神經干細胞治療脊髓損傷的研究近況

陳曉麗，李少川，陳久智，石達友

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神經干細胞治療脊髓損傷的研究近況

陳曉麗，李少川，陳久智，石達友

510642 廣州，華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院/華南農業(yè)大學國際中獸醫(yī)研究所

脊髓損傷具有較高的發(fā)病率，除了造成機體四肢癱瘓和半身癱瘓外，還可能產生其他繼發(fā)性疾病，嚴重影響患者生活的質量。目前在脊髓損傷的臨床治療中尚未找到確實有效的方法，主要是采用手術減壓、沖擊療法、離子通道阻滯劑等治療措施來控制早期原發(fā)性脊髓損傷進一步發(fā)展成繼發(fā)性脊髓損傷，配合日常的康復訓練和有效的護理恢復脊髓損傷造成的功能障礙[1]。但是，這些方法在脊髓損傷的臨床治療中，仍未取得實質性進展。

隨著人們對干細胞不斷地研究探索，干細胞在修復脊髓損傷臨床研究中取得了一些新的成果。從 2001 年初，解放軍第四六三醫(yī)院神經外科就開始對干細胞治療脊髓損傷的治療基礎進行研究，在 2003 年把干細胞治療應用于臨床，到 2008 年已通過干細胞治療脊髓損傷 400 余例[2]。干細胞在許多神經系統(tǒng)疾?。òㄅ两鹕　⒛X卒中、阿爾茨海默病、癲癇和脫髓鞘病變等）治療中應用，已引起廣泛關注。李慧等[3]將 21 日齡 SD 大鼠用戊四氮建立慢性癲癇點燃模型，取新生 24 h SD 大鼠海馬，提取、培養(yǎng)及純化神經干細胞（neural stem cell，NSC）后進行免疫熒光染色標記，在大鼠癲癇發(fā)作后的第 7 天，將標記的 NSCs 移植入大鼠側腦室。結果發(fā)現，NSCs 移植入癲癇大鼠海馬后能夠存活，并且可以降低海馬 CA3 區(qū)和齒狀回 MFS 程度，有效抑制癲癇發(fā)作。Ferguson 和Son[4]將 NSCs 通過靜脈注射途徑移植到局灶性腦缺血模型的大鼠腦內，4 周后觀察到移植細胞分化為神經元和膠質細胞，大鼠受損的神經功能有一定程度的恢復。呂穎等[5]為了檢測 NSCs 移植后大鼠腦內細胞因子的變化，用 SPF 級的 SD 大鼠制作成帕金森模型后，用酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測各紋狀體的 TNF-α、IL-1β、IFN-γ 和 IL-4 的含量。結果表明，NSCs 移植后會使宿主微環(huán)境內的部分促炎因子（TNF-α、IL-1β）下降，抗炎因子（IL-4）升高，同時伴隨具有神經再生和保護作用的促炎因子（IFN-γ）的升高。本文將近年來所研究的神經干細胞的來源、治療特點、移植途徑及作用機制與脊髓損傷治療相結合作一綜述，為應用干細胞治療脊髓損傷提供理論和實驗依據。

1 神經干細胞的來源

神經干細胞的來源廣泛，有來源于機體的神經組織，也有來源于機體的其他組織。成年機體組織神經干細胞來源廣，但是可提取的數量極少，獲取工作程序較為復雜，在獲取神經干細胞的同時，有使成體神經功能受到損害的危險性，因此在成年機體組織中提取神經干細胞在臨床實際應用中較為罕見。在臨床上實際運用比較多的是成年機體非神經組織來源的神經干細胞，特別是血液系統(tǒng)中骨髓來源的成體神經干細胞。曹志勇等[6]應用自體骨髓間充質源神經干細胞通過腰椎穿刺術經蛛網膜下腔鞘內注射移植，治療 7 例中樞神經系統(tǒng)疾病患者，移植后無不良反應，6 個月后 7 例患者神經功能缺損癥狀較移植前均有一定程度的改善。說明骨髓來源的成體神經干細胞在移植治療中樞神經系統(tǒng)疾病中安全、有效（表 1）[7]。

2 神經干細胞的特點

目前神經干細胞還未見有準確定義，一般認為神經干細胞存在于神經系統(tǒng)中，具有多項潛能，有自我更新、多潛能分化、高度增殖和遷移等特性，在含有血清的培養(yǎng)基中，先球形懸浮生長后貼壁生長，并向四周伸展，形成軸突或樹突樣結構，可分化為成熟的神經元和神經膠質細胞[8]。CD133+/CD34-/CD45-被認為是神經干細胞的表達特征[9]，應用最廣的表達特異性分子是神經元中間絲蛋白-神經巢蛋白（nestin），nestin 的表達是暫時的，一旦前體細胞分化成終末分化細胞如神經元或膠質細胞，nestin 則被其他中間纖維蛋白所取代[10]。神經干細胞還具有低免疫原性，由于神經干細胞仍是原始細胞處于未分化的階段[11]，因此它在體內不表達細胞抗原，將神經干細胞移植入機體后降低了機體免疫排斥的可能，從而減少發(fā)生免疫排斥的風險。盡管神經干細胞具有低免疫原性，但也不可排除一定不會發(fā)生免疫排斥，黃喜軍等[12]采用去細胞異種神經復合同種異體脂肪干細胞修復獼猴周圍神經缺損，結果表明未產生全身及局部免疫排斥反應，復合同種異體脂肪干細胞移植后也未發(fā)現免疫排斥反應。說明神經干細胞移植對機體的免疫排斥反應已經可以通過人工技術進行避免，在臨床醫(yī)學上常見在細胞移植前期先給患者打免疫抑制劑，再進行細胞移植。

神經干細胞具有的多能性，與其特有的分化方式有關。如圖 1 所示，神經干細胞分化的子細胞能根據機體需要，分化產生神經系統(tǒng)的各類細胞，有對稱分裂及不對稱分裂兩種分裂方式。其中神經細胞的不對稱分裂是起治療作用的主導因素，通過不對稱分裂產生一個祖細胞和另一個干細胞，祖細胞能自發(fā)分化生成神經元細胞、成膠質細胞、神經細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞等，另一個干細胞又可以循環(huán)這一系列分化，繼續(xù)分化子代細胞，使機體干細胞庫保持基本穩(wěn)定[13]。

表 1 神經干細胞來源、獲取途徑和優(yōu)缺點分析

圖 1 神經干細胞分裂示意圖（在神經干細胞分化的前體細胞中可以檢測到特異性分子nestin 的表達，一旦前體細胞分化成終末分化細胞如神經元、膠質細胞、神經細胞等，nestin 則被其他中間纖維蛋白所取代）

3 神經干細胞在脊髓損傷中的移植途徑

隨著神經干細胞在脊髓損傷臨床治療中的不斷研究探索，確保移植細胞能有效抵達脊髓損傷處并發(fā)揮其修復的功能是醫(yī)治脊髓損傷的關鍵所在。在脊髓損傷后的 7 d 內，機體會產生一系列炎癥反應，損傷的微環(huán)境不利于干細胞生存，因此在第 7 ~ 15 天這段時間是移植神經干細胞的最佳時機。神經干細胞的移植途徑主要有局部注射移植、經腦脊液注射移植、經血液循環(huán)注射移植等途徑（表2）[14]。

許祖遠等[15]制作成年大鼠脊髓全切模型，用 Brdu 標記神經干細胞后經尾靜脈注射至大鼠體內，觀察神經干細胞靜脈移植對脊髓損傷的治療作用，結果表明：通過靜脈移植的神經干細胞能遷移到脊髓損傷處代替受損的神經細胞，重建神經回路。干細胞在動脈血中與在靜脈血中相比能在更短的時間內到達作用部位發(fā)揮作用，確保干細胞到損傷處的治療量，提高干細胞的利用率。Lundberg 等[16]將經靜脈移植干細胞和經動脈移植干細胞這兩種方法作對比，在大鼠的損傷模型中對治療效果進行比較，在綜合比較中發(fā)現經動脈移植的神經干細胞的治療效果比經靜脈移植的神經干細胞治療效果更佳。

4 神經干細胞在治療脊髓損傷中的作用機制

將神經干細胞運用于脊髓損傷治療中發(fā)現，神經干細胞移植到患者機體后，可在損傷處定向分化成為功能細胞，替代和補充壞死或凋亡的細胞，分泌神經營養(yǎng)因子，對損傷處進行有效的修復，在修復受損的脊髓神經組織中發(fā)揮重要的作用。趙錫武等[17]將神經干細胞和骨髓間充質干細胞作為對比，通過靜脈注射移植到脊髓半橫切模型的大鼠中治療，結果表明神經干細胞移植的治療效果更為明顯。目前 NSCs 移植治療脊髓損傷的研究仍處于臨床前期研究階段，但從許多動物實驗及少量的臨床研究已經取得的成果可以證實，NSCs 移植可以促使脊髓損傷的神經功能恢復。其可能的作用機制有：

表 2 神經干細胞在脊髓損傷中的移植途徑和優(yōu)缺點分析

4.1 替代作用

通過將神經干細胞直接移植到脊髓損傷處或間接激活體內的神經干細胞的方法，使移植到體內的神經干細胞根據機體損傷需求進行分化，可定向分化為神經元和膠質細胞等功能細胞。膠質細胞具有分泌營養(yǎng)因子的功能，能修復受損的軸突促進其再生，同時膠質細胞也可以產生多種細胞外基質，對脊髓空腔進行填充并與機體體內已有的神經細胞結構有效結合，而達到部分修復脊髓損傷的目的。徐委和程黎明[18]通過對神經營養(yǎng)因子修復脊髓損傷的研究，發(fā)現神經營養(yǎng)因子可以有效抑制脊髓損傷后神經元凋亡，促進神經再生及分化，聯合應用神經營養(yǎng)因子修復脊髓損傷具有協(xié)同作用，如基因轉染技術、生物工程技術等。Lepore 等[19]將從大鼠脊髓組織分離的脊髓神經干細胞，移植到脊髓損傷的大鼠模型中，用雙重免疫染色法進行檢測，結果證實移植的神經干細胞可以向神經元分化，可以通過電鏡觀察到新生的神經元。Lee 等[20]研究發(fā)現移植入人神經干細胞能夠促進脊髓半切犬的神經功能恢復，被植入犬體內的神經干細胞可進一步分化為成熟神經元和少突神經膠質細胞。說明了直接移植神經干細胞到機體內，神經干細胞的替代療法能對脊髓損傷處起到有效的修復作用。

4.2 基因治療

基因治療指利用基因手段將外源目的基因導入神經干細胞內，增殖培養(yǎng)后導入機體脊髓損傷處發(fā)揮效應，在機體內可長期和安全地產生神經營養(yǎng)因子和促生長因子的一種用以修復脊髓損傷的治療方法[21]。將攜帶治療作用的目的基因移植到將注入機體的神經干細胞中，使攜帶目的基因的神經干細胞在損傷處達到細胞替代和基因治療的雙重作用。鄧興力[22]構建神經營養(yǎng)因子 3 基因直接表達載體后，應用核轉染技術將神經營養(yǎng)因子 3 基因轉入神經干細胞中，對神經營養(yǎng)因子 3 修飾的神經干細胞在大鼠脊髓損傷的治療效果進行綜合性檢測，結果顯示神經營養(yǎng)因子 3 修飾的神經干細胞移植更能改善脊髓損傷大鼠的脊髓功能，不僅能使更多的移植細胞存活，還能促使被移植的神經干細胞進一步分化成少突膠質細胞。與未經修飾的神經干細胞的治療效果進行研究比較得出，攜帶有神經營養(yǎng)因子 3 的神經干細胞在大鼠脊髓損傷中的治療效果更佳。

4.3 誘導療法

選擇合適的誘導因子是神經干細胞在脊髓損傷治療中的推進劑，不僅可以誘導機體內自身的神經干細胞進行分化，也可以增加異體注射的神經干細胞療效。曲揚[23]將姜黃素與神經干細胞聯合在一起治療脊髓損傷，姜黃素有抗炎抗氧化作用，可為 NSCs 移植提供良好微環(huán)境，還可促進神經系統(tǒng) BDNF 表達，并促進 NSCs 分化遷徙，兩者聯合能夠顯著地提高神經干細胞分化為神經元的比例，并減少神經元的凋亡。張坤[24]利用骨髓來源的 M1/M2 型極化巨噬細胞條件性培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)小鼠胚胎脊髓來源的神經干/前體細胞（NS/PCs），將 NS/PCs 分別與 M1 或 M2 巨噬細胞聯合移植入正常和損傷的小鼠脊髓后，移植的 M1 型巨噬細胞可促進 NS/PCs 向星形膠質細胞方向分化；而M2 型巨噬細胞卻可以使 NS/PCs 更多地分化為神經元及少突膠質細胞，分化的神經元可以與宿主神經元細胞發(fā)生整合，促進脊髓損傷后運動功能的恢復。選擇合適的誘導干細胞因子，可以使其與神經干細胞互補治療，誘導神經干細胞進行分化，互相發(fā)揮最大的療效，促進損傷處的恢復。但如何選擇最佳的誘導因子與神經干細胞作為最佳組合，仍需進一步研究。

5 小結

NSCs 的發(fā)現不僅給稱為“不治之病”的脊髓損傷患者帶來希望，也給其他神經系統(tǒng)常見疾病帶來光明，近年來很多學者著手干細胞治療神經系統(tǒng)疾病的臨床應用研究工作。但是，由于目前仍對 NSCs 的認識與了解有限，NSCs 在治療脊髓損傷中仍存在一些迫切需要解決的問題。例如，神經干細胞雖具有低免疫原性，但在異體移植的治療中仍存在免疫排斥風險，神經干細胞在生物體內的成活率及增殖分化能力是否會受其他因素的影響而致瘤或消耗等問題，如何有效地解決以上問題將是推動神經干細胞安全有效應用的關鍵一步。研究結果表明，隨著神經組織工程技術的逐漸成熟，利用神經干細胞所具備的功能特性，將神經干細胞移植到脊髓損傷處，能有效地促進受損神經組織的修復，提高神經干細胞治療脊髓損傷的臨床療效。

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國家十三五重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0501010）

石達友，Email：shidayou@scau.edu.cn

2017-07-22