甘精胰島素外源性DNA殘留量的熒光染色法檢測(cè)研究

柳常青，王霞，汲生芝，公偉廣，張貴民

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甘精胰島素外源性DNA殘留量的熒光染色法檢測(cè)研究

柳常青，王霞，汲生芝，公偉廣，張貴民

273400 臨沂，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司（柳常青、王霞、汲生芝、公偉廣）；276006 臨沂，魯南制藥集團(tuán)股份有限公司（張貴民）

甘精胰島素是一種通過(guò)基因工程重組技術(shù)，利用大腸桿菌或酵母表達(dá)得到的一種重組蛋白類藥物，是具有長(zhǎng)效作用的人胰島素類似物。該藥物在皮下注射后立即聚合，溶解度降低，形成微沉淀物，使吸收、分解和作用時(shí)間延長(zhǎng)，相當(dāng)于基礎(chǔ)胰島素的無(wú)峰值分泌，發(fā)揮長(zhǎng)效平穩(wěn)降血糖的作用[1]。宿主細(xì)胞殘留 DNA 因有潛在的致癌或傳染風(fēng)險(xiǎn)，是基因工程重組產(chǎn)品需要嚴(yán)格控制的雜質(zhì)。《中國(guó)藥典》2015 年版收載了 2 種外源性 DNA 殘留檢測(cè)方法：DNA 探針雜交法和熒光染色法。DNA 探針雜交法操作周期較長(zhǎng)，干擾因素多，重復(fù)性較差，宿主菌 DNA 的種屬和質(zhì)量直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。熒光染色法是利用雙鏈 DNA 熒光染料與雙鏈 DNA 特異結(jié)合形成復(fù)合物，在波長(zhǎng) 480 nm 激發(fā)下產(chǎn)生超強(qiáng)熒光信號(hào)，用熒光酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 520 nm 處進(jìn)行檢測(cè)，在一定的 DNA 濃度范圍內(nèi)以及熒光染料過(guò)量的情況下，熒光信號(hào)與 DNA 濃度成正比[3-4]。熒光染色法操作簡(jiǎn)單快速，不需要宿主 DNA 作為模板，能夠檢測(cè)出重組制品中全部 DNA 污染，因而可廣泛用于重組蛋白藥物殘余 DNA 的檢測(cè)。

由于熒光試劑盒的緩沖液 pH 值接近甘精胰島素等電點(diǎn)，容易導(dǎo)致樣品溶液渾濁進(jìn)而影響檢測(cè)，同時(shí)從相關(guān)文獻(xiàn)可知胰島素或其類似物本身可能對(duì)熒光法檢測(cè)產(chǎn)生干擾[5-6]，本文對(duì)甘精胰島素 DNA 檢測(cè)的樣品處理方法進(jìn)行詳細(xì)研究，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料藥 重組甘精胰島素原料藥由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司制備，批號(hào)：D012、D013、D020、D022、D033、D034。

1.1.2 儀器 熒光酶標(biāo)儀 Spectra Max ?Gemini EM 及 SoftMax Pro 軟件為美國(guó) Molecular Devices 公司產(chǎn)品；DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋為天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；Z323K 型高速冷凍離心機(jī)為德國(guó) Hermle 公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 熒光試劑盒 Quant-iTTMPicoGreenTMdsDNA assay kit 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；PCR 級(jí)重組蛋白酶 K 購(gòu)自瑞士 Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1 供試品的處理方法

1.2.1.1 供試品的直接測(cè)定 分別采用 pH 8.5、pH 8.0、pH 7.5、pH 7.0、pH 6.5 的 TE 緩沖液將甘精胰島素配制成 1.0 mg/ml 濃度，同時(shí)在上述樣品中加入等體積的10 ng/ml DNA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備加樣回收樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用同樣 pH 制備和檢測(cè)?；厥章视靡韵鹿接?jì)算：回收率（%）=（樣品加入 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品后的測(cè)定值× 2 – 樣品測(cè)定值）/加入 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的理論值 × 100%。

1.2.1.2 樣品稀釋法處理 以 1.5 mg 甘精胰島素為 1 劑量計(jì)，用 pH 8.5 的 TE 緩沖液分別配制濃度為 1.0、0.5、0.1、0.05 劑量/ml 的樣品溶液，同時(shí)在上述樣品中加入等體積的 10 ng/ml DNA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備加樣回收溶液，測(cè)定回收率。

1.2.1.3 飽和苯酚氯仿溶液抽提法 取用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配制的 0.5 劑量/ml 的供試品 450 μl，加入飽和苯酚溶液 450 μl，劇烈振搖混勻，以 10 000 r/min 離心 10 min，轉(zhuǎn)移上層液體，加入飽和苯酚溶液 450 μl 重復(fù)抽提 1 次。轉(zhuǎn)移上層液體加入三氯甲烷 450 μl，劇烈振搖混勻，以10 000 r/min 離心 10 min，轉(zhuǎn)移上層液體置通風(fēng)櫥中敞口放置 15 min 后備用。加樣回收溶液制備：取用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配制的含 0.5 劑量/ml 的供試品及特定濃度的標(biāo)準(zhǔn) DNA 的溶液 450 μl，同法處理，測(cè)定回收率。

1.2.1.4 蛋白酶 K 消化法處理 稱取適量供試品（終濃度分別為 2.0、1.0、0.5、0.1 劑量/ml），加入終濃度為50 μg/ml 的蛋白酶 K 溶液，再用 pH 8.5 的 TE 緩沖液定容至特定體積，混勻后 37 ℃保溫 4 h，作為供試品進(jìn)行測(cè)定。加樣回收溶液制備：稱取適量供試品，加入終濃度為 50 μg/ml 的蛋白酶 K 溶液和 10 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn) DNA 溶液，再用 pH 8.5 的 TE 緩沖液定容至特定體積，同法處理，測(cè)定回收率。

1.2.2 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 考慮到樣品處理可能會(huì)導(dǎo)致收率偏差，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品也按照供試品相應(yīng)處理方法處理后再進(jìn)行測(cè)定。直接測(cè)定和稀釋法測(cè)定時(shí)：取 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配成 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。飽和苯酚氯仿溶液抽提：取 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品和牛血清白蛋白溶液，用pH 8.5 的 TE 緩沖液配成牛血清白蛋白濃度均為0.8 mg/ml，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別用上述飽和苯酚氯仿溶液抽提法進(jìn)行處理。用蛋白酶 K 處理：取 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品和牛血清白蛋白溶液，用 pH 8.5 的 TE 緩沖液配成牛血清白蛋白濃度均為 0.8 mg/ml，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別用上述蛋白酶 K 消化法進(jìn)行處理。

1.2.3 測(cè)定方法 取各方法處理的供試品溶液、供試品加樣回收溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液各 400 μl 于 1.5 ml 離心管中，分別加入新配置的雙鏈 DNA 熒光染料 400 μl，混勻后，避光室溫放置 5 min。取 250 μl 上述反應(yīng)液于 96 孔黑色酶標(biāo)板中，并做 3 個(gè)復(fù)孔。用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng) 480 nm、發(fā)射波長(zhǎng) 520 nm 處測(cè)定熒光強(qiáng)度。以各方法處理的 TE 緩沖液作為樣品空白對(duì)照。數(shù)據(jù)用SoftMax Pro 軟件進(jìn)行處理，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.4.1 精密度 供試品濃度為 0.5 劑量/ml，按 40 ng/ml 濃度加入標(biāo)準(zhǔn) DNA 制備加樣回收樣品。重復(fù)性驗(yàn)證采用一批供試品平行制備 6 份樣品分別測(cè)定進(jìn)行。中間精密度驗(yàn)證采用 3 批供試品，兩名實(shí)驗(yàn)員在不同日期分別進(jìn)行4 次測(cè)定。

1.2.4.2 不同加樣濃度的加樣回收率 對(duì) 0.5 劑量/ml 的供試品濃度分別進(jìn)行 1.25、2.5、10、40 ng/ml 濃度的標(biāo)準(zhǔn) DNA 加樣回收率測(cè)定。

1.2.4.3 不同供試品濃度的加樣回收率 分別對(duì)0.5 劑量/ml、0.2 劑量/ml 和 0.1 劑量/ml 3 個(gè)供試品濃度供試品進(jìn)行 40 ng/ml 的加樣回收率測(cè)定。

1.2.5 供試品測(cè)定 對(duì) 6 批供試品分別進(jìn)行了兩次重復(fù)測(cè)定，供試品濃度 0.5 劑量/ml，精密度的回收率測(cè)定采用 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 10 ng/ml。

2 結(jié)果

2.1 供試品的直接測(cè)定

由于甘精胰島素等電點(diǎn)在 7.0 左右，接近試劑盒中的 TE 緩沖液 pH 值 7.5，會(huì)導(dǎo)致樣品渾濁進(jìn)而可能影響 DNA 檢測(cè)。因此，首先對(duì) TE 緩沖液的 pH 值進(jìn)行確定。結(jié)果表明，供試品 1.0 mg/ml 濃度時(shí)，在 pH 值低于 8.5 時(shí)樣品均有不同程度的渾濁現(xiàn)象，10 ng/ml 的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品加樣回收率 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值均低于 85%，RSD 均大于 25%。pH 8.5 時(shí)樣品清澈，加樣回收率平均值 119%，RSD 為 15.30%，精密度有所提高但仍偏差較大。

2.2 樣品稀釋法

用 pH 8.5 的 TE 緩沖液將供試品稀釋不同倍數(shù)分別進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，結(jié)果見(jiàn)表 1。DNA 標(biāo)準(zhǔn)品加樣濃度 10 ng/ml 時(shí)，供試品稀釋后精密度有所提高，但回收率仍超出 80% ~ 115% 限度范圍，無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)需求，且供試品濃度越低，DNA 濃度的超標(biāo)限值越低，準(zhǔn)確定量難度越大。因此稀釋法不適合本品的外源性 DNA熒光法測(cè)定。

表 1 樣品稀釋法的加樣回收率

注：*三次實(shí)驗(yàn)回收率分別是 108.8%、103.0%、116.7%。

2.3 飽和苯酚氯仿溶液抽提法

0.5 劑量/ml 的供試品加入 10 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)DNA 3 次實(shí)驗(yàn)回收率平均值 82.9%，RSD 為 8.83%。加入 2.5 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn) DNA 3 次實(shí)驗(yàn)回收率平均值 103.9%，RSD 為 18.34%。說(shuō)明飽和苯酚氯仿溶液抽提法在低濃度 DNA 測(cè)定時(shí)偏差較大。

2.4 蛋白酶 K 消化法

結(jié)果（表 2）顯示，蛋白濃度為 2.0、1.0 劑量/ml 時(shí)，酶切完畢時(shí)仍有輕度渾濁現(xiàn)象，說(shuō)明未完全溶解的供試品影響了酶切效果，導(dǎo)致加樣回收率偏差較大。當(dāng)供試品蛋白濃度在 0.5 劑量/ml 或更低時(shí)，樣品清澈，加樣回收率、精密度等均能很好地滿足實(shí)驗(yàn)測(cè)定要求。說(shuō)明供試品中甘精胰島素確實(shí)影響熒光法的 DNA 檢測(cè)，同時(shí)說(shuō)明本方法采用的 pH 值 8.5 是合適的。

表 2 蛋白酶 K 消化法的加樣回收率

2.5 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)品 DNA 終濃度分別是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml。以 3 復(fù)孔熒光讀數(shù)平均值對(duì) DNA 含量（ng/ml）做標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程，見(jiàn)表 3。

表 3 不同處理法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 種方法得到的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線在 1.25 ~ 80 ng/ml 濃度范圍內(nèi)2值均符合 2015 年版《中國(guó)藥典》中外源性 DNA 檢測(cè)熒光染色法的“相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于 0.99”的要求，但飽和苯酚氯仿溶液抽提法線性稍差，且由加樣回收實(shí)驗(yàn)可知在 DNA 低濃度時(shí)（2.5 ng/ml）回收率偏差較大。最終采用蛋白酶 K 消化法進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 精密度 對(duì) 6 份平行樣品分別進(jìn)行 40 ng/ml 濃度標(biāo)準(zhǔn) DNA 加樣回收率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 4。6 次測(cè)定加樣回收率平均值為 98.2%，其 RSD 為 1.64%，表明該法的精密度良好，能滿足實(shí)驗(yàn)測(cè)定要求。3 復(fù)孔讀數(shù) RSD 均小于 5%，表明儀器精密度良好。

不同實(shí)驗(yàn)人員在不同日期分別對(duì) 3 批樣品進(jìn)行 4 次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 5。同一實(shí)驗(yàn)員對(duì)同一批次的 4 次測(cè)定回收率 RSD 均小于5%，同一批次的不同人員 8 次測(cè)定回收率平均值均在 95% ~ 105% 之間，RSD 均小于 5%，方法穩(wěn)定性較好。另外，3 個(gè)批次供試品的所有 24 次測(cè)定 DNA 含量均低于 1.25 ng/ml，說(shuō)明供試品 DNA 含量較低。

2.6.2 不同加樣濃度的回收率 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 6。在各個(gè)加樣濃度下的 3 次實(shí)驗(yàn)加樣回收率平均值均在 80% ~ 115% 之間，RSD 均小于 10%，表明該法能準(zhǔn)確測(cè)定供試品中 DNA 的殘留量。

2.6.3 不同供試品濃度的回收率 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 7。結(jié)果表明 3 個(gè)供試品濃度加樣回收率均在 80% ~ 115% 之間，RSD 均小于 5%，方法耐用性較好。

表 4 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.7 供試品測(cè)定

對(duì) 6 個(gè)批次的甘精胰島素原料藥分別進(jìn)行兩次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 8。結(jié)果表明兩次重復(fù)測(cè)定結(jié)果一致，重現(xiàn)性較好。12 次測(cè)定的 10 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn) DNA 回收率均在 80% ~ 115%之間，表明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。6 批供試品測(cè)定結(jié)果均低于 1.25 ng/ml，即供試品中的殘留 DNA 含量均低于 2.5 ng/劑量。

表 5 中間精密度驗(yàn)證結(jié)果

表 6 不同加樣濃度的準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

表 7 不同供試品濃度的準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

表 8 供試品測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

由于甘精胰島素等電點(diǎn)的特殊性及其對(duì)外源性 DNA 的熒光法檢測(cè)存在干擾，需對(duì)試劑盒緩沖液 pH 進(jìn)行篩選優(yōu)化，且需配制較低濃度的供試品（如 0.5 劑量/ml 及以下）并用蛋白酶 K 處理后進(jìn)行測(cè)定。由于 2015 年版《中國(guó)藥典》未對(duì)重組甘精胰島素的外源性 DNA 含量做出規(guī)定，參考其重組人胰島素 DNA 殘留量的“每一劑量不得過(guò) 10 ng”的限量規(guī)定，在 0.5 劑量/ml 供試品濃度下，DNA 超限濃度為 5 ng/ml。而本法在 DNA 含量 1.25 ~ 80 ng/ml 范圍內(nèi)線性良好，對(duì)超過(guò) 2.5 ng/劑量的 DNA 殘留均可以準(zhǔn)確定量。

熒光染色法是比較成熟的 DNA 檢測(cè)方法，在較寬的 DNA 濃度范圍內(nèi)線性較好[2-3, 7]。我們后續(xù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了 6 次實(shí)驗(yàn)測(cè)定，直接測(cè)定法和蛋白酶 K 消化法標(biāo)準(zhǔn)曲線2一般在 0.997 以上，與文獻(xiàn)一致。但飽和苯酚氯仿溶液抽提法的2基本在 0.988 ~ 0.995 之間波動(dòng)（數(shù)據(jù)未列出）。同時(shí)，由加樣回收實(shí)驗(yàn)可知，飽和苯酚氯仿溶液抽提法 2.5 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn) DNA 回收率 RSD 為 18.34%，而同樣條件下用蛋白酶 K 處理時(shí)回收率 RSD 為 4.1%。推測(cè)可能是 DNA 抽提收率差異導(dǎo)致（尤其 DNA 濃度較低時(shí)），例如上層水相回收體積的差異，測(cè)定前溶液殘留的苯酚和氯仿多少等都可能影響收率，且影響程度難以準(zhǔn)確判斷[3,8]。外源性 DNA 屬于微量雜質(zhì)，檢測(cè)時(shí)干擾因素多，而蛋白酶 K 消化法是較成熟的樣品處理方法，僅需一步操作，無(wú)需對(duì)供試品進(jìn)行 DNA 抽提處理，避免抽提操作帶來(lái)的誤差影響檢測(cè)結(jié)果可靠性。

本文在對(duì)甘精胰島素進(jìn)行蛋白酶 K 處理的基礎(chǔ)上建立了外源性 DNA 殘留量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，其線性、準(zhǔn)確度、精密度良好，可用于甘精胰島素外源性 DNA 殘留量的測(cè)定。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.014

山東省科技重大專項(xiàng)（創(chuàng)新型產(chǎn)業(yè)集群）（2015ZDJQ05001）

張貴民，Email：zhangguimin@lunan.cn

2017-05-31