biāo)本來(lái)源

收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院泌尿外科 2016 – 2017 年間行前列腺癌手術(shù)根治性切除術(shù)及根治性膀胱切除術(shù)后的完整前列腺樣本，進(jìn)行大組織切片的制作及留存。樣本采集已通過(guò)江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，每日可采集病例由臨床醫(yī)生確定并簽署知情同意書(shū)。知情同意書(shū)直接在原有手術(shù)知情同意書(shū)加入“我授權(quán)醫(yī)生對(duì)手術(shù)切除的病變器官、組織或其他標(biāo)本進(jìn)行處置，包括病理學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、流行病學(xué)檢查、醫(yī)療廢物處理和科學(xué)研究”，一式三份，由臨床科室、生物樣本庫(kù)、患者各執(zhí)一份留存。

1.3 信息系統(tǒng)

我院采用上海唐頤生物樣本庫(kù)智能信息管理系統(tǒng)，可根據(jù)臨床資料個(gè)性化設(shè)置需求模塊。能夠與院內(nèi) HIS、LIS、PACS 接口對(duì)接，實(shí)時(shí)獲取臨床資料。二維碼掃描可顯示樣本編碼、采集日期、類(lèi)型、存儲(chǔ)方式以及存儲(chǔ)位置等。例如，PR-1700720-T-P-01，代表前列腺癌組織，2017 年第 720 號(hào)入庫(kù)，癌組織，蠟塊存儲(chǔ)，第一復(fù)份。

1.4 臨床資料

我院前列腺癌入庫(kù)樣本臨床資料已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，其中包括：基本信息（姓名、性別、年齡、身份證號(hào)、家庭住址、聯(lián)系方式等），現(xiàn)病史（尿頻、尿痛、尿急、血尿、血精、排尿無(wú)力、尿等待、尿線中斷、排尿困難、腰酸、腰脹、體重減輕），既往史（高血壓病、糖尿病、冠心病、長(zhǎng)期服用藥物、其他前列腺疾病等），個(gè)人史（吸煙史、飲酒史、職業(yè)接觸史、腫瘤家族史等），必備檢驗(yàn)檢查（慢性病容、淺表淋巴結(jié)腫大、雙下肢水腫、腹軟、腹部移動(dòng)性濁音、腎區(qū)叩擊痛、膀胱區(qū)壓痛、直腸指診等），確診手段（前列腺穿刺活檢術(shù)），輔助檢查（CT、彩超、術(shù)中彩超、MRI、骨掃描）等。

1.5 血液標(biāo)本采集處理流程

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者均采集血液標(biāo)本，血液樣本于術(shù)前及術(shù)后第 1、3、7 天以 8 ml EDTA 抗凝和 5 ml 非抗凝真空采血管采集。詳細(xì)填寫(xiě)樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫離心 10 min，分離血清、血漿，按照每管 300 μl 分裝成 5 份，400 ×低溫離心 30 min，于白膜層部提取白細(xì)胞，按照每管 300 μl 分裝成 3 份，所有流程在2 h 內(nèi)分裝完畢，置于–80 ℃保存。

眾說(shuō)紛紜之際，稅務(wù)部門(mén)開(kāi)始出手。6月3日，國(guó)家稅務(wù)總局發(fā)布公告說(shuō)，針對(duì)近日網(wǎng)上反映有關(guān)影視從業(yè)人員簽訂“陰陽(yáng)合同”中的涉稅問(wèn)題，國(guó)家稅務(wù)總局高度重視，已責(zé)成江蘇等地稅務(wù)機(jī)關(guān)依法開(kāi)展調(diào)查核實(shí)。如發(fā)現(xiàn)違反稅收法律法規(guī)的行為，將嚴(yán)格依法處理。

1.6 前列腺穿刺標(biāo)本采集處理流程

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者均進(jìn)行前列腺穿刺標(biāo)本采集，術(shù)中穿刺前列腺左側(cè)、右側(cè)各一條約 1.5 cm，詳細(xì)填寫(xiě)樣本采集登記表，福爾馬林固定 24 h，石蠟包埋切片染色，室溫保存。

1.7 前列腺大組織標(biāo)本采集處理流程

標(biāo)本具體采集計(jì)劃由臨床科室、病理科、樣本庫(kù)工作人員共同制定并確定一名臨床協(xié)調(diào)人員。手術(shù)前一天臨床醫(yī)生確認(rèn)可采集病例，標(biāo)本離體后由高年資病理醫(yī)生常規(guī)切取四周切緣、輸尿管、精囊等組織，并在臨床醫(yī)生的指導(dǎo)下根據(jù)穿刺位置進(jìn)行取材。在滿(mǎn)足病理科診斷條件下，樣本庫(kù)人員按照冠狀位將組織切片，厚度為 0.4 cm 左右，依次編號(hào)置于福爾馬林固定。48 h 后，進(jìn)行大組織脫水，流程分別為 75% 乙醇，90% 乙醇，95% 乙醇，無(wú)水乙醇，二甲苯，石蠟。采用二次包埋法使大組織充分浸蠟（石蠟熔點(diǎn) 60 ~62 ℃為宜），冰凍后切片。切片厚度為 3 μm，充分烤片后進(jìn)行 HE 染色。

2 結(jié)果

截至 2017 年 5 月 20 日，我院成功收集百余例前列腺癌血液樣本（血清、血漿、白細(xì)胞）、穿刺樣本（左側(cè)、右側(cè)）及數(shù)十例前列腺癌大組織樣本。前列腺癌大組織切片 HE 染色結(jié)果見(jiàn)圖 1。生物樣本庫(kù)工作人員定期隨機(jī)抽檢進(jìn)行樣本質(zhì)量控制，根據(jù)樣本核酸提取鑒定結(jié)果顯示，DNA 完整性、RNA 純度及總量完全滿(mǎn)足科研需求。

圖 1 隨機(jī)抽取前列腺癌大組織切片 HE 染色（A：PR-1700335-N-P-01；B：PR-1700254-T-P-02）

3 討論

前列腺大組織切片技術(shù)在前列腺癌的病理診斷和形態(tài)學(xué)研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[7]。前列腺癌的病灶多呈現(xiàn)多病性分布[2]，相比于傳統(tǒng)病理學(xué)檢查而言前列腺病理大切片技術(shù)可以對(duì)前列腺標(biāo)本進(jìn)行系統(tǒng)、全面的觀察，能夠直觀地判斷癌灶的數(shù)量、分化程度、局部及手術(shù)切緣的侵襲情況等[8]，進(jìn)而更加精確地指導(dǎo)進(jìn)一步的隨訪和治療。同時(shí)，通過(guò)大組織切片技術(shù)可以研究癌灶的空間分布情況，進(jìn)而為前列腺癌的局部精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)[9]。

標(biāo)準(zhǔn)化的生物樣本庫(kù)是醫(yī)院最大的科研優(yōu)勢(shì)和競(jìng)爭(zhēng)力體現(xiàn)，是科學(xué)研究的重要基礎(chǔ)條件[10]，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家均已建立較為完善的各類(lèi)組織標(biāo)本庫(kù)，我國(guó)是一個(gè)多民族的人口大國(guó)，我們要充分利用生物樣本資源，結(jié)合臨床難題促進(jìn)其發(fā)病機(jī)制、分子診斷標(biāo)記物與藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)等轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究，形成信息化、網(wǎng)絡(luò)化管理并有效提升臨床診療水平。生物樣本庫(kù)主要作用：①可提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化樣本采集服務(wù)[11]。每一例前列腺樣本需臨床醫(yī)生、病理醫(yī)生和樣本庫(kù)人員共同采集，如出現(xiàn)漏診，樣本庫(kù)第一時(shí)間將標(biāo)本返還病理科。②可提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化樣本處理服務(wù)[12]。樣本庫(kù)由專(zhuān)職人員分別負(fù)責(zé)血液樣本、穿刺樣本及大組織樣本處理。③可提供獨(dú)立、封閉的樣本存儲(chǔ)服務(wù)。樣本庫(kù)人員將前列腺樣本按照樣本類(lèi)型統(tǒng)一編碼入庫(kù)，按序存儲(chǔ)。臨床人員可根據(jù)科研計(jì)劃向樣本庫(kù)提交樣本使用申請(qǐng)，審核通過(guò)后樣本庫(kù)人員統(tǒng)一安排出庫(kù)。④可提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化質(zhì)量控制服務(wù)[13]。樣本庫(kù)人員定期對(duì)庫(kù)內(nèi)樣本進(jìn)行質(zhì)控，保證庫(kù)內(nèi)樣本質(zhì)量。⑤可提供標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化臨床信息資料及隨訪資料[14]。所有入庫(kù)樣本具有完整的臨床信息及隨訪信息。患者資源是醫(yī)院最重要的戰(zhàn)略資源，對(duì)患者進(jìn)行定期隨訪管理，使患者得到持續(xù)的觀察和合理后續(xù)治療，在提高醫(yī)院服務(wù)的同時(shí)可以掌握患者第一手資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、積累經(jīng)驗(yàn)，有利于科研工作的開(kāi)展和業(yè)務(wù)水平的提高，能夠更好地為病人提供服務(wù)。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.015

江蘇省衛(wèi)計(jì)委面上科研課題（H201550）；揚(yáng)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（YZ2015068）；江蘇省蘇北人民醫(yī)院院基金（yzycms201425）

潘云龍，Email：NJPHWLP@163.com

2017-06-12