香菇多糖樹脂法脫蛋白質(zhì)工藝研究

仲偉潭，宋盼，王崔巖，郭月玲，彭亮，常亮，張雪霞

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香菇多糖樹脂法脫蛋白質(zhì)工藝研究

仲偉潭，宋盼，王崔巖，郭月玲，彭亮，常亮，張雪霞

050015 石家莊，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司/微生物藥物國家工程研究中心/河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心

用樹脂去除香菇多糖粗品中的蛋白質(zhì)，純化香菇多糖。以香菇多糖得率和蛋白質(zhì)去除率為指標(biāo)，比較 5 種不同種類樹脂（D303、D315、HZ816、HZ801、FPA98）對香菇多糖粗品吸附的情況，并通過單因子試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化樹脂去除香菇多糖中蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)。強(qiáng)堿性陰離子樹脂 FPA98 吸附效果最好，在 pH 值為 9.0，上樣質(zhì)量濃度為 2 mg/ml，上樣量為每毫升樹脂20 mg，流速為 1 BV/h 的工藝條件下，香菇多糖提取液中的蛋白質(zhì)去除率可達(dá) 70% 以上，多糖保留率為 80%以上。此工藝操作簡單，環(huán)保，具有較好的實(shí)用性。

香菇多糖； 蛋白質(zhì)； 樹脂吸附法

香菇多糖是香菇中的重要生物活性成分，是一種-1,3-D 葡聚糖，20 世紀(jì) 60 年代，日本科學(xué)家證明其具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，香菇多糖還有抗感染、抗輻射、抗凝血等作用，硫酸化香菇多糖還具有顯著抗 HIV 的作用，同時香菇多糖在治療胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等方面也有良好療效，作為免疫輔助藥物，香菇多糖在國際市場上得到推廣應(yīng)用[3]。

有關(guān)香菇多糖的分離純化報(bào)道很多，在分離階段大多采用有機(jī)試劑沉淀法[4-8]去除其中的蛋白質(zhì)，但是存在一次除蛋白率低、有機(jī)相不易分離等缺點(diǎn)。本文通過實(shí)驗(yàn)，用大孔樹脂去除香菇多糖粗粉中的蛋白質(zhì)，一次除蛋白效率高、操作簡單、環(huán)保，并避免了因采用酸或堿而對香菇多糖造成的破壞。

1 材料與方法

1.1 材料

TU-1901 紫外可見分光光度計(jì)為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TDA-8002 型恒溫水浴鍋為天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52AA 型購自上海榮生化儀器廠；機(jī)械攪拌器購自上海司樂儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室 pH 計(jì)（FE20）購自梅特勒·托利多公司；真空減壓濃縮罐 ZN200 型為常熟市天工醫(yī)藥化工設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

香菇，購于本地市場；大孔吸附樹脂、離子交換樹脂為上海華震科技有限公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán) G-250 和牛血清白蛋白均購自美國 Sigma 公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率的測定及計(jì)算方法 采用考馬斯亮藍(lán) G-250 法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品[9]，線性回歸方程為= 221.45– 12.013，相關(guān)系數(shù)= 0.9975，其中，為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；為吸光度。

蛋白質(zhì)去除率 =ρ前– ρ后× 100% ρ前

式中：前、后分別為上柱前和上柱后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，單位為 μg/ml。

采用苯酚-硫酸法[10]測定香菇粗多糖去除蛋白質(zhì)前后的多糖含量。

多糖保留率 =上柱后多糖含量× 100% 上柱前多糖含量

1.2.2 樣品溶液的制備 10 kg 新鮮香菇粉碎后，按料液比 1:20（g/ml）加水，沸水浸提 3 h，離心，菇渣再沸水浸提 2 h 后離心，合并兩次提取液。提取液用真空減壓濃縮罐濃縮至 30 L 后，加乙醇至 75% 沉淀，過濾得香菇粗多糖濕品；濕品按 1:40 加水復(fù)溶，沸水浸提 3 h，過濾，濾液用真空減壓濃縮罐濃縮至 10 L，加乙醇至 60% 沉淀，過濾，所得沉淀物 60 ℃真空干燥得到香菇粗多糖干品。將適量香菇粗多糖干品加水，100 ℃加熱攪拌下溶解 2 h，過濾，濾液為樣品溶液。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理 大孔吸附樹脂先用 4 BV（BV：樹脂柱床體積）5% HCl 溶液流動洗柱，洗完后浸泡 3 h以除去樹脂中的無機(jī)雜質(zhì)，用去離子水沖洗至中性；再用 4 BV 5% NaOH 溶液流動洗柱，洗完后浸泡 3 h以除去樹脂中的有機(jī)雜質(zhì)，用去離子水沖洗至中性。而后用工業(yè)乙醇浸泡 6 h，最后用蒸餾水洗至無醇味。

陰離子交換樹脂先用 4% 的 NaOH 溶液浸泡 12 h，然后用去離子水洗至中性；再用 5% 的 HCl 溶液浸泡 12 h，然后用去離子水洗至中性。

1.2.4 樹脂類型篩選 準(zhǔn)確量取處理好的離子交換樹脂 50 ml，濕法裝入玻璃層析柱，將 2 mg/ml 的樣品溶液 200 ml 以 1 BV/h 的流速流過樹脂層析柱，收集流出液。上樣完畢，關(guān)閉柱子下端活塞，接著用 2 BV 去離子水以 1 BV/h 的流速洗脫，再用 4 BV 8% NaCl 以 1 BV/h 的流速解吸，合并水洗脫液與上樣收集的流出液，測定其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和多糖含量，計(jì)算蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率。

1.2.5 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn) 根據(jù)靜態(tài)試驗(yàn)篩選出的樹脂，以香菇粗多糖樣品溶液的 pH 值、質(zhì)量濃度、上樣量和上樣流速為單因素條件，測定并計(jì)算不同條件下的蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化工藝條件。

2 結(jié)果

2.1 不同樹脂對香菇粗多糖的蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率比較

通過 5 種不同種類樹脂對香菇粗多糖的蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率比較（表 1），發(fā)現(xiàn)強(qiáng)堿性陰離子樹脂 FPA98 去蛋白質(zhì)效果較好，多糖保留率較高，適合香菇粗多糖的蛋白質(zhì)去除純化。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 pH 值對樹脂蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率的影響 將相同質(zhì)量濃度的樣品溶液調(diào)成 pH 為 4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0，分別取 200 ml 上到 50 ml FPA98 樹脂柱，按照動態(tài)吸附操作方法操作，由圖 1 可以看出，當(dāng) pH 為 4.0 ~ 8.0 范圍時，樹脂對香菇粗多糖溶液的蛋白質(zhì)去除率隨著 pH 值的升高明顯升高，當(dāng) pH 為10.0 ~ 12.0，蛋白質(zhì)去除率隨 pH 升高而降低，多糖保留率也明顯降低。從蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率綜合考慮，pH 值應(yīng)在 8.0 ~ 10.0 之間為宜。

2.2.2 樣品溶液質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)去除的影響 將樣品溶液質(zhì)量濃度調(diào)成 1、2、3、4、5 mg/ml，pH 值為 9.5，分別取 200 ml 上到 50 ml PFA98 樹脂柱，按照動態(tài)吸附操作方法操作，由圖 2 可知，樣品溶液質(zhì)量濃度在 3 mg/ml 之前，蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率基本無變化，當(dāng)料液質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，蛋白質(zhì)去除率和多糖保留率均有所降低。實(shí)驗(yàn)過程中，當(dāng)料液質(zhì)量濃度到 5 mg/ml 時，料液太黏稠，無法順利流過樹脂柱。

表 1 5 種樹脂的去除蛋白能力比較

百分率（%）Percentage (%)1009080706050403020100 4 6 8 10 12 pH

Figure 1 Effect of pH on protein removal rate and polysaccharide retention rate

百分率（%）Percentage (%)80 75 70 65 60 55 50 1 2 3 4 上樣質(zhì)量濃度（mg/ml）Sample concentration (mg/ml)

Figure 2 Effect of sample concentration on protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.2.3 上樣量對蛋白質(zhì)去除的影響 將一定質(zhì)量濃度的樣品溶液 pH 值調(diào)為 9.5，上到 50 ml PFA98 樹脂柱，分段收集流出液，按照動態(tài)吸附操作方法操作，由圖 3 可看出，隨著上樣量的增大，蛋白質(zhì)去除率逐漸降低，多糖保留率有所上升，當(dāng)上樣量增大至每毫升樹脂 30 mg 時，蛋白質(zhì)去除率明顯降低，因此，上樣量以不超過每毫升樹脂30 mg 為宜。

2.2.4 上樣流速對蛋白質(zhì)去除率的影響 將一定質(zhì)量濃度的樣品溶液 200 ml，pH 調(diào)為 9.5，上到 50 ml PFA98 樹脂柱，上樣流速分別為 0.5、1、1.5、2、2.5 BV/h，按照動態(tài)吸附操作方法操作，由圖 4 可看出，隨著上樣體積的增加，蛋白質(zhì)去除率逐漸降低。當(dāng)流速為 1 BV/h 時，蛋白質(zhì)去除率較高且降低緩慢，但是流速過慢，影響生產(chǎn)效率，延長生產(chǎn)周期；流速過高，蛋白質(zhì)去除率下降太快。綜合考慮，最佳上樣流速為不超過 2 BV/h。

百分率（%）Percentage (%)90 80 70 60 50 10 20 30 40 50 上樣量（mg）Sample loading amount (mg)

Figure 3 Effect of sample loading amount on protein removal rate and polysaccharide retention rate

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照 L9(34) 正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表 2），全面考察 4 個因素對樹脂去除香菇粗多糖中蛋白質(zhì)的影響，確定最佳工藝條件，結(jié)果見表 3。

由表 3 蛋白去除率極差分析可看出，pH 對于蛋白去除率的影響較大，上樣量次之，上樣質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)去除率影響最小。從數(shù)據(jù)分析確定的蛋白質(zhì)最佳去除條件為 pH 9.0，上樣質(zhì)量濃度為1 mg/ml，上樣量為每毫升樹脂 10 mg，上樣流速為 0.5 BV/h。

由表 3 多糖保留率極差分析可看出，pH 對于多糖保留率影響最大，上樣質(zhì)量濃度次之，上樣量對多糖保留率影響最小。從數(shù)據(jù)分析確定的最佳多糖保留率條件為 pH 8.5，上樣質(zhì)量濃度為3 mg/ml，上樣量為每毫升樹脂 30 mg，上樣流速為 1.5 BV/h。

百分率（%）Percentage (%)80 70 60 50 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 上樣流速（BV/h）Flow rate (BV/h)

Figure 4 Effect of sample flow rate on protein removal rate and polysaccharide retention rate

表2 香菇粗多糖蛋白質(zhì)去除正交試驗(yàn)因素及水平

表3 香菇多糖去蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

綜合考慮，最終確定 FPA98 樹脂對香菇多糖粗品的最佳去蛋白工藝為 pH 9.0，上樣質(zhì)量濃度為 2 mg/ml，上樣量為每毫升樹脂 20 mg，上樣流速為 1 BV/h。在此條件下進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，香菇多糖的蛋白質(zhì)去除率可達(dá) 70.53%，多糖保留率為 80.65%，優(yōu)于正交組合表中各處理的結(jié)果，證明優(yōu)化的條件是合理的。

3 討論

采用大孔吸附樹脂和離子交換樹脂對香菇多糖粗粉進(jìn)行脫蛋白，以蛋白去除率和多糖保留率為指標(biāo)，篩選出強(qiáng)堿性陰離子樹脂 FPA98 效果最好。通過單因素和正交試驗(yàn)對其進(jìn)行優(yōu)化，采用此工藝的最佳工藝條件為：pH 值為 9.0，上樣質(zhì)量濃度為2 mg/ml，上樣量為每毫升樹脂 20 mg，上樣流速為 1 BV/h。蛋白質(zhì)去除率可達(dá) 70% 以上，多糖保留率 80% 以上。

本研究采用樹脂法去除香菇多糖中的蛋白質(zhì)，與常規(guī)的多糖脫蛋白方法相比具有工序少、操作簡單、溶劑安全、處理量大、周期短、不會破壞多糖的結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。因此，采用樹脂進(jìn)行香菇多糖脫蛋白不僅為后續(xù)研究香菇多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)與生物活性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為研究其他植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵后提取的多糖進(jìn)行蛋白質(zhì)去除提供了重要技術(shù)參考。

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Study on removal of protein from lentinan by resin adsorption method

ZHONG Wei-tan, SONG Pan, WANG Cui-yan, GUO Yue-ling, PENG Liang, CHANG Liang, ZHANG Xue-xia

National Engineering Research Center of Microbial Medicine, Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center, New Drug Research & Development Company of NCPC, Shijiazhuang 050015, China

To remove the proteins from crude lentinan by resin adsorption method.Based on the index of lentinan yield and protein removal rate, 5 different kinds of resins (D303, D315, HZ816, HZ801 and FPA98) were compared to the adsorption of crude lentinan, and then the technological parameters of removing the protein from Lentinan were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment.Thestrong basic anion exchange resin FPA98 was selected as the best adsorbent. The protein removal rate could reach above 70% and the lentinan retention rate was above 80% under the optimal conditions such as pH 9.0, the sample mass concentration of 2 mg/ml, the sample loading amount with 20 mg per milliliter resin, and the flow rate of 1 BV/h.The process is simple, environmental friendly and practical.

Lentinan; Proteins; Resin adsorption method

ZHANG Xue-xia, Email:zhangxuexiazxx@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.006

張雪霞，Email：zhangxuexiazxx@163.com

2017-06-19