人臍帶血體外擴(kuò)增和臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

楚曉婷，李天宇，周新，王浩

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人臍帶血體外擴(kuò)增和臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

楚曉婷，李天宇，周新，王浩

214023 無錫，江蘇希瑞干細(xì)胞技術(shù)有限公司（楚曉婷、王浩）；214023 無錫，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院/無錫市兒童醫(yī)院兒血液科（李天宇）；214023 無錫，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院血液科（周新）

1974 年人類第一次認(rèn)識(shí)到臍帶血中含有造血干細(xì)胞，并在 1988 年進(jìn)行了全世界首例臍帶血移植，且成功治愈了一位范可尼貧血患者[1]，證明了臍帶血移植的臨床應(yīng)用潛能。至今，在全世界范圍內(nèi)的臍帶血移植案例已超過 4 萬例。臍帶血作為一種新的造血干細(xì)胞移植的供體，具有來源廣泛、易于采集、對(duì)供體無傷害、HLA 配型要求低、造血干/祖細(xì)胞（HSPC）含量高等優(yōu)點(diǎn)。而且，臍帶血的制備時(shí)間相比于從一個(gè)匹配的無關(guān)供者體內(nèi)獲得造血干細(xì)胞所需的時(shí)間要短 4 ~ 5 周[2]。此外，臍帶血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）后的病情復(fù)發(fā)率和移植物抗宿主病的發(fā)病率相比于其他來源的造血干細(xì)胞移植也是較低的[3-4]。

然而，UCBT 應(yīng)用于臨床最大的局限就是臍帶血中可提取到的總的有核細(xì)胞（total nucleated cell，TNC）數(shù)量過少。研究表明：HLA 匹配的位點(diǎn)越少，需要 TNC 的量就越多。根據(jù)疾病的類型，單份充足的臍帶血數(shù)量被定義為：HLA 位點(diǎn)全相合需> 3 × 107TNC/kg，5 個(gè)位點(diǎn)相合需> 4 × 107TNC/kg，4 個(gè)位點(diǎn)相合則需> 5 × 107TNC/kg[5]。臍帶血中所含的有核細(xì)胞數(shù)，僅有外周血和骨髓中可用有核細(xì)胞濃度的 5% ~ 10%[6]，如若進(jìn)行低數(shù)量的臍帶血移植，會(huì)引起中性粒細(xì)胞恢復(fù)延遲并增加細(xì)菌及病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。而雙份臍帶血移植，雖然擴(kuò)大了成人使用臍帶血進(jìn)行移植的范圍，但會(huì)增加移植物抗宿主病的發(fā)病率，延長血小板恢復(fù)時(shí)間，從而引發(fā)一系列問題[9]。

因此，許多科學(xué)家致力于研究如何提高臍帶血移植的成功率。主要的研究方向有：臍帶血的體外擴(kuò)增、雙份臍帶血的移植（兩份均為未擴(kuò)增臍帶血或其中一份為體外擴(kuò)增的臍帶血）、增加臍帶血造血干細(xì)胞向骨髓的歸巢能力等。本文依據(jù)近年來國內(nèi)外研究的臍帶血體外擴(kuò)增的方法、研究進(jìn)展和臨床效果等進(jìn)行了綜述。擴(kuò)增臍帶血最直接的方法是通過體外擴(kuò)增臍帶血中的造血祖細(xì)胞。臍帶血的擴(kuò)增能夠使粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的集落形成單位數(shù)量增加，其數(shù)量高于骨髓和外周血，且臍帶血擴(kuò)增的能力也要優(yōu)于骨髓和外周血。因此研究者們嘗試了很多種方法來進(jìn)行臍帶血的體外擴(kuò)增，例：細(xì)胞因子、小分子化合物、基因修飾、間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)等。

1 單獨(dú)添加細(xì)胞因子擴(kuò)增臍帶血

細(xì)胞因子是最早用來體外擴(kuò)增臍帶血的，不同的細(xì)胞因子對(duì)臍帶血中 HSPC 的生長發(fā)育的作用也有所不同，雖然各類細(xì)胞因子的作用機(jī)制尚不完全明確，但目前應(yīng)用最廣、效果最為確切的細(xì)胞因子主要從以下 3 個(gè)方面來調(diào)節(jié) HSC 的生長發(fā)育：①促進(jìn) HSC 從 G0 期向 G1 期的發(fā)育；②抑制 HSC 進(jìn)入G0 期；③促進(jìn) S 期 HSC 的擴(kuò)增[10]。例如：干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、fms 樣酪氨酸激酶 3 的配體（fms-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)LT-3L）、白介素（interleukin，IL）-3、IL-6、IL-11 和粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）等都能不同程度地誘導(dǎo)HSC 的增殖和分化。

目前國內(nèi)外有很多科研工作者從事研究不同組合的細(xì)胞因子對(duì)人臍帶血體外擴(kuò)增的效果，優(yōu)化篩選臍帶血干細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞因子。但到目前為止，細(xì)胞因子最佳組合及濃度都尚未有定論。許多研究僅證實(shí)了，不同的細(xì)胞因子在 HSC 擴(kuò)增過程中具有協(xié)同作用[11]。臍帶血經(jīng)過細(xì)胞因子的擴(kuò)增，雖然有核細(xì)胞及祖細(xì)胞的數(shù)量有所增加，細(xì)胞表面表達(dá)的相關(guān)分子能夠促進(jìn)細(xì)胞的歸巢作用，但細(xì)胞發(fā)生了不同程度的分化[12]。因?yàn)?，HSC 在體內(nèi)是依賴于局部微環(huán)境以及包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)控因子、生長因子和黏附分子在內(nèi)的復(fù)雜的內(nèi)部和外部信號(hào)的嚴(yán)格調(diào)控，來維持自我更新和多向分化之間的平衡[13]。因此，體外擴(kuò)增很難維持 HSC 原有的干性。大部分研究實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了體外擴(kuò)增的臍帶血 HSPC 長期植入能力較差，而短期內(nèi)臍帶血HSPC 比例占據(jù)植入細(xì)胞的主導(dǎo)地位[14-15]。

早在 2003 年，杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心就做過經(jīng)細(xì)胞因子單獨(dú)進(jìn)行擴(kuò)增后的臍帶血植入血液惡性腫瘤患者體內(nèi)的相關(guān)臨床試驗(yàn)[16]，但其結(jié)果是令人失望的。這項(xiàng)研究將一份臍帶血分成了兩份，其中一份使用Aastrom Replicell 生物反應(yīng)器來監(jiān)控培養(yǎng)條件并連續(xù)灌注含有 PIXY321、GM-CSF、IL-3、EPO 和 FLT-3 配體等細(xì)胞因子的培養(yǎng)液進(jìn)行 12 d 的擴(kuò)增，使擴(kuò)增后的 TNC 總量（平均擴(kuò)增 2.4 倍）與未處理部分的 TNC 總量相同。但擴(kuò)增部分 CD34+細(xì)胞卻比未經(jīng)處理的少 50%。移植后的中性粒細(xì)胞回升所需的中位時(shí)間為 22 d，血小板達(dá)到 50 × 109/L 所需的中位時(shí)間為94 d，此結(jié)果與未經(jīng)處理的臍血移植相似。所以現(xiàn)在很多研究人員都將細(xì)胞因子作為輔助因子進(jìn)行臍帶血的擴(kuò)增培養(yǎng)，在謀求 TNC 數(shù)量增加的同時(shí)減少對(duì)細(xì)胞干性的損傷。

2 利用特異性小分子擴(kuò)增臍帶血

從目前的研究來看，用細(xì)胞因子擴(kuò)增臍帶血，雖然 TNC 的總量有明顯的增加，但因擴(kuò)增的同時(shí)誘導(dǎo)了早期祖細(xì)胞分化成歸巢能力較弱的細(xì)胞群，而使 UCBT 的成功率沒有得到提高[17-20]。所以科學(xué)家們利用一些特異性小分子來阻止臍帶血體外擴(kuò)增時(shí)早期祖細(xì)胞的分化，使擴(kuò)增的細(xì)胞減少分化，能夠擁有更好的骨髓歸巢能力。例如銅離子螯合劑 Copper Chelation（TEPA，StemEx）、Notch Ligand、煙酰胺（Nicotinamide）、Aryl Hydrocarbon Antagonist（StemRegenin 1，SR1）等。很多小分子擴(kuò)增 HSPC 的試驗(yàn)都正在進(jìn)行多中心的臨床試驗(yàn)，其中 StemEx 已完成 III 期試驗(yàn)（表 1）。

2.1 Copper Chelator (StemEx)

四乙基五胺（TEPA）是一種銅離子螯合劑，銅離子作為多種細(xì)胞酶的輔助因子，在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用。它不僅可以調(diào)控原始造血細(xì)胞的分化和增殖，同時(shí)能夠阻斷細(xì)胞因子誘導(dǎo)的早期祖細(xì)胞的分化[19-20]。最新研究也表明了，通過高親和力銅離子螯合劑 TEPA 調(diào)節(jié)銅離子濃度可延遲 HSC 分化，提高增殖活性[21]。使用含有 TEPA 和 FLT3 配體、IL-6、TPO 和 SCF 的培養(yǎng)基對(duì)臍帶血中純化的 CD133+細(xì)胞進(jìn)行為期 3 周的擴(kuò)增培養(yǎng)，得到的 CD34+細(xì)胞的數(shù)量能夠增加約 89 倍；同時(shí)集落形成單位數(shù)也能增加 172 倍。這說明 TEPA 對(duì)臍帶血的體外擴(kuò)增具有很好的效果。Peled 等[19]為了驗(yàn)證擴(kuò)增培養(yǎng)的臍帶血的可行性和安全性，首先對(duì)清髓后的小鼠進(jìn)行了移植，結(jié)果表明：擴(kuò)增的細(xì)胞不僅能夠提高移植的可能性還能夠維持分化成各種造血細(xì)胞的潛能。

基于這些鼓舞人心的結(jié)果，后續(xù)在 10 個(gè)高危性惡性血液病患者體內(nèi)完成了 I/II 期的臨床試驗(yàn)。將每份臍帶血分成兩份，一份用于擴(kuò)增，一份不作處理，先輸入未經(jīng)處理的臍帶血，24 h 后再輸注擴(kuò)增后的臍帶血。結(jié)果顯示：9 位有效植入者中性粒細(xì)胞和血小板的中位植入時(shí)間分別為 30 和 48 d。因?yàn)檫@個(gè)結(jié)果與未經(jīng)處理的單份臍帶血移植的結(jié)果沒有顯著差異，所以又進(jìn)行了一次大規(guī)模多中心的試驗(yàn)。試驗(yàn)組為 101 位患者，對(duì)其進(jìn)行單份臍帶血移植；對(duì)照組為 295 位患者，對(duì)其進(jìn)行了雙份臍帶血移植。單份臍帶血經(jīng)過擴(kuò)增后（一部分?jǐn)U增，一部分不做處理），給患者灌輸?shù)?TNC 和 CD34+細(xì)胞的中位濃度分別為 2.2 × 107和9.7 × 105/kg，中性粒細(xì)胞和血小板的中位植入時(shí)間分別為21 和 54 d（對(duì)照組為：28 和 105 d），100 d 的存活率為 84.2%（對(duì)照組為 74.6%），表明用 TEPA 聯(lián)合細(xì)胞因子進(jìn)行擴(kuò)增的臍帶血移植效果優(yōu)于對(duì)照組[22]。

2.2 Notch Ligand

Notch 信號(hào)通路是人體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，它能影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個(gè)過程，包括多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成；且在造血功能激活過程中也發(fā)揮重要作用，可通過與 HSPC 表面的受體 Notch1-4 結(jié)合調(diào)節(jié)其生存和增殖過程[23]。其中 CD34+細(xì)胞主要是通過 Notch 受體 Deltal1 的刺激來提高 HSPC 的擴(kuò)增效率[24]。而且，在細(xì)胞因子 SCF、IL-6、IL-11 和FLT-3 配體的共同作用下細(xì)胞能夠連續(xù)擴(kuò)增 8 個(gè)月而維持不分化狀態(tài)。而在 GM-CSF 和另一些細(xì)胞因子刺激下又能恢復(fù)其分化能力[25]。

因此，利用重組的 Notch 配體轉(zhuǎn)導(dǎo)入純化的CD34+細(xì)胞，后與細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng) 16 d，CD34+細(xì)胞平均擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá) 222 倍[26]。這無疑對(duì)臍血移植是非常有益的。Delaney 等[26]進(jìn)行了首次臨床試驗(yàn)，對(duì) 10 位患者進(jìn)行了雙份臍帶血移植，未經(jīng)處理的臍血（TNC 和 CD34+的中位濃度分別為：3.3 × 107/kg 和 2.4 × 105/kg）移植 4 h 后植入擴(kuò)增的 CD34+細(xì)胞（TNC 和 CD34+的中位濃度分別為：4.6 × 107/kg 和 60.3 × 105/kg），結(jié)果顯示：患者的中性粒細(xì)胞和血小板的中位植入時(shí)間分別為 16 和 26 d，但在 3 個(gè)月后外周血嵌合度分析結(jié)果表明：維持造血作用的細(xì)胞大多來源于未經(jīng)處理的臍帶血，擴(kuò)增的臍帶血僅在移植早期起作用。

總體來說基于 Notch 信號(hào)通道擴(kuò)增的臍帶血的移植相對(duì)于傳統(tǒng)臍帶血移植是有優(yōu)勢(shì)的。且一項(xiàng)多中心、計(jì)劃納入 160 例患者的隨機(jī)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，以確定 Notch 信號(hào)通路擴(kuò)增臍帶血進(jìn)行 UCBT 的療效（clinicaltrials.gov，臨床試驗(yàn)備案代碼 NCT01175785）。

2.3 煙酰胺

煙酰胺是維他命 B3 的衍生物，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的前體和 NAD 分解酶的有效抑制劑。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入煙酰胺能夠通過調(diào)節(jié)去乙酰化酶 Sirtuin（SIRT）作用于臍帶血 HSPC 中 CD34+細(xì)胞，使其分化延遲，并促進(jìn)其歸巢、植入[27]。且能保持這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不會(huì)丟失原來的生理功能，使它們?cè)谥踩牖颊唧w內(nèi)后更好地發(fā)揮作用。至目前為止，采用煙酰胺擴(kuò)增出來的產(chǎn)品Nicord 已成功完成了 I/II 期臨床試驗(yàn)，于 2016 年夏天開始進(jìn)行 III 期臨床，現(xiàn)患者招募已經(jīng)完成，計(jì)劃于 2018 年 7 月完成試驗(yàn)。

表 1 臍帶血體外擴(kuò)增的臨床進(jìn)展

Nicord 來源于單份臍帶血，包括擴(kuò)增的 CD133+細(xì)胞和未經(jīng)處理的 CD133–細(xì)胞。首先將單份臍帶血分成兩部分：CD133–細(xì)胞和 CD133+細(xì)胞，CD133–細(xì)胞則繼續(xù)深低溫冷凍保存；CD133+細(xì)胞則與含有 NAM 和 TPO、IL-6、FLT-3 ligand、SCF 的培養(yǎng)基共同擴(kuò)增培養(yǎng) 21 d，得到 CD34+細(xì)胞大約擴(kuò)增 72 倍，TNC 擴(kuò)增約 486 倍。預(yù)試驗(yàn)在擴(kuò)增培養(yǎng)結(jié)束后，將 Nicord 和另一份未經(jīng)處理的臍帶血一起植入預(yù)先進(jìn)行清髓處理的 11 位患者體內(nèi)，其中性粒細(xì)胞和血小板的中位植入時(shí)間分別為 11 和 31 d，3 年存活率為 67%，且在這 8 位患者體內(nèi) Nicord 相比于另一份未經(jīng)處理的臍帶血占明顯優(yōu)勢(shì)[28]。

于是，在 2014 年 GamidaCell 公司進(jìn)行了 Nicord 的 I/II 期的臨床試驗(yàn)，與預(yù)試驗(yàn)不同的是，植入患者體內(nèi)的僅為 Nicord 單份臍帶血，最終植入濃度為：TNC：3.1 × 107/kg；CD34+細(xì)胞：35.0 × 105/kg。其中性粒細(xì)胞和血小板的中位植入時(shí)間分別為 11 和 33 d，一年的完全存活率為 56%，長期植入比例為 60% ~ 80%。試驗(yàn)結(jié)果表明，Nicord 與普通臍帶血移植相比在很多臨床指標(biāo)上有顯著改善。例如植入成功率更高，植入的細(xì)胞可以更快生成中性粒細(xì)胞和血小板，植入細(xì)胞的有效期更長，患者因?yàn)橐浦彩中g(shù)而被感染的機(jī)會(huì)降低等[28]。

2.4 StemRegenin 1

StemRegenin 1（SR1）是一種嘧啶類衍生物，通過拮抗 AHR 信號(hào)通路調(diào)控造血干細(xì)胞的自我更新和擴(kuò)增。2010 年，明尼達(dá)州的一個(gè)科研小組報(bào)道，低濃度的 SR1 可使 CD34+細(xì)胞擴(kuò)增 50 多倍，具有移植能力的 HSC 擴(kuò)增17 倍，極大的維持了造血干細(xì)胞的自我更新能力。且聯(lián)合 SCF、FLT-3L、TPO 及 IL-6等細(xì)胞因子一起培養(yǎng)擴(kuò)增 CD34+細(xì)胞，能使其維持未分化狀態(tài)[29]。

隨后多項(xiàng)研究也驗(yàn)證了 SR1 在 HSPC 擴(kuò)增中的確切作用，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增效率約為 328 倍[29-30]。且利用 SR1 進(jìn)行臍帶血擴(kuò)增的相關(guān)臨床試驗(yàn)也已經(jīng)展開，兩份臍帶血同時(shí)進(jìn)行移植。將一份細(xì)胞數(shù)較少的臍帶血中 CD34+細(xì)胞純化出來，用 SR1 聯(lián)合細(xì)胞因子擴(kuò)增培養(yǎng) 15 d。CD34–細(xì)胞則繼續(xù)低溫保存，直到擴(kuò)增結(jié)束后，先將未經(jīng)處理的細(xì)胞量較多的臍帶血植入患者，再將擴(kuò)增的細(xì)胞和 CD34–細(xì)胞一起植入患者體內(nèi)，移植后 17 位患者的中位粒細(xì)胞植入時(shí)間為 15 d，血小板植入時(shí)間為 49 d，長期植入比例約為 65%。移植的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)移植未經(jīng)處理的臍帶血[31]。綜合考慮，利用 SR1 擴(kuò)增的臍帶血能夠有效地促進(jìn)患者造血功能的恢復(fù)。因此，Wagner 等正在計(jì)劃進(jìn)行單獨(dú)移植擴(kuò)增后的臍帶血的相關(guān)臨床試驗(yàn)。

2.5 前列腺素E2

前列腺素 E2（PGE2）是一種體內(nèi)含量十分豐富的類花生酸，具有多種生理活性，對(duì)造血系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用。它能提高 HSC 在移植過程中的歸巢、存活和增殖能力，以及 HSC 的長期再植能力[32-34]。此外，PGE2 還可以增強(qiáng)輻射損傷后 HSC 造血系統(tǒng)的重建能力，維持造血系統(tǒng)的穩(wěn)定性。由于 PGE2 的半衰期非常短（1 ~ 2 min），在體外和臨床研究中常使用 PGE2 的穩(wěn)定修飾物 16,16-二甲基前列腺素 E2（dmPGE2）。

Goessling 等[35]采用斑馬魚體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了 PGE2 和 Wnt 信號(hào)通路通過調(diào)節(jié) β-actin 的穩(wěn)定性來維持HSC 的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期的細(xì)胞凋亡和生長。靈長類動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)證明，在骨髓受到損傷后，PGE2 可促進(jìn) HSC 的重建，加速造血系統(tǒng)的恢復(fù)。PGE2 預(yù)處理后的 HSC 移植已經(jīng)在靈長類動(dòng)物中證明是安全的。Cutler 等[36]在 I 期臨床試驗(yàn)中的結(jié)果也證實(shí)了，用 dmPGE2 對(duì)臍血 CD34+細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理再移植，其安全性是可以保障的，并且能夠加快中性粒細(xì)胞的植入時(shí)間。

2.6 UM171

Fares 等[37]在對(duì) 5000 多種化合物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)了一族小分子，可用于臍帶血干細(xì)胞的體外增殖。UM171 是一個(gè)合成的 UM729 的類似物。UM729 能夠增加人的 CD34+CD45RA–外周血細(xì)胞，但UM171 的擴(kuò)增能力是 UM729 的 10 ~ 20 倍。

據(jù)報(bào)道：UM171 是一類標(biāo)準(zhǔn)的 AHR 的抑制劑，與 SR1 具有協(xié)同作用，可以增加短期造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增，而 UM171 自身也可以選擇性地提高長期造血干細(xì)胞的再生能力。試驗(yàn)顯示：將 UM171 或 DMSO 處理的 CD34+CB 細(xì)胞注射到 NSG 小鼠中，在約 300 只小鼠中評(píng)估人細(xì)胞的植入水平，并以熱圖的形式表示。數(shù)據(jù)分析表明：UM171 在淋巴缺陷分化中起重要作用。且 UM171 對(duì)長期造血干細(xì)胞的影響在移植后 30 周仍然存在，在高細(xì)胞劑量時(shí)其多向貢獻(xiàn)明顯。UM171 不僅對(duì)體外擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞數(shù)量有明顯作用，還能大大減少與干細(xì)胞相關(guān)的并發(fā)癥[37]。所以，UM171 會(huì)是 HSPC 移植治療中的有利候補(bǔ)物質(zhì)。

3 與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶血

干細(xì)胞微環(huán)境是干細(xì)胞生長的微環(huán)境，其在維持 HSC 自我更新及多向分化中發(fā)揮重要作用[38]。而通過模擬造血微環(huán)境促進(jìn) HSC 的體外擴(kuò)增技術(shù)也日益成熟。MSC 對(duì) HSC 就擁有重要的造血支持作用[39]，主要因?yàn)椋篗SC 能夠提供多種體外擴(kuò)增的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路在基于單獨(dú)利用細(xì)胞因子來進(jìn)行 HPC 懸浮培養(yǎng)中是沒有的。MSC 可通過直接接觸或分泌內(nèi)源性細(xì)胞因子等方式調(diào)控 HSC。而且，利用 MSC滋養(yǎng)層培養(yǎng)擴(kuò)增 HSPC 可避免 CD34 及 CD133 分選造成的細(xì)胞數(shù)的減少。

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）作為飼養(yǎng)層擴(kuò)增臍帶血已經(jīng)完成了 I/II 期的臨床試驗(yàn)[40]，該試驗(yàn)將臍帶血與貼壁的BM-MSC、造血相關(guān)細(xì)胞因子共培養(yǎng) 7 d，然后單獨(dú)使用細(xì)胞因子再擴(kuò)增培養(yǎng) 7 d。最終實(shí)現(xiàn)臍帶血 HSPC中CD34+細(xì)胞數(shù)目中位值增長為原有細(xì)胞中位數(shù)目的30 倍。該體外擴(kuò)增培養(yǎng)所得的臍帶血應(yīng)用于雙份 UCBT，未經(jīng)操作的臍血復(fù)蘇清洗后靜脈注射，然后再注射擴(kuò)增的臍血，注射后的第一天開始每天用粒細(xì)胞集落刺激因子注射至中性粒細(xì)胞恢復(fù)。

試驗(yàn)表明，患者中性粒細(xì)胞的植入時(shí)間為 15 d，血小板的中位植入時(shí)間為 42 d。約 50%的患者在UCBT 后3 ~ 4 周呈現(xiàn)混合性嵌合狀態(tài)，但長期植入（> 12 個(gè)月）的臍帶血 HSPC 主要來源于未擴(kuò)增的那一份臍帶血?？赡茉蚴桥囵B(yǎng)的過程中耗盡了細(xì)胞長期增殖的能力。與未經(jīng)處理的臍帶血相比，用 MSC 擴(kuò)增的臍血增加了單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的比例，但是減少了 T、B 細(xì)胞的比例。但總的來說，利用 MSC 共培養(yǎng)技術(shù)來擴(kuò)增臍帶血是可行的，能夠明顯縮短細(xì)胞植入時(shí)間，提高成功率。

3.2 與球狀體 BM-MSC 共培養(yǎng)

Futrega 等[41]利用高通量聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）微孔適當(dāng)?shù)馗纳屏梭w外 HSPC 的擴(kuò)增。PDMS 微孔的作用是使 MSC 成球形，提供一個(gè)三維的培養(yǎng)體系。接種前先在微孔表面預(yù)涂 5% 的普朗尼克（pluronic F127）以防止 MSC 貼壁，接種后離心使細(xì)胞聚合，在微孔中形成球形，再接入 CD34+細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。這種球狀三維的共培養(yǎng)體系擴(kuò)增出的 CD34+細(xì)胞的數(shù)量與二維單層細(xì)胞共培養(yǎng)并無明顯區(qū)別，但 CD34+CD38–的細(xì)胞數(shù)量卻遠(yuǎn)超二維培養(yǎng)體系。甚至他們發(fā)現(xiàn)在沒有 MSC 的情況下，僅使用 PDMS 微孔進(jìn)行培養(yǎng)時(shí) CD34+CD38–的細(xì)胞數(shù)量也會(huì)增加。但是這些三維體系擴(kuò)增的細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上并沒有增加其移植成功率，僅與利用單層 MSC 作為飼養(yǎng)層來擴(kuò)增的臍帶血的移植率相似?？偟膩碚f，雖然球形 MSC 共培養(yǎng)并沒有解決 CD34+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)過程中長期植入能力的消耗問題，但卻發(fā)現(xiàn)了 PDMS 微孔對(duì) CD34+細(xì)胞擴(kuò)增具有一定作用。

3.3 臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞

新加坡的一個(gè)項(xiàng)目研究組針對(duì)采用臍帶華通氏膠培養(yǎng)出來的 MSC 單層細(xì)胞作為飼養(yǎng)層進(jìn)行擴(kuò)增臍帶血的效果做了大量研究[42]。研究表明，臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞（UCWJ-MSC）與成人的 BM-MSC 相比具有直接可用、供者痛苦少、病毒感染率低等優(yōu)點(diǎn)，且具有更好的擴(kuò)增能力，耗時(shí)也會(huì)較短。表達(dá)的與臍血擴(kuò)增相關(guān)的標(biāo)志物和分子也比 BM-MSC 多，這些分子都在臍血擴(kuò)增中起重要作用。不僅是 WJ-MSC 能夠起到擴(kuò)增培養(yǎng)臍帶血的作用，單獨(dú)使用其培養(yǎng)液也能對(duì)臍帶血擴(kuò)增起到一定作用[43]。但目前這項(xiàng)研究還沒有正式進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

Fong 等[44]做了相關(guān)的臨床預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果表明同時(shí)灌注 UCWJ-MSC 和 UCB-HS/PC 能夠提高造血細(xì)胞移植成功率。UCWJ-MSC 和沒有經(jīng)過處理的 UCB 一起灌注，比單獨(dú)灌注沒有處理過的 UCB，粒細(xì)胞和血小板的回升天數(shù)要短。

4 與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶血

近年來相關(guān)研究證實(shí)：成骨細(xì)胞是構(gòu)建造血生態(tài)位區(qū)至關(guān)重要的支撐部分，并對(duì)其中的 HSPC 發(fā)育、增殖和分化及成熟等生理活動(dòng)發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[45-46]。有研究認(rèn)為成骨細(xì)胞與 HSPC 直接接觸對(duì)于CD34+細(xì)胞有數(shù)量上的維持；成骨細(xì)胞也可以通過分泌各種細(xì)胞因子來刺激造血細(xì)胞擴(kuò)增和干細(xì)胞特性的維持[47]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞分泌的胞外囊泡中含有許多的生物活性物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的生長。特別是胞外囊泡中存在的 miRNA，如：miR-21-5p、miR-100-5p 和 let-3 家族。其中 miRNA-29a 對(duì)于HSPC 的增殖、凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞外基質(zhì)黏附都有影響。Morhayim 等[48]將成骨細(xì)胞胞外囊泡、臍帶血CD34+細(xì)胞與細(xì)胞因子一起培養(yǎng)擴(kuò)增 10 d 后，TNC 總量和 CD34+細(xì)胞總量都有明顯增加，集落形成單位 CFU 數(shù)量相較于對(duì)照組也增加了 10% ~ 45%。將數(shù)量相等的擴(kuò)增后的細(xì)胞和未經(jīng)處理的細(xì)胞分別植入 NSC 小鼠體內(nèi)，分別在 19 周和 21 周后對(duì)其外周血和骨髓中的細(xì)胞做了流式分析，結(jié)果表明，經(jīng)過成骨細(xì)胞胞外囊泡共同培養(yǎng)的 CD34+細(xì)胞能夠成功進(jìn)行移植和重建小鼠的造血功能，其效果和對(duì)照組無明顯差別。

5 與內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶血

在主動(dòng)脈性腺中腎區(qū)，HSPC 與內(nèi)皮細(xì)胞位置相近，且在胚胎發(fā)育過程中，造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是來源于同一前體細(xì)胞的[49]，這就說明了內(nèi)皮祖細(xì)胞和 HSPC 也有著緊密的聯(lián)系。在 BM 微環(huán)境中，兩者的相互作用有助于 HSPC 的自我更新和分化[50-51]。Qu 等[52]將臍帶血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)后，作為滋養(yǎng)層細(xì)胞體外擴(kuò)增 HSPC。實(shí)驗(yàn)表明：EPCs 通過產(chǎn)生多種生長因子和通路分子來為 HSPC 的體外擴(kuò)增提供合適的微環(huán)境。例如：EPCs 能夠高表達(dá)造血相關(guān)因子 IL-6 和 ANGPT1，且在 EPCs與 HSPC 共培養(yǎng)時(shí) WNT5A 基因會(huì)出現(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)錄，能夠激活 wnt 信號(hào)通路。

EPCs 作為滋養(yǎng)層與 HSPC 直接接觸共培養(yǎng) 7 d，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增約為 5.38 倍，CD34+CD38–細(xì)胞則擴(kuò)增了約 156.17 倍。而單獨(dú)用細(xì)胞因子培養(yǎng)的對(duì)照組，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增了（3.25 ± 0.59）倍，而 CD34+CD38–細(xì)胞僅擴(kuò)增了約 79 倍。將擴(kuò)增后的 HSPC 和未經(jīng)處理的 HSPC 以相同細(xì)胞數(shù)分別植入到免疫缺陷的非肥胖糖尿病小鼠體內(nèi)，8 周后檢測(cè)小鼠骨髓中人 CD45 細(xì)胞的比率，結(jié)果顯示其百分比分別為：（13.3 ± 11.0）% 和（16.0 ± 14.3）%[52]。此結(jié)果可以說明 EPCs 共培養(yǎng)也是體外擴(kuò)增 HSPC 的一種有效方法，但要運(yùn)用到臨床還需要做更深入的研究。

6 應(yīng)激誘導(dǎo)的臍帶血的體外擴(kuò)增

6.1 p38α

p38MAPK 通路在造血細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中占重要地位，抑制 p38MAPK 通路可一定程度緩解造血干細(xì)胞功能下降[53]。來自日本的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在骨髓移植等應(yīng)激情況下，造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK 能夠激活嘌呤代謝推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而對(duì)應(yīng)激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[54]。

報(bào)告稱，p38MAPK 家族中的一個(gè)成員 p38α 在小鼠應(yīng)激造血過程中啟動(dòng)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPC）的增殖方面發(fā)揮重要作用。在受到應(yīng)激后，HSPC 中的 p38MAPK 會(huì)立即被磷酸化，促進(jìn) HSPC 進(jìn)入細(xì)胞周期。p38α 信號(hào)途徑能夠增加 HSPC 中一種叫做肌苷-5'-單磷酸脫氫酶 2（IMPDH2）的分子的表達(dá)，導(dǎo)致氨基酸和嘌呤相關(guān)代謝物水平發(fā)生變化，同時(shí)還會(huì)在體內(nèi)和體外情況下改變細(xì)胞周期進(jìn)展。而條件敲除 p38α 會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激造血過程的損傷，造成 HSPC 增殖啟動(dòng)被延誤[54]。這項(xiàng)研究解釋了 p38α 介導(dǎo)的信號(hào)途徑改變 HSPC 代謝從而產(chǎn)生應(yīng)激應(yīng)答促進(jìn)細(xì)胞周期恢復(fù)的機(jī)制，這對(duì)于應(yīng)用造血干細(xì)胞進(jìn)行血液疾病治療，或者可以通過這種機(jī)制進(jìn)行造血干細(xì)胞擴(kuò)增有重要意義。

6.2 低氧應(yīng)激

造血干細(xì)胞在體內(nèi)所處的位置都屬于低氧環(huán)境。然而，到目前為止，許多造血干細(xì)胞研究結(jié)果都是基于非生理?xiàng)l件下的氧分壓，即常氧。但在常氧下培養(yǎng)易導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷，低氧對(duì)維持造血干細(xì)胞干性具有重要作用。在不同氧濃度下，造血干細(xì)胞具有不同的增殖潛能、周期分布和存活能力。

目前，就低氧環(huán)境對(duì)造血干細(xì)胞擴(kuò)增的研究主要集中于影響其擴(kuò)增的機(jī)制，主要是通過 HIF 信號(hào)通路和活性氧刺激來進(jìn)行。低氧能阻止已經(jīng)在 G0 期的細(xì)胞退出周期，還能使處在周期中的細(xì)胞進(jìn)入靜息，這兩種途徑會(huì)增加 G0 期的細(xì)胞數(shù)[55-56]，從而維持細(xì)胞的干性。最新研究成果也發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境（3% O2）或添加環(huán)孢霉素 A 可作用于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，增加 HSPC 的收集量[57-58]。

但是什么樣的低氧濃度和低氧作用時(shí)間對(duì)于臍帶血的擴(kuò)增和細(xì)胞周期的靜止最有利還沒有定論，且其相關(guān)的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究，但低氧對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)是毋庸置疑的。

7 利用基因修飾技術(shù)擴(kuò)增臍帶血

隨著對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其機(jī)制的認(rèn)識(shí)，研究者們可以利用基因修飾技術(shù)，控制細(xì)胞增殖分化以獲得我們所需要的細(xì)胞類型。

HoxB4 為同源盒基因家族的一個(gè)成員，在早期造血細(xì)胞中高表達(dá)，隨著 HSC 的分化，其表達(dá)逐漸下降直至消失。研究者嘗試用轉(zhuǎn)導(dǎo) HoxB4 基因的 MSC 聯(lián)合細(xì)胞因子來體外擴(kuò)增臍血 CD34+細(xì)胞[59-60]。結(jié)果可以更加有效地體外擴(kuò)增臍血 CD34+細(xì)胞，這也可能與 HoxB4 對(duì)維持 HSC 自我更新等干細(xì)胞特性的功能有關(guān)。此外，Amsellem 等[61]將 HoxB4 導(dǎo)入 MS-5 細(xì)胞株，用這種細(xì)胞株作為臍帶血的飼養(yǎng)層細(xì)胞，獲得的結(jié)果也是類似的。

JAK2 在造血干細(xì)胞的自我更新中起著重要作用，SCF、FLT 和 G-CSF 等大多數(shù)細(xì)胞因子是通過 JAK2 來傳遞信號(hào)的。通過構(gòu)建一個(gè)含有 JAK2 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將該載體轉(zhuǎn)入 HSPC。通過給予小分子靶向基因合成藥物 AP20187 來誘導(dǎo) JAK2 二聚化[62]。JAK2 激活后能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)來實(shí)現(xiàn)臍帶血干細(xì)胞的大量擴(kuò)增與調(diào)控。

miR-17 在造血系統(tǒng)中也起著重要的調(diào)節(jié)作用，在人造血細(xì)胞開始分化時(shí)它的表達(dá)水平會(huì)下調(diào)。Yang 等[63]通過構(gòu)建載體將 miR-17 的基因片段轉(zhuǎn)染至人臍帶血 CD34+細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中大量表達(dá)。這些細(xì)胞經(jīng)與細(xì)胞因子共同培養(yǎng)后，CD34+細(xì)胞有明顯增加，相反若 miR-17 表達(dá)受限的話 CD34+細(xì)胞則會(huì)減少。實(shí)驗(yàn)表明：雖然擴(kuò)增后的 CD34+細(xì)胞在體內(nèi)的造血重建能力降低，但它能夠分泌黏附因子，使 CD34+細(xì)胞黏附到其生態(tài)位區(qū)。因此，可以說 miR-17 在造血系統(tǒng)發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。這對(duì)今后研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及開展干細(xì)胞和基因治療都有潛在應(yīng)用價(jià)值。

8 總結(jié)

近年來，大量的臍帶血體外擴(kuò)增體系已經(jīng)建立起來，多個(gè)獨(dú)立的相關(guān)臨床試驗(yàn)均取得了較好的結(jié)果。在現(xiàn)行的體外擴(kuò)增技術(shù)中，細(xì)胞因子仍是重要工具，上述方法中無論哪種都會(huì)運(yùn)用到細(xì)胞因子的幾種組合來進(jìn)行輔助性的擴(kuò)增培養(yǎng)。但由于多因素的影響以及體內(nèi)造血微環(huán)境的復(fù)雜性之間的相互作用，擴(kuò)增效果與體外擴(kuò)增的條件之間沒有明確的定量關(guān)系，也沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的方案來實(shí)現(xiàn)最佳擴(kuò)增。但是隨著技術(shù)的迅速進(jìn)步，相信未來的 HSPC 的體外擴(kuò)增技術(shù)在解決臍帶血的數(shù)量問題上將有重大的發(fā)展前景。而一旦臍帶血擴(kuò)增問題得到解決，臍帶血在醫(yī)療中的應(yīng)用價(jià)值將會(huì)更加巨大。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.010

無錫市科技發(fā)展資金（CBE01G1603）；江蘇省科教強(qiáng)衛(wèi)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（CXTDB2017016）；無錫市科教強(qiáng)衛(wèi)發(fā)展學(xué)科（FZXK001）；無錫市衛(wèi)生局重大項(xiàng)目（Z201302）

王浩，Email：wanghao@cruilife.com

2017-08-04