新型基于吖啶酯平臺的乙型肝炎病毒表面抗原全自動管式化學發(fā)光定量檢測試劑的建立和評價

趙輝，溫順華，李麗華，賴燕暉，翁祖星，孫旭東

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新型基于吖啶酯平臺的乙型肝炎病毒表面抗原全自動管式化學發(fā)光定量檢測試劑的建立和評價

趙輝，溫順華，李麗華，賴燕暉，翁祖星，孫旭東

100012 北京，中國醫(yī)科大學航空總醫(yī)院檢驗科（趙輝）；361022 廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司（溫順華、李麗華、賴燕暉、翁祖星、孫旭東）

擬建立一種新型基于吖啶酯平臺的乙型肝炎病毒表面抗原全自動管式化學發(fā)光定量檢測試劑?；谧灾餮邪l(fā)的全自動化學發(fā)光免疫檢測系統，通過抗體配對篩選，體系調整等方法建立 HBsAg 全自動化學發(fā)光定量檢測試劑，并與羅氏試劑進行定量相關性比較，使用不同亞型標本進行評價。研發(fā)的 HBsAg 定量檢測試劑定量范圍為 0 ~250 IU/ml，與羅氏試劑檢測臨床標本具有良好的一致性（2= 0.9794），對國家參考品中的靈敏度參考品檢測結果均符合國家標準，試劑對不同亞型的檢測性能良好，在 0.05 ~ 250 IU/ml 范圍內具有很好的線性（= 0.9990），試劑對國家參考品中的準確度參考品檢測結果符合國家標準，稀釋 400 倍檢測的可報告上限為100 000 IU/ml，批內精密度均小于 10%，批間精密度小于 15%。該研發(fā)的試劑具有良好的檢測性能，具有廣闊的應用前景。

乙型肝炎表面抗原； 試劑盒，診斷； 發(fā)光測定法

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是導致全球每年超過 100 萬人死亡的全球性公共衛(wèi)生問題[1]。在我國，1 ~ 59 歲人群中乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率達 5.1% ~ 6.9%，約有8000 萬 HBV 攜帶者[2]。乙型肝炎病毒表面抗原是乙型肝炎病毒的外膜結構蛋白，HBsAg 在 HBV 感染者血清中以三種顆粒形式存在，Dane 顆粒、小球形顆粒和管型顆粒。

自 1967 年首次發(fā)現以來，HBsAg 從最初作為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）病毒感染的定性診斷指標逐漸發(fā)展為目前廣泛應用的定量檢測指標[3-4]。最初，研究人員發(fā)現血液中 HBsAg 水平與肝細胞核中病毒復制模板共價閉合環(huán)狀（ccc）DNA 具有一定的相關性[5]。在隨后的研究中，又發(fā)現血清中 HBsAg 水平可以很好地反映治療應答，監(jiān)測 HBsAg 水平有助于鑒別聚乙二醇干擾素（PEG-IFN）或核酸類似物治療無應答的患者，同時可對病人的精細化治療提供有效信息[6-7]。全自動化學發(fā)光檢測系統具有靈敏度高、定量范圍寬、自動化等優(yōu)勢。但目前 HBsAg 定量檢測市場大部分被跨國公司如羅氏、雅培等壟斷。本研究基于自主研發(fā)的全自動化學發(fā)光免疫檢測系統研發(fā)出 HBsAg 定量檢測試劑并進行了相關評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物活性材料 抗 HBsAg 抗體共 8 株，來自廈門萬泰滄海生物技術有限公司；HBsAg 突變株 WT、G119R、P120T、C124Y、I126S、Q129R、S136P、C139R、T140I、P144A、G145A、G145R、M204U、M204I、吖啶酯和臨床血清樣本均來自廈門大學國家傳染病與疫苗工程技術研究中心；表面抗原國家參考品來自國家臨檢中心；WHO HBsAg 標準（2th，NIBSC code00/588）來自英國國家生物制品檢定所（NIBSC）；磁微粒購自美國 Merck 公司。

1.1.2 主要試劑 乙肝表面抗原定量檢測試劑盒（化學發(fā)光微粒子免疫檢測法）購自美國 Abbott GmbH & Co.KG 公司；乙肝表面抗原定量檢測試劑盒（電化學發(fā)光法）購自德國 Roche 診斷有限公司。

1.1.3 儀器 Caris200 全自動管式化學發(fā)光免疫分析儀及其配套耗材購自廈門優(yōu)邁科醫(yī)學儀器有限公司；Berthold Sirius 單管式化學發(fā)光檢測儀購自德國 Berthold Technologies 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本檢測 樣本的檢測嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

1.2.2 磁微粒包被 磁微粒用 50 mmol/L pH 值為 5.0 的 MES 緩沖液洗滌 2 次后加入新配制的EDC 溶液活化 30 min，用 MES 緩沖液洗滌 2 次，加入抗體混勻后 37 ℃反應 3 h，包被結束后用 MES 緩沖液洗滌，并用包含 1% 酪蛋白的磷酸鹽緩沖液重懸，置于 4 ℃保存。

1.2.3 吖啶酯標記 取 50 μg 抗體加入到 300 μl 50 mmol/L pH 值為 8.0 的磷酸鹽緩沖液中，并加入 5 μl 5 mmol/L 的吖啶酯溶液（吖啶酯用甲基甲酰胺配制），混勻后室溫避光反應 30 min；加入甘氨酸溶液終止反應 30 min，最后用 20 mmol/L pH 值為 7.4 的磷酸鹽緩沖液 4 ℃透析，去除游離吖啶酯。

1.2.4 單管式化學發(fā)光免疫檢測 向微孔板中依次加入樣本 50 μl、濃度為 0.4 mg/ml 包被了抗體的磁微粒 50 μl，混勻后 37 ℃反應 15 min，通過磁分離系統集磁并對微孔板用洗液清洗 2 次，隨后加入 100 μl 按 1:200 稀釋的吖啶酯標記抗體，37 ℃反應 10 min，清洗 4 次，將反應孔中的磁微粒轉移至透明試管中，用單管式化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光值。

1.2.5 全自動管式化學發(fā)光免疫分析儀檢測 將制備好的磁微粒試劑和吖啶酯分別分裝置于 Caris200 全自動管式化學發(fā)光免疫分析儀配套的試劑瓶中，并裝載至儀器上，設置檢測參數并確認相關配套實驗耗材數量。將樣本裝載至儀器配套樣本架中，上機進行全自動檢測。

2 結果

2.1 抗 HBsAg 抗體配對的篩選

將獲得的 8 株抗 HBsAg 抗體分別標記吖啶酯和磁微粒，進行交叉配對。采用單管式化學發(fā)光免疫分析儀檢測 1 份 HBsAg 陽性樣本和 1 份 HBsAg 陰性樣本，計算各配對陽性樣本檢測 RLU 值和陰性樣本檢測 RLU 值的比值（P/N）。結果如圖 1 所示，除了 Ab-7 外，其他抗體包被的磁微粒與 Ab-1 標記的吖啶酯 P/N 比值均較好，此外，Ab-6 對 Ab-4 和 Ab-2、Ab-2 對 Ab-4 和 Ab-3 也具備較好的反應性。因此，選擇 Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab-6 和 Ab-8 對 Ab-1，Ab-6 對 Ab-4 和 Ab-2，以及 Ab-2 對 Ab-4 和 Ab-3 檢測 HBsAg 突變株 WT、G119R、P120T、C124Y、I126S、Q129R、S136P、C139R、T140I、P144A、G145A、G145R、M204U、M204I，評價各配對對突變株的反應性。結果如圖 2 所示，Ab-3、Ab-4、Ab-6 和Ab-8 對 Ab-1 檢測突變株的能力較其他配對好，且對突變株的檢測能力能夠互補，因此選擇Ab-3、Ab-4、Ab-6 和 Ab-8 對 Ab-1 進行試劑的建立。

P/N 3500.00 3000.00 2500.00 2000.00 1500.00 1000.00 500.00 0MB Ab-1MB Ab-2MB Ab-3MB Ab-4MB Ab-5MB Ab-6MB Ab-7MB Ab-8 SAE Ab-1 SAE Ab-2 SAE Ab-3 SAE Ab-4 SAE Ab-5 SAE Ab-6 SAE Ab-7 SAE Ab-8

Figure 1 Comparison of different antibodies pair for sample detection

P/N 30.0 20.0 10.0 0 WT G119R P120T C124Y I126S Q129R S136P C139R T140I P144A G145A G145R M204U M204I HBsAg 突變體HBsAg mutants

Figure 2 Comparison of different antibodies for detection of HBsAg mutants

2.2 試劑性能評價

定量免疫檢測試劑的關鍵分析性能指標主要包括線性范圍、可報告范圍、準確度、精密度、靈敏度等項目。在本研究中，各項分析性能的評估均參照《體外診斷試劑分析性能評估系列指導原則》進行分析評價。

2.2.2 線性 采用全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測標準品梯度稀釋至250、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 IU/ml 制備成的樣本，以濃度值的對數為橫坐標，檢測 RLU 值的對數為縱坐標，進行線性擬合，= 0.9990，表明試劑在 0.05 ~ 250 IU/ml 的范圍內具有很好的線性。

lg (RLU)8 7 6 5 4 3 –2 –1 0 1 2 3 lg (IU/ml)

Figure 3 Dose-response curve of the assay

2.2.3 可報告高限 選取 3 個不同濃度的高值樣本（設為 H1、H2、H3），使用全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行自動稀釋檢測，使自動稀釋后的樣本濃度接近于線性范圍的上 1/3 區(qū)域內，并記錄稀釋倍數。重復檢測高值樣本 3 次，檢測結果如表 1 所示，高濃度樣本采用全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行自動稀釋 400 倍檢測時，還原濃度與理論濃度的偏差（%）為–6.86%，在 ± 10% 范圍內，因此本研究中建立的 HBsAg 定量檢測試劑可采用儀器進行自動稀釋 400 倍檢測，可報告上限為 100 000 IU/ml。

2.2.4 準確度 準確度是衡量定量檢測試劑檢測準確性的一個重要指標，用本研究建立的試劑聯合全自動管式化學發(fā)光免疫檢測儀自動檢測國家參考品，對 8 份國家參考品的檢測結果與理論濃度的相對偏差均在 ± 15% 范圍內，試劑的準確度符合國家標準要求（表 2）。

表 1 可報告高限分析結果

表 2 準確度檢測結果

表 3 試劑對不同亞型的檢測能力分析

2.2.5 試劑對不同 HBsAg 亞型的檢測靈敏度 用本研究制備的試劑采用全自動管式化學發(fā)光免疫分析儀檢測國家參考品中的靈敏度參考品 adr 亞型（0.05、0.1、0.2 IU/ml）、adw 亞型（0.05、0.1、0.2 IU/ml）和 ay 亞型（0.1、0.2、0.4 IU/ml）。結果如表 3 所示，本研究研制試劑對國家參考品中的靈敏度參考品檢測結果均符合國家標準，試劑對不同亞型的檢測性能良好。

2.2.6 試劑精密度 制備 3 批試劑采用全自動管式化學發(fā)光免疫分析儀分別檢測精密度參考品 CV1（0.5 IU/ml）和 CV2（100 IU/ml），每份精密度參考品平行檢測 10 次，計算測定值的平均值和標準差（SD），按照公式CV = SD/平均值 × 100% 計算批內和批間 CV。結果顯示 3 批試劑的批內及批間精密度良好（表 4）。

表 4 試劑精密度評價

2.3 與國際主流產品的比較

對收集的 861 份樣本同時用羅氏公司生產的乙型肝炎病毒表面抗原定量測定試劑盒（電化學發(fā)光法）和本研究的試劑進行檢測，結果如表 5 和圖 4 所示，制備試劑與羅氏檢測結果的陽性符合率為 99.5%、陰性符合率為 99.5%，考核試劑對羅氏的定量相關性值為 0.989，線性擬合斜率為 0.997，接近于 1，截距接近于 0，考核試劑與羅氏試劑檢測結果的定量相關性好。對檢測結果與羅氏試劑不符的樣本采用雅培公司生產的乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒（化學發(fā)光微粒子免疫檢測法）進行檢測確認，結果如表 6 所示，檢測不符樣本均為低濃度樣本，且羅氏、雅培以及本試劑三者之間檢測結果均有一定的差異，可能是不同廠家試劑所用配對抗體的識別表位之間存在差異引起的。

3 討論

自 1965 年第一次發(fā)現 HBsAg 以來，HBsAg 一直作為 HBV 感染的主要標志[8]。而最近的研究則更多的關注于 HBsAg 商業(yè)化定量檢測試劑在 HBsAg 作為生物標志物用于 CHB 病人治療和預后判定中的可靠性[9]。有研究證明，HBeAg 陽性病人在接受 PEG-IFN 治療后，如果 12 周后 HBsAg 定量水平小于 1500 IU/ml，則預警 HBeAg 可發(fā)生血清學轉化，而 HBsAg 濃度大于20 000 IU/ml，則預警患者對治療無應答[10-11]。在接受 PEG-IFN 治療的 HBeAg 陰性患者中，如果 HBsAg 水平無降低且 HBV DNA 下降小于 2 lg IU/ml，則可認為患者對治療無應答，可停止治療[12]。HBsAg定量檢測已被數個國際治療指南推薦用于臨床應用[13]。

表 5 考核試劑與對比試劑檢測結果比較

考核試劑 lg (IU/ml)Examine reagent lg (IU/ml)6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 Roche lg (IU/ml)

Figure 4 Correlation analysis of the assay and Roche

由于 HBsAg 具有眾多突變和亞型，因而 HBsAg 檢測試劑對于不同突變和亞型的檢測能力在很大程度上影響著試劑的整體性能。在試劑建立時，限于單克隆抗體識別表位的單一性，如果采用一株單抗進行包被以捕獲不同的 HBsAg 突變株和不同亞型是不可行的，因而選用多株識別表位不同的單抗共同作為包被原料以最大限度地降低突變株漏檢是最優(yōu)方案。在本研究中是通過大量抗體配對的篩選和抗體配對對 HBsAg 突變株能力的檢測分析，篩選獲得 5 株 HBsAg 抗體用于 HBsAg 定量檢測試劑的建立，其中 Ab-3、Ab-4、Ab-6 和 Ab-8 共同用于磁微粒包被，Ab-1 用于吖啶酯的標記以增加對不同 HBsAg 突變株的捕獲能力。建立的 HBsAg 定量檢測試劑在 0 ~250 IU/ml 濃度范圍內具備很好的劑量反應曲線。通過與同類產品——羅氏公司生產的乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測試劑盒（電化學發(fā)光法）進行同步比較評估對 861 份樣本的檢測能力，發(fā)現與對比試劑相比，考核試劑檢陽性樣本和陰性樣本的符合率均為 99.5%，考核試劑與羅氏試劑的定量相關性值達到 0.989，所研制試劑與羅氏試劑具備很好的一致性。同時評估了試劑對不同 HBsAg 亞型的檢測能力，所研制試劑對國家參考品中的不同亞型靈敏度參考品的檢測均符合國家標準。試劑批內和批間精密度均較好。

表 6 差異樣本分析

本研究所研發(fā)出的 HBsAg 定量檢測試劑具有良好的檢測性能，可以替代國外進口產品在大部分臨床單位使用，為降低醫(yī)療檢測成本，提高我國醫(yī)療器械產業(yè)經濟效益提供重要的技術手段。

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Development and evaluation of a fully-automatic chemiluminescence hepatitis B surface antigen quantification assay

ZHAO Hui, WEN Shun-hua, LI Li-hua, LAI Yan-hui, WENG Zu-xing, SUN Xu-dong

Department of Laboratory, Aviation General Hospital of China Medical University, Beijing 100012, China (ZHAO Hui); Xiamen Innodx Biotech Co. Ltd., Xiamen 361022, China (WEN Shun-hua, LI Li-hua, LAI Yan-hui, WENG Zu-xing, SUN Xu-dong)

Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the most important public health issues in China. HBV surface antigen (HBsAg) is the leading hallmark for diagnosis of HBV infection. In the past few years, quantitative assays for HBsAg detection has been widely used in HBsAg as a biomarker for prognosis and treatment responses in CHB patients. We aim to develop a fully-automatic chemiluminescence assay for HBsAg quantification.In this study, based on our independently developed fully-automatic chemiluminescence system previously, we developed a HBsAg quantification assay through screening of antibodies and optimization of reaction systems, and compared the detection results with Roche, and further evaluated the samples with different subtypes.The assay showed a quantification range of 0 - 250 IU/ml, and matched well with Roche (2= 0.9794). In addition, the assay performed well in detecting the national panel and samples with different subtypes. The assay had a good linearity (= 0.9990) among the range of 0.05 - 250 IU/ml, and the detection results of national reference samples meet the requirement of national standard. The upper-limit of report is 100 000 IU/ml when the samples were diluted by 400 times. The intra-assay accuracy is lower than 10% and inter-assay accuracy is lower than 15%.A fully-automatic chemiluminescence HBsAg assay is developed with potential application.

Hepatitis B surface antigens; Reagent kits, diagnostic; Luminescent measurements

WEN Shun-hua, Email: shunhua.wen@innodx.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.004

溫順華，Email：shunhua.wen@innodx.com

2017-06-06