PD-1/PD-L1/PD-L2小分子抑制劑的研究進(jìn)展

謝永麗，丁寄葳，岑山，周金明

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PD-1/PD-L1/PD-L2小分子抑制劑的研究進(jìn)展

謝永麗，丁寄葳，岑山，周金明

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫室

據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球每年大約有 880 萬人死于惡性腫瘤，且增長態(tài)勢顯著，對人類健康造成了嚴(yán)重的威脅。研究顯示免疫系統(tǒng)在人體自身穩(wěn)態(tài)的維持中起著關(guān)鍵性作用，特別是近十年來隨著較多腫瘤免疫藥物被 FDA 批準(zhǔn)上市，該療法已成為腫瘤治療領(lǐng)域的焦點(diǎn)。因此，2013 年《科學(xué)》將其選為當(dāng)年“最重要的突破”[1]，2015 年又將腫瘤免疫聯(lián)合治療列為“最值得關(guān)注的四項(xiàng)科學(xué)進(jìn)展”之一。在腫瘤免疫治療突破性進(jìn)展中，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的發(fā)展最成熟，特別是靶向程序性死亡因子 1 與其配體（PD-1/PD-L1/PD-L2）檢查點(diǎn)蛋白的抑制劑，療效佳且治療腫瘤類型多。因此，本文總結(jié)了近些年在腫瘤的免疫治療領(lǐng)域中有關(guān) PD-1/PD-L1/PD-L2 檢查點(diǎn)蛋白抑制劑的研究進(jìn)展，特別是極具潛力的小分子抑制劑的發(fā)展，為眾多關(guān)注該領(lǐng)域的研究者提供依據(jù)。

1 免疫檢查點(diǎn)蛋白 PD-1 及其配體 PD-L1/PD-L2 在腫瘤免疫治療中的研究

腫瘤免疫療法通過調(diào)節(jié)、激活免疫系統(tǒng)來治療腫瘤，重點(diǎn)在被動免疫治療，即通過外源輸入機(jī)體免疫效應(yīng)物質(zhì)以調(diào)動機(jī)體免疫系統(tǒng)來治療疾病[2]，典型的如CAR-T 療法及各檢查點(diǎn)蛋白信號通路抑制劑療法。而從現(xiàn)有臨床藥物的使用上看，檢查點(diǎn)蛋白抑制劑已占據(jù)較大市場份額，預(yù)計(jì) 2023 年將會突破 130 億美元的銷量，成為腫瘤免疫治療中的“明星”藥物[3]。免疫檢查點(diǎn)分子大都屬于 B7/CD28 及 TNF/TNFR 超家族成員，是免疫共刺激或共抑制分子[4]，通過實(shí)時協(xié)同調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活性進(jìn)而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。在機(jī)體的免疫調(diào)控中，各檢查點(diǎn)分子發(fā)揮復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)作用，這些分子種類繁多，常見的如PD-1、CTLA-4、IDO、TIM3 等[4]。PD-1 與 CTLA-4 這兩個檢查點(diǎn)蛋白，特別是前者，在目前臨床研究中關(guān)注最多，且已在臨床取得成功應(yīng)用，極大地推動著腫瘤免疫治療的進(jìn)展。

1.1 免疫檢查點(diǎn)蛋白 PD-1 及其配體 PD-L1/PD-L2 的結(jié)構(gòu)和功能

PD-1，也稱為 CD279，屬于 B7-CD28 受體家族成員[5-6]。PD-1 是一個55 kD 的 I 型表面跨膜糖蛋白受體，由 288 個氨基酸組成[7]（圖 1）。該蛋白包含 4 個結(jié)構(gòu)域，胞外區(qū)為一個 lgV 樣的免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，胞質(zhì)區(qū)為一由 95 個殘基組成的結(jié)構(gòu)域，還有一由 22 個殘基組成的柄和一跨膜結(jié)構(gòu)域。其中胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含兩種酪氨酸依賴性的免疫受體信號基序，即免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motify，ITIM）與免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motify，ITSM）。與 B7-CD28 其他家族成員不同，PD-1 通常以單體而非同源二聚體形式存在。

PD-1 的兩個配體PD-L1 與 PD-L2，也分別稱為 CD274 與 CD273，兩者先后是由 290 與 270 個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，兩者都屬于 B7 配體家族，有 34% 的同源性。此外兩者有著類似該家族其他成員的共同結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，即其胞外結(jié)構(gòu)域包括兩個并排的結(jié)構(gòu)域，1 個 IgV 樣區(qū)和 1 個 IgC 樣區(qū)，其可直接與 PD-1 結(jié)合。PD-L1 或 PD-L2 與 PD-1 結(jié)合，受抗原受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使得 PD-1 胞質(zhì)區(qū)兩個酪氨酸信號基序磷酸化，從而激活下游信號途徑，最終破壞 T 細(xì)胞的糖代謝及 IL-2 等信號因子的產(chǎn)生，使得 T 細(xì)胞喪失免疫功能[8]。此外，PD-L1/PD-L2 共有一段大概由 30 個殘基組成的保守胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其功能至今未知[9]。

圖 1 PD-1的基因及其編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域

與其他 B7-CD28 受體家族成員相比，PD-1 的表達(dá)受 T 細(xì)胞活性的調(diào)控，此外 PD-1 也在 B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞以及 DC 細(xì)胞中表達(dá)[10]。其配體 PD-L1 與 PD-L2 的表達(dá)有著很大區(qū)別，PD-L1 在 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及非造血細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá)，而 PD-L2 僅在 B 細(xì)胞集中表達(dá)，通過細(xì)胞因子依賴的方式誘導(dǎo)也可在 DC 細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中部分生成[10]。也正因?yàn)?PD-L2 的表達(dá)相對 PD-L1 表達(dá)所涉及的范圍小，其對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的調(diào)節(jié)作用遠(yuǎn)不及 PD-L1，因此目前針對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的研究主要集中在 PD-1/PD-L1 相互作用上。

外周組織活化的 T 細(xì)胞表達(dá)的 PD-1，通過與配體 PD-L1、PD-L2 結(jié)合，來抑制 T 細(xì)胞的遷移、增殖和炎癥因子的分泌[11-12]。在正常狀態(tài)下，機(jī)體憑借 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用防止免疫系統(tǒng)的過度激活以及保持系統(tǒng)對自身抗原的免疫耐受。但是該信號通路中的檢查點(diǎn)蛋白過表達(dá)，就會產(chǎn)生針對 T 細(xì)胞受體（TCR）或者 B 細(xì)胞受體（BCR）交聯(lián)的共抑制信號及促進(jìn)免疫系統(tǒng)的病理性耐受。在腫瘤微環(huán)境中過表達(dá) PD-L1/PD-L2，均會導(dǎo)致免疫抑制效應(yīng)的產(chǎn)生[13]，從而使得該條件下的腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，因此能夠快速增殖、轉(zhuǎn)移[10]。

1.2 PD-1/PD-L1/PD-L2信號通路抑制劑在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

目前成功用于臨床治療的阻斷 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的藥物主要為抗體藥物，如美國 FDA 在 2014 年 12 月和 9 月分別批準(zhǔn)上市的應(yīng)用于晚期黑色素瘤的納武單抗（nivolumab）[14]和派姆單抗（pembrolizumab）[15]，均是靶向 PD-1 的人源化單克隆抗體。同時，由于檢查點(diǎn)蛋白抑制劑本身并不針對特定的腫瘤細(xì)胞，而是針對腫瘤微環(huán)境中的 T 淋巴細(xì)胞，這使得 PD-1/PD-L1/PD-L2 檢查點(diǎn)抑制劑的研究向著除黑色素瘤之外的其他實(shí)體瘤方向開展[16-18]。如 PD-1 阻斷劑納武單抗與派姆單抗在 2015 年 3 月，被美國 FDA 批準(zhǔn)用于晚期或者轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的治療。另外，在 2016 年，美國 FDA 又批準(zhǔn)上市了用于治療特定類型膀胱癌的靶向 PD-L1 的阿特朱單抗（atezolizumab），另一 PD-L1 抑制劑 durvalumab（MEDI-4736）由 FDA 批準(zhǔn)用于治療 PD-L1 陽性轉(zhuǎn)移性尿路上皮膀胱癌。目前羅氏制藥又嘗試將阿特朱單抗和 durvalumab 用于非小細(xì)胞肺癌的治療，且已處于臨床研究階段[19]。此外，用于膀胱轉(zhuǎn)移性細(xì)胞癌或非小細(xì)胞肺癌的MPDL3280A 與用于治療非鱗非小細(xì)胞肺癌的 BMS-936558，以及其他單克隆抗體如 AMP-514 與 pidilizumab[20]等均進(jìn)入了臨床研究階段。

同時，靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號途徑的組合型免疫治療藥物的研發(fā)，在近幾年受到更多研發(fā)人員的青睞。已經(jīng)處于 II 期臨床的 CheckMate-069，就是納武單抗與易普利（ipilimumab）單克隆抗體的聯(lián)合體，研究結(jié)果顯示，相比于兩單抗的單獨(dú)用藥，CheckMate-069 對黑色素瘤有著更好的療效[21]。除了將 PD-1/PD-L1/PD-L2 抑制劑與其他檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用之外，將其與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptors，TNFRs）、過繼性 T 細(xì)胞治療、腫瘤疫苗以及其他靶向藥物的聯(lián)合使用也受到越來越多研究者的重視[22]。如已經(jīng)有 PD-1 抑制劑與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（vascular endothelial growth factor，VEGFR）抑制劑聯(lián)用的專利出現(xiàn)[23-25]。

2 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路小分子抑制劑的發(fā)展現(xiàn)狀

雖然靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的單克隆抗體受到高度重視且突破性成果不斷出現(xiàn)，但因其研發(fā)成本昂貴、運(yùn)輸和貯存條件要求苛刻，加上抗體藥物自身穩(wěn)定性差以及不能口服使得制劑類型受限，此外臨床跟蹤數(shù)據(jù)顯示部分患者對于該類藥物的治療并不敏感[26]，從而使得最近幾年來，不少研究者將靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2信號通路的抑制劑向著傳統(tǒng)小分子藥物領(lǐng)域拓展，檢查點(diǎn)蛋白小分子抑制劑受到越來越多的關(guān)注。目前已經(jīng)有針對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子抑制劑處于 I 期臨床，如下文將會討論的 CA-170。

靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子抑制劑的發(fā)展落后于單克隆抗體，主要是因?yàn)樵谶^去較長的一段時間中，人們對 PD-1 與 PD-L1/PD-L2 蛋白之間相互結(jié)合信息的了解較為滯后。但 2008 年 Lázár-Molnár等[27]和 Freeman[28]先后將鼠源 PD-1 與人源 PD-L1 蛋白結(jié)合模式信息揭示后，就已經(jīng)有部分企業(yè)進(jìn)行了靶向 PD-1/PD-L1 小分子藥物的設(shè)計(jì)開發(fā)，如美國施貴寶公司于 2015 年報道的靶向該免疫檢查點(diǎn)蛋白的系列小分子抑制劑（圖 2，化合物 1）。該類小分子抑制劑旨在通過阻斷 PD-1 與 PD-L1 的結(jié)合，來克服 PD-1/PD-L1 通路的活化所導(dǎo)致的免疫拮抗性疾病，如腫瘤和 HCV 等[29]。均相時間分辨熒光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）實(shí)驗(yàn)顯示，基于該化合物骨架的 9 個化合物均表現(xiàn)出較好的活性，其中以化合物 2 為代表的 A 類化合物的 IC50值可達(dá)納摩爾水平[30]。

之后，Zak 等[31]以 BMS202、BMS-8 為模式化合物，闡明了這類小分子抑制劑的作用原理。該研究指出這類小分子抑制劑通過作用于 PD-L1 蛋白表面，引起 PD-L1 形成二聚體，而 BMS202、BMS-8 小分子化合物分別結(jié)合于兩個二聚化的 PD-L1 的圓柱形疏水腔中。二聚化后的 PD-L1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用表面與 PD-1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用表面具有高度重合性，導(dǎo)致 PD-1 與 PD-L1 無法產(chǎn)生正常的相互作用從而阻斷該信號通路。

化合物 1 化合物 2化合物 3 化合物 4化合物 5 化合物 6化合物 7 化合物 8化合物 9

值得關(guān)注的是，目前已經(jīng)有抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子化合物處于臨床研究階段，CA-170 就是其中最重要的代表。研究者從 B7 免疫球蛋白超家族成員檢查點(diǎn)蛋白相互作用面的模擬物庫中出發(fā)，篩選得到 CA-170，其作為一種針對 PD-L1、PD-L2 與 VISTA/PD-1H 檢查蛋白信號途徑的口服拮抗劑，目前已經(jīng)進(jìn)入了 I 期臨床研究。體外研究發(fā)現(xiàn)，CA-170 對 PD-1/PD-L1/PD-L2 或 VISTA/PD-1H 信號通路均表現(xiàn)出跨種屬拮抗效應(yīng)，且口服給藥能夠呈劑量依賴性地促進(jìn)腫瘤浸潤與外周 T 細(xì)胞的活力，因而抑制小鼠體內(nèi)同系腫瘤的生長。但 CA-170 化合物的結(jié)構(gòu)至今未見報道。

2015 年，Sasikumar 等[32]申請了能夠抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子化合物 1,2,4-二唑和 1,2,4-噻重氮的衍生物的專利（圖 2，化合物 3）。研究發(fā)現(xiàn)，這類小分子藥物能夠在骨癌、頭頸癌、胰腺癌等多種癌癥，以及細(xì)菌、病毒感染性疾病中有效地抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2信號通路，從而逆轉(zhuǎn)免疫系統(tǒng)的抑制狀態(tài)。Sasikumar 也是 CA-170 的專利申請人之一。此外，Harvard 等[33]構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因組成性表達(dá) PD-L1（PD-1c）與PD-L1 基因敲除（PD-1?/?）的小鼠模型，將合成的以磺胺甲氧嗪與磺胺甲二唑（圖 2，化合物4、5）為代表的化合物，在體外利用 PD-1cT 細(xì)胞和 PD-1?/?T 細(xì)胞進(jìn)行效能測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類化合物在 0 ~ 10 mmol/L 的濃度范圍內(nèi)都有抑制活性，兩者被期待用于糾正機(jī)體免疫紊亂所致疾病。

國內(nèi)目前對于 PD-1/PD-L1/PD-L2 檢查點(diǎn)信號通路小分子抑制劑的研究也逐漸受重視。2016 年 3 月吉林大學(xué)研究者發(fā)現(xiàn)，氨基或者二甲基氨基甲酸酯取代的間苯二酚有著抑制 PD-1/PD-L1 信號通路的潛力[34]。他們在Lin 等[35]和 Zak 等[36]報道的 PD-1/PD-L1 復(fù)合物結(jié)構(gòu)及 Harvard 等[33]對磺胺甲二唑與磺胺甲氧嗪研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，以能夠保證V 型結(jié)構(gòu)域完整的間苯二酚和巰基取代的間苯二酚為原料合成了 13 個化合物。之后進(jìn)行活性篩選得到氨基或者二甲基氨基甲酸酯取代的間苯二酚能夠與 PD-1 結(jié)合，從而阻斷 PD-1 與 PD-L1 的結(jié)合來發(fā)揮功效，其中活性最高的結(jié)構(gòu)如圖2 化合物 6。

圖 3 人源單體 PD-1 的結(jié)構(gòu)（A）和人源 PD-1（紅色條帶）與人源 PD-L1（藍(lán)色條帶）聚合體的結(jié)構(gòu)（B）（與單體 PD-1 相比，聚合體 PD-1 發(fā)生變構(gòu)，其中 CC' 環(huán)發(fā)生了明顯的重排。黃色條帶表示 62-82 位氨基酸殘基，綠色條帶表示 CC' 環(huán) 70-77 位氨基酸殘基）

另外，分子量介于單克隆抗體和傳統(tǒng)小分子化合物之間的小分子肽類藥物也是近些年的關(guān)注熱點(diǎn)之一。Aurigene Discovery Technologies 與 Pierre Fabre 宣布計(jì)劃發(fā)展 AUNP-12（圖 2，化合物 7），來抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號途徑以治療癌癥[33, 37-38]{SASIKUMAR, 2013 #40}，該小分子肽目前處于臨床前研究階段[30]。研究表明，AUNP-12 有著較強(qiáng)的抗腫瘤活性，體外實(shí)驗(yàn)顯示其抑制 PD-1 與 PD-L2 結(jié)合的 EC50可達(dá) 0.72 nmol/L，但是藥代時間較短。因此在該基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，得到了專利 WO 2013/144704（圖 2，化合物 8）、WO 2012/168944（圖 2，化合物 9）報道的化合物，兩者均表現(xiàn)出納摩爾級別的 EC50[30]。

3 PD-1/PD-L1/PD-L2 小分子抑制劑的展望

目前雖然還沒有上市的 PD-1/PD-L1/PD-L2 小分子抑制劑，但是國內(nèi)外對于PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路小分子抑制劑的研究越發(fā)重視。PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路小分子抑制劑的發(fā)展相對落后于單克隆抗體，主要是由于 PD-1/PD-L1/PD-L2 相互作用信息缺乏。2015 年 10 月，Zak 等[31]初次報道了人類 PD-1 與 PD-L1 蛋白結(jié)合復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，即 PD-1 與 PD-L1 蛋白按 1:1 結(jié)合形成復(fù)合物，兩者之間的相互作用類似于 T 細(xì)胞受體與抗體lg V 型區(qū)域的結(jié)合，即由蛋白-蛋白相互作用區(qū)域正面的 GFCC'β 折疊片來介導(dǎo)結(jié)合[36]。PD-1 在與 PD-L1 結(jié)合時，其 Met70-Asp77 處的 CC' 環(huán)將會從遠(yuǎn)離結(jié)合位點(diǎn)的“開放”狀態(tài)發(fā)生 90° 扭轉(zhuǎn)從而轉(zhuǎn)換成“封閉”狀態(tài)，這一變化就使得 PD-1 與 PD-L1 二聚體之間形成了 4 對氫鍵（PD-1 的 Gln75 與 PD-L1 的 Asp26、Arg125 形成 3 對氫鍵、PD-1 的 Thr76 與 PD-L1 的 Tyr123 形成 1 對）（圖 3）。該研究結(jié)果為阻斷 PD-1/PD-L1 結(jié)合小分子抑制劑的研發(fā)提供了結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。Zak 等[36]還指出人類 PD-L1 蛋白的表面有三個“熱點(diǎn)”。其中 Ile134 與 Ile126 處形成的疏水口袋，能夠分別與六元芳香環(huán)和脂肪烴支鏈結(jié)合，被認(rèn)為是小分子藥物作用的位點(diǎn)。但該研究也顯示，在 PD-1 與 PD-L1 形成二聚體后，其交互界面之間同時存在疏水和極性作用，同時也因?yàn)?PD-1 空間構(gòu)象的變換，其部分殘基繼續(xù)形成氫鍵，這就增加了針對該結(jié)合模式的抑制性小分子的設(shè)計(jì)難度。因此，發(fā)展靶向 PD-1/PD-L1 信號通路的小分子抑制劑可謂“機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存”。盡管目前還沒有出現(xiàn)成功的針對 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號途徑的臨床小分子化學(xué)藥物，但是隨著對 PD-1 與其兩個配體之間結(jié)合信息的了解的不斷深入，加上理性藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展，定會有更多的活性化合物被不斷發(fā)現(xiàn)。此外，小分子藥物與單克隆抗體的聯(lián)用也不斷被嘗試，我們也期待這一手段在將來會更加成熟，以提高現(xiàn)有藥物的療效。

4 總結(jié)

綜上所述，PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的阻斷劑在臨床腫瘤免疫治療中取得了令人欣喜的治療效果。雖目前已經(jīng)成功發(fā)展了針對部分癌癥的單克隆抗體，但其研發(fā)成本高，不穩(wěn)定且有潛在的免疫原性副作用，使得對多肽類和小分子抑制劑，特別是小分子抑制劑的研究受到了越來越多的關(guān)注。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的小分子藥物與抗體藥物相比，有著研發(fā)成本較低、制劑多樣、可口服、較好的腫瘤微環(huán)境滲透作用等諸多優(yōu)勢。同時，PD-1 與其配體 PD-L1/PD-L2 之間相互作用信息以及形成的二聚體表面結(jié)合熱點(diǎn)的解讀也越來越深入，這更是為抑制該信號通路的小分子藥物的理性設(shè)計(jì)提供了重要的結(jié)構(gòu)依據(jù)。目前，已經(jīng)有進(jìn)入 I 期臨床的 PD-1/PD-L1/PD-L2 信號通路的小分子抑制劑，如前面提到的 CA-170，更多具有潛在生物活性的化合物處于臨床前研究階段。此外，就腫瘤免疫治療措施本身而言，其所調(diào)動的免疫系統(tǒng)中，腫瘤相關(guān)性可調(diào)控因子與通路眾多，這也為小分子化合物提供了豐富的作用靶標(biāo)。因此，在有望能夠治愈癌癥的免疫療法中，檢查點(diǎn)蛋白小分子化合物免疫制劑在腫瘤中的應(yīng)用范圍定會進(jìn)一步拓展，包括小分子免疫制劑治療癌癥的類型和針對的藥理靶點(diǎn)，從而為腫瘤患者帶來更加光明的治療前景。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.009

國家自然科學(xué)基金（81672559、81311120299）

周金明，Email：zhoujinming@imb.pumc.edu.cn；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2017-06-05