肺炎鏈球菌蛋白PspC的制備與鑒定

譚亞軍，王麗嬋，衛(wèi)辰，張華捷，侯啟明，張庶民，馬霄

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肺炎鏈球菌蛋白PspC的制備與鑒定

譚亞軍，王麗嬋，衛(wèi)辰，張華捷，侯啟明，張庶民，馬霄

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室/衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室

對肺炎鏈球菌表面蛋白 C（PspC）進行全基因合成、重組表達、純化制備和鑒定。根據(jù) GenBank 中 PspC 的基因序列和氨基酸序列，通過密碼子優(yōu)化和全基因合成的方式獲得目的蛋白基因，構(gòu)建無標簽、高效重組表達菌株，建立重組蛋白的純化制備方法，并進行抗原鑒定及免疫原性檢測分析。人工合成的 PspC 基因序列經(jīng)鑒定與預期一致，目的蛋白在大腸桿菌中獲得了高效表達，表達量在 30% 以上，經(jīng)兩步純化后純度達到 95%。重組蛋白能與肺炎鏈球菌陽性血清產(chǎn)生特異性抗原抗體反應，免疫小鼠后可誘導產(chǎn)生較高水平的蛋白特異性抗體。獲得了重組肺炎鏈球菌蛋白 PspC，其具有與天然抗原相似的抗原性和免疫原性，為今后開展疫苗研制、載體蛋白應用等研究奠定基礎。

肺炎鏈球菌； 重組蛋白質(zhì)類； 肺炎鏈球菌表面蛋白 C

肺炎鏈球菌表面蛋白 C（pneumococcal surface protein C，PspC），也稱為膽堿結(jié)合蛋白 A（choline binding protein A，CbpA），是一個多型蛋白，分子量在 69 ~ 120 kD 之間，具有與肺炎鏈球菌表面蛋白 A（pneumococcal surface protein A，PspA）高度同源的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域。主要由信號肽（37 個氨基酸），α 螺旋區(qū)，脯氨酸富集區(qū)，膽堿結(jié)合區(qū)和C 端尾巴五個區(qū)域組成，其 N 端的 α 螺旋區(qū)在不同的肺炎鏈球菌株中大小和序列都高度可變。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，PspC 可分為 Clade A 和 Clade B 兩種類型，其中 Clade A 序列較長，α 螺旋區(qū)與 PspA 一樣包含 region1 和 region 2 兩個區(qū)域，Clade B 則只包含 region 1 區(qū)域，分離菌株中 Clade B 所占比例可高達 96%[1]，兩者與 PspA 都具有交叉反應。PspC 既是黏附素，又是侵襲蛋白，還可以與補體 C3、人血清因子 H 結(jié)合，幫助細菌免于補體旁路途徑的攻擊。由此可見，PspC 是一個多功能蛋白，在肺炎鏈球菌黏附、入侵和逃避機體補體系統(tǒng)進攻過程中起主要作用[2]。N 端 α 螺旋區(qū)域雖然可變度大，但形成的空間構(gòu)象種類有限，并具有免疫保護作用，試驗結(jié)果顯示 PspC 的 N 端區(qū)能夠大大提高腹腔或者靜脈攻擊動物的存活率[3-11]。因此 PspC 可作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的候選抗原。

本課題根據(jù) GenBank 中 PspC 蛋白的基因序列和氨基酸序列，通過密碼子優(yōu)化和全基因合成的方式獲得目的基因，構(gòu)建無標簽、高效重組表達菌株，并對重組蛋白 PspC 進行了純化方法的建立、抗原鑒定及免疫原性檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備 PTC-100 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產(chǎn)品；HZQ-QX 恒溫氣浴振蕩器為哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；Soniprep150 超聲波細胞破碎儀為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；?KTA Purifier 100 純化儀、ImageMaster VDS 凝膠成像系統(tǒng)為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；Tetra MP4 垂直電泳儀、Trans-Blot SD 半干式電轉(zhuǎn)儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；Spectramax PLUS 酶標儀為美國 Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5α 和 BL21(DE3) 由中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室保存，表達質(zhì)粒 pET-30a 為德國默克 Novagen 公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 Balb/c 小鼠由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，小鼠性別為雌性，6 ~ 8周齡，SPF 級，采用獨立通氣籠具系統(tǒng)飼養(yǎng)。

1.1.4 主要試劑與耗材 Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、IPTG、DNA 分子量標準為日本 Takara 公司產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為美國 Promega 公司產(chǎn)品；蛋白純化用層析柱為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；蛋白分子量標準為美國 Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；PVDF 膜為美國 Millipore 公司產(chǎn)品；OPD、DAB 顯色試劑為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；HRP 標記的羊抗人 IgG 為美國 Santa Cruz 公司產(chǎn)品；瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、SDS、甘氨酸、過硫酸胺、四甲基乙二胺（TEMED）、二硫蘇糖醇（DTT）、硫酸卡那霉素、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽（AEBSF）為美國Amresco公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母粉為英國 Oxoid 公司產(chǎn)品；甘油、氯化鈉、Na2HPO4、NaH2PO4、氯化鉀等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 PspC 基因序列優(yōu)化和全合成 使用codon usage analyzer 對PspC 蛋白的 DNA 序列進行密碼子使用頻數(shù)分析。依據(jù)大腸桿菌的偏愛密碼子，同時考慮 mRNA 翻譯起始區(qū)（translation initiation region，TIR）的二級結(jié)構(gòu)，調(diào)整 G+C% 含量和分布，利用 Gene Designer 軟件進行密碼子優(yōu)化，以提高蛋白表達量；并使用 RNAstructure5.2 軟件分析 TIR 二級結(jié)構(gòu)和自由能，Codonw 在線分析密碼子適應指數(shù)（codon adaption index，CAI）；同時在 5'端引入I 酶切位點（CATATG），3'端I 酶切位點前加入雙終止密碼子（TAATAA），以保證基因序列的無標簽表達。根據(jù)優(yōu)化的核苷酸序列，采用重疊延伸 PCR 技術(shù)進行全基因合成。PspC 的表達基因序列長度為 1365 bp。

1.2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 合成的PspC 基因序列與表達質(zhì)粒 pET30a 經(jīng)I、I 酶切、連接、構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株 BL21(DE3) 中。挑取轉(zhuǎn)化后的單一菌落接種到含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，分別進行 PCR 擴增、雙酶切鑒定及測序以篩選出陽性克隆。

1.2.3 重組蛋白PspC 的誘導表達 取陽性克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)復蘇；按 1:50 轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)至550 nm值達 0.6 ~ 0.8；加入 IPTG 至終濃度 1 mmol/L，37 ℃誘導表達 4 h，以含空載體 pET-30a 的菌株作為陰性對照；離心收集菌體后用 pH 8.9 的 20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液重懸，冰浴中超聲破碎菌體，分別對未超聲菌體、超聲沉淀和上清取樣進行 SDS-PAGE 電泳分析，以分析目的蛋白的表達水平和鑒定蛋白的表達形式。

1.2.4 重組蛋白 PspC 的純化 對重組蛋白進行放大誘導表達和純化制備。收集的菌體用緩沖液 A1（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5）懸浮，冰浴超聲破碎；4 ℃，12 000 r/min離心 30 min，取上清加入硫酸銨至 1 mol/L，進行 Butyl HP 疏水層析，以含 1 ~ 0 mol/L 硫酸銨的緩沖液 A1 梯度洗脫；收集目的洗脫液進行 DEAE FF 離子交換層析，以含 0 ~ 1 mol/L NaCl 的緩沖液 A2（20 mmol/L Tris，pH 9.5）梯度洗脫。分別取少量收集液進行 SDS-PAGE 檢測和純度分析。

1.2.5 重組蛋白 PspC 的鑒定及免疫原性檢測

1.2.5.1 ELISA 檢測 以 3 μg/ml 的純化蛋白每孔 100 μl 包被酶標板，設復孔，4 ℃放置過夜；檢測前洗板6 次，然后以每孔200 μl 加入封閉液，37 ℃封閉 1 h；洗板 3 次后，取稀釋好的肺炎鏈球菌感染患者血清（1:40 稀釋）按每孔 100 μl 加入酶標板中，37 ℃孵育 1 h；洗板 6 次，每孔加入100 μl 辣根過氧化物酶標記的羊抗人 IgG（1:3000 稀釋），37 ℃孵育 1 h；洗板 6 次，每孔加 OPD 底物100 μl，37 ℃靜置 20 min，然后以每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4溶液終止反應；酶標儀在波長 490 nm 讀取檢測數(shù)據(jù)。同時設置 PBS（mmol/L、mmol/L、mmol/LNaHPO、2 mmol/LKHPO作為陰性對照。

1.2.5.2 Western blot 鑒定 重組蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，按照常規(guī)方法進行 Western blot 鑒定，檢測用陽性血清及二抗同1.2.5.1 項，加底物反應液 DAB 顯色，顯色終止后拍攝照片。

1.2.5.3 免疫原性檢測 采用雌性 Balb/c 小鼠（6 ~ 8 周齡），腹部皮下接種稀釋的重組蛋白 5 μg，免疫小鼠 6 只，分別于第 0，14，28 天免疫 3 次，第 35 天采血，分離血清，同時設立陰性對照組。采用間接 ELISA 法檢測 3 針免疫后血清中PspC 蛋白的特異性抗體滴度。將純化后蛋白 3 μg/ml 包被酶標板，待檢血清稀釋至合適倍數(shù)（起始稀釋倍數(shù)為 1:100），以每孔 200 μl 加入酶標板 A 排，以 100 μl 體系對樣品進行系列倍比稀釋，檢測用二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG（1:3000 稀釋），同時以對照血清作為陰性對照。陽性判定的 Cut-off 值為 2.1 × 陰性對照值。

1.2.5.4 與 PspA 蛋白的交叉反應分析 將重組蛋白 PspC 和課題組之前已完成的來自肺炎鏈球菌株 DBL6A、RX1 和 EF3296 的三種蛋白PspA1、PspA2、PspA3 以 3 μg/ml 分別包被酶標板，檢測抗體為1.2.5.3 中的 PspC 免疫小鼠血清，其余操作步驟同1.2.5.1 項。

2 結(jié)果

2.1 PspC 基因序列優(yōu)化和全合成

本研究選擇具有代表性 N 端區(qū)域的 PspC 蛋白，根據(jù)氨基酸序列信息進行優(yōu)化設計所需的模板 DNA，通過避開常用酶切位點，調(diào)整 GC 含量，使優(yōu)化后的基因序列密碼子出現(xiàn)頻率都在 20% 以上，CAI 為 0.74，TIR 自由能為–5.4 kcal/mol。新設計基因 mRNA 的 TIR 穩(wěn)定性有所降低，結(jié)構(gòu)較松散，有利于翻譯效率的提高。采用重疊延伸 PCR 技術(shù)獲得PspC 的全基因合成產(chǎn)物。

2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

PspC 基因片段長度是 1365 bp，其 DNA 產(chǎn)物和 pET-30a 連接構(gòu)建表達質(zhì)粒。以表達質(zhì)粒為模板，采用通用引物進行 PCR 擴增，經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增片段長度與預期大小一致；對表達質(zhì)粒用I 和I 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示插入片段大小與預期一致，結(jié)果見圖 1。篩選出的陽性克隆經(jīng)序列測定后進一步確證了連接的正確性。

bp M 1 bp M 1 750050002500 1000 250A 750050002500 1000 250B

Figure 1 Identification by PCR (A) and enzyme digestion (B) for expression plasmid of PspC protein

2.3 重組蛋白 PspC 的表達結(jié)果

經(jīng)誘導表達條件的摸索，PspC 蛋白在大腸桿菌 BL21(DE3) 中得到了高效表達。電泳掃描分析顯示 PspC 表達條帶的分子量與實際大小（52 kD）有些偏移，與文獻[12-13]報道一致。目的蛋白表達量占菌體總蛋白的 30% 以上。超聲破菌后收集的上清和沉淀經(jīng) SDS-PAGE 分析可見 PspC 重組蛋白，主要存在于超聲裂解上清，以可溶形式表達，結(jié)果見圖 2A。

kD M 1 2 3 4 5 6 9766 43 31 20 14AB

Figure 2 Results of recombination expression and purification analysis (A) and immunoblot identification (B) of PspC protein

2.4 重組蛋白 PspC 的純化結(jié)果

PspC 蛋白以無標簽形式表達，純化難度較大，經(jīng)過對不同純化方法及不同純化條件的一系列摸索，確定了合適的純化方案。PspC 蛋白經(jīng)疏水層析、離子交換層析純化，獲得的目的蛋白純度可達 95%，結(jié)果見圖 2A。

2.5 重組蛋白 PspC 的鑒定及免疫原性檢測

2.5.1 重組蛋白 PspC 的 ELISA 和 Western blot 鑒定結(jié)果 采用肺炎鏈球菌感染患者血清對重組蛋白 PspC 進行 ELISA 檢測，樣品490 nm為 2.003、2.07，陰性對照490 nm為 0.238，結(jié)果為陽性；同時進行 Western blot 鑒定，結(jié)果顯示顯色條帶位置與預期一致（圖 2B）。上述表明PspC 表達產(chǎn)物能與陽性血清發(fā)生特異性的抗原抗體結(jié)合反應，重組蛋白具有良好的抗原特異性。

2.5.2 重組蛋白 PspC 的免疫原性檢測 PspC 重組蛋白免疫小鼠 3 針后，采用間接 ELISA 法檢測動物體內(nèi)的蛋白特異性 IgG 抗體滴度，結(jié)果顯示PspC 蛋白可誘導小鼠產(chǎn)生較高水平的蛋白特異性抗體，滴度在1:1600，1:3200，1:6400，1:12 800的頻數(shù)分別為1，1，3，1，計算幾何平均滴度為 5080，表明重組蛋白具有良好的免疫原性。

2.5.3 與 PspA 蛋白的交叉反應分析 重組蛋白 PspC 和 PspA1、PspA2 、PspA3 蛋白作為包被抗原分別檢測 PspC 免疫小鼠血清，結(jié)果顯示 PspC 與來源于不同分支肺炎鏈球菌的 PspA 蛋白存在不同的交叉反應性，見表 1。

表 1 重組蛋白 PspC 與 PspA 蛋白的交叉反應檢測結(jié)果

3 討論

本研究所表達的目的蛋白 PspC 是一多型蛋白，選擇具有代表性 N 端區(qū)域的PspC 蛋白，根據(jù)氨基酸序列信息進行基因序列優(yōu)化和全合成，獲得了高效表達。這種方法不僅可以免去對肺炎鏈球菌的培養(yǎng)過程，而且目的基因的獲得不受現(xiàn)有菌株的限制，并可以通過基因密碼子的優(yōu)化，提高目的蛋白的表達水平。

為了避免融合標簽對目標蛋白的潛在不利影響，防止應用時對人體存在的潛在威脅，本研究在實驗設計時將終止密碼子添加在融合標簽之前，使表達出的蛋白不帶任何標簽。經(jīng)疏水層析、離子交換層析等多種純化方法聯(lián)合應用和條件優(yōu)化，建立了 PspC 蛋白的純化方法，獲得的無標簽重組蛋白純度可達 95%。ELISA 和 Western blot 鑒定結(jié)果顯示，重組PspC 蛋白能夠與肺炎鏈球菌感染患者血清發(fā)生特異性結(jié)合，說明該蛋白具有良好的抗原特異性。免疫小鼠三針后，可誘導產(chǎn)生較高水平的蛋白特異性抗體，說明其也具有良好的免疫原性，為將來肺炎鏈球菌重組蛋白在疫苗研制、載體蛋白應用等研究方面奠定了基礎。

不同類型的 PspC 與 PspA 因膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源性而具有一定的交叉反應性，本研究通過交叉反應分析得出制備的 PspC 蛋白與不同分支來源的肺炎鏈球菌的 PspA 蛋白存在不同的交叉反應性，其中與源自 DBL6A、RX1 菌株的 PspA 有較強的交叉反應，而與源自 EF3296 菌株的 PspA 沒有交叉反應。說明單獨應用一種 PspC 或 PspA 蛋白可能不能針對不同類型菌株產(chǎn)生足夠的抗體保護性，將其作為疫苗的候選蛋白，可能需要幾種不同類型的蛋白組合才能預防更廣范圍的肺炎鏈球菌感染[14-15]。

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Preparation and identification of recombinant Streptococcus pneumoniae protein PspC

TAN Ya-jun, WANG Li-chan, WEI Chen, ZHANG Hua-jie, HOU Qi-ming, ZHANG Shu-min, MA Xiao

National Institutes for Food and Drug Control, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, Beijing 100050, China

To perform the gene synthesis, recombinant expression, preparation and identification of the Streptococcus pneumoniae protein PspC.The gene of PspC was obtained by chemical synthesis after codons optimization according to the gene sequence and amino acid sequence in the GenBank. The label-free and efficient recombinant expression strain was constructed by molecular biological methods. The purification method of recombinant protein was established. And the protein’s antigen identification and immunogenicity was tested.The synthetic gene sequence of PspC was consistent with the database. The recombinant protein was highly expressed inExpression of the target protein accounted for more than 30% of the total bacterial proteins. After purification by two-step chromatography, the protein purity reached 95%. The protein could react with human serum of clinically diagnosed pneumonia, indicating the protein had good antigenicity. Also high level of specific antibody could be induced after immunization with the protein in mice.The recombinant Streptococcus pneumoniae protein PspC is successfully prepared without label, which had similar antigenicity and immunogenicity as that of natural protein. This research provides foundation for future research on vaccine development and carrier protein application.

Streptococcus pneumoniae; Recombinant proteins; Pneumococcal surface protein C

MA Xiao, Email: maxiao421@sina.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.003

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2012AA02A402）

馬霄，Email：maxiao421@sina.cn

2017-06-09