靶向PLK1 PBD小分子抑制劑熒光偏振高通量篩選模型的建立

陳云雨，繆冬冬，張葉明，劉曉平，張晶

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靶向PLK1 PBD小分子抑制劑熒光偏振高通量篩選模型的建立

陳云雨，繆冬冬，張葉明，劉曉平，張晶

241002 蕪湖，皖南醫(yī)學院藥學院（陳云雨、繆冬冬、張葉明、劉曉平）；130022 長春，中國科學院長春應(yīng)用化學研究所化學生物學實驗室（陳云雨）；100050 北京，中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室（陳云雨、張晶）

建立適用于靶向 PLK1 PBD 小分子抑制劑規(guī)?；Y選的熒光偏振高通量篩選模型。以 pET-28a-PLK1 PBD 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta BL21(DE3)，誘導表達并純化 PLK1 PBD蛋白。利用熒光偏振原理，以 FITC-Poloboxtide 作為分子探針，優(yōu)選分子探針和 PLK1 PBD 最佳工作濃度，建立適用于 PLK1 PBD 小分子抑制劑篩選的熒光偏振高通量篩選模型。同時采用上述建立的熒光偏振篩選模型檢測 poloxin 的抑制活性。成功誘導表達并純化 PLK1 PBD 蛋白。選用 30 nmol/L分子探針和 200 nmol/L PLK1 PBD 蛋白建立熒光偏振高通量篩選模型，其 Z' 因子可達 0.74?；谠摲椒?，檢測 poloxin 的抑制活性，其 IC50值為（4.27 ± 0.69）μmol/L。成功建立了適用于靶向 PLK1 PBD 小分子抑制劑篩選的熒光偏振高通量篩選模型。

熒光偏振免疫測定； 高通量篩選分析； PLK1 PBD 抑制劑

保羅樣激酶-1（polo-like kinase 1，PLK1）是廣泛存在于真核生物中的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。PLK1 主要在細胞有絲分裂的 G2晚期和 M 期表達，在有絲分裂啟動、中心體成熟、紡錘體組裝、染色體整列等細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用[1]。PLK1 在大部分惡性腫瘤細胞中呈過度表達并且與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，被認為是腫瘤分子靶向治療中最具潛力的重要靶標之一[2]。

與 PLK1 功能相反，PLK2 和 PLK3 被認為是重要的抑癌因子，在檢查點導致的周期阻滯中發(fā)揮作用以保證基因組穩(wěn)定性，防止癌變[3-5]。因此，小分子抑制劑對 PLK1 的高度選擇性是靶向 PLK1 治療腫瘤的關(guān)鍵。

PLK1 ~ 3 的結(jié)構(gòu)具有較大的相似性，N 端具有一個高度同源的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD），C 端具有調(diào)節(jié) PLK1 催化活性及亞細胞動態(tài)定位的特征性結(jié)構(gòu)域（polo-box domain，PBD）。由于激酶結(jié)構(gòu)域在眾多激酶結(jié)構(gòu)中的高度保守性及其結(jié)構(gòu)變異導致的耐藥問題，使開發(fā)高選擇性 PLK1 抑制劑面臨極大的挑戰(zhàn)。因此，PLK1 特有的底物結(jié)合域 PBD 成為新型 PLK1 小分子抑制劑開發(fā)的理想靶點[6]。

熒光偏振技術(shù)（fluorescence polarization，F(xiàn)P）在 20 世紀 90 年代中期開始應(yīng)用于藥物的高通量篩選，并且在以蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用為靶點的藥物發(fā)現(xiàn)中展現(xiàn)出無可比擬的應(yīng)用前景[7]。本實驗擬利用熒光偏振技術(shù)原理，建立基于以 FITC-Poloboxtide 作為 PLK1 PBD 結(jié)合配體的熒光偏振高通量篩選模型[8]，為靶向 PLK1 PBD 小分子抑制劑的理性化發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及試劑 pET-28a-PLK1 PBD（326-603 aa）重組質(zhì)粒由本室構(gòu)建；Rosetta BL21(DE3) 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；page rulerTMunstained protein ladder（Cat#26630）、BCATMprotein assay kit 購自美國Thermo Fisher 公司；GelRedTMnucleic acid gel stain（Cat#41003）購自美國Biotium公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉購自英國Oxide公司；誘導劑 IPTG 購自德國Merck公司；HisTrapTMHP 親和層析柱（Cat# 17-5247-01）購自瑞典GE Healthcare公司；FITC-Poloboxtide（FITC-GPMQSpTPLNG-OH，Mw：1583.61，純度> 95%，λex/λem：485/535 nm）由上海強耀生物科技有限公司合成；DMSO 及 poloxin 購自美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 Wallac EnVision 2104 型多功能微孔板檢測儀及 384 孔全黑色不透明微孔板（Cat# 6007270）購自美國PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 PLK1 PBD 蛋白原核表達與分離純化 將質(zhì)粒 pET-28a-PLK1 PBD（326-603 aa）轉(zhuǎn)化宿主菌株Rosetta BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組工程菌。重組工程菌轉(zhuǎn)接于 200 ml 含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，生長至600≈ 0.9 時，加入終濃度0.5 mmol/L 的IPTG，20 ℃誘導 12 h 后，3300 r/min 離心 30 min 收集菌體。將收集的菌體沉淀重懸于 10 ml 裂解液（25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、50 mmol/L 咪唑，pH 7.8）后，置于冰上并以超聲波裂解菌體。待菌體懸液澄清后結(jié)束裂解，4 ℃、10 000 r/min 離心 30 min，收集裂解上清液。上清液以 0.45 μm 濾膜過濾后，以HisTrapTMHP 親和層析柱分離純化，采用梯度咪唑濃度洗脫，分離純化 PLK1 PBD 蛋白。目的蛋白以透析袋法經(jīng)透析液（20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、10% 甘油，pH 8.0）透析后，采用 BCATMprotein assay kit 進行蛋白濃度測定。

1.2.2 FITC-Poloboxtide 工作濃度的優(yōu)選 將2 mmol/L FITC-Poloboxtide 溶液以 FP 反應(yīng)液（50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）進行系列稀釋，使其終濃度分別達到 50、45、40、35、30、25、20、15、10 和5 nmol/L。將上述各濃度的稀釋液以 60 μl/孔依次加入到 384 孔板中，每個濃度設(shè)立 3 組復(fù)孔。以多功能微孔板檢測儀進行millipolarization 單位（mP）檢測。

1.2.3 PLK1 PBD 工作濃度的優(yōu)選 將稀釋后 60 nmol/L FITC-Poloboxtide 溶液以 30 μl/孔依次加入 384 孔板中，同時將 24 μmol/L PLK1 PBD以 FP 反應(yīng)液進行系列稀釋。將各濃度的 PLK1 PBD 稀釋液（500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、25、12.5 和 0 nmol/L）以 30 μl/孔依次加入到含有 FITC-Poloboxtide 的 384 孔板中，每個濃度設(shè)立 3 組復(fù)孔。室溫緩慢振搖，避光孵育 15 min，以多功能微孔板檢測儀進行 mP 檢測，其中 0% 和 100% 抑制時體系最穩(wěn)定的 mP 值之間的范圍是 mP 值的最佳范圍，該 mP 范圍另需滿足 HTS 基本參數(shù)的相關(guān)要求。以 GraphPad Prism5.0 軟件擬合結(jié)合曲線并計算 PLK1 PBD/FITC-Poloboxtide 結(jié)合反應(yīng)的 Kd值，確定 PLK1 PBD 的最佳工作濃度。

1.2.4 DMSO 濃度對篩選模型的影響 DMSO 是小分子化合物在高通量篩選中最常使用的有機溶劑。合理控制并降低 DMSO 濃度對 PLK1 PBD/FITC-Probe 結(jié)合反應(yīng)的影響對于熒光偏振高通量篩選模型的建立及活性化合物的高效、快速發(fā)現(xiàn)是至關(guān)重要的。

FITC-Poloboxtide 和 PLK1 PBD 最佳工作濃度確定后，將含有終濃度為 0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5% 和 20% DMSO 的各反應(yīng)體系（含 30 nmol/L FITC-Poloboxtide 溶液和 200 nmol/L PLK1 PBD）均勻混合后，以 60 μl/孔依次加入 384 孔板中，每個 DMSO 濃度設(shè)立 3 組復(fù)孔。反應(yīng)體系于室溫緩慢振搖孵育 15 min，以多功能微孔板檢測儀進行 mP 檢測。

1.2.5 Poloxin 檢測篩選模型的特異性 Poloxin 是首個報道的 PLK1 PBD 小分子抑制劑[9]，故以其檢測所建立的熒光偏振篩選模型的特異性。將 400 nmol/L PLK1 PBD 溶液以 29 μl/孔依次加入到 384 孔板中，再將 1 μl 以 2 倍倍比稀釋的 poloxin（起始濃度 333.33 μmol/L，設(shè)置 11 個濃度梯度）加入到含有 400 nmol/L PLK1 PBD 的 384 孔板中，同時以加入 1 μl DMSO 作為陽性對照。將上述反應(yīng)體系混勻后于室溫緩慢振搖孵育 45 min 后，再將 60 nmol/L FITC-Poloboxtide 以 30 μl/孔依次加入到含有上述反應(yīng)體系的 384 孔板中，室溫緩慢振搖，避光孵育 15 min。以多功能微孔板檢測儀進行 mP 檢測并以 GraphPad Prism5.0 軟件擬合曲線，計算 poloxin 的 IC50值。

1.2.6 Z' 因子及其他主要技術(shù)參數(shù)的測定 將 30 μl 60 nmol/L FITC-Poloboxtide、30 μl 400 nmol/L PLK1 PBD 和 0.3 μl DMSO 混勻后室溫緩慢振搖，避光孵育 15 min，以多功能微孔板檢測儀進行 mP 檢測并以其作為陰性對照。同時，將 30 μl 60 nmol/L FITC-Poloboxtide、30 μl FP 反應(yīng)液和0.3 μl DMSO 混勻后室溫緩慢振搖，避光孵育15 min，以多功能微孔板檢測儀進行 mP 檢測并以其作為陽性對照。其中，1#~ 30#孔為陰性對照；31#~ 60#孔為陽性對照。以多功能微孔板檢測儀檢測 mP 值并按照 FP 檢測系統(tǒng)的相關(guān)程序進行 Z'因子的自動計算。

另外，根據(jù)參考文獻[10-12]，我們也對本篩選模型的信號本底比（S/B），信號窗（SW）、信噪比（S/N）、信號/本底變異系數(shù)（CV）進行系統(tǒng)測定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用 GraphPad Primer 5 軟件擬合曲線計算 Kd值和 poloxin IC50值，其中 poloxin 抑制率計算公式如下：

抑制率（%）=mP陰性對照– mPpoloxin× 100% mP陰性對照– mP陽性對照

2 結(jié)果

2.1 PLK1 PBD 蛋白原核表達與分離純化

將質(zhì)粒 pET-28a-PLK1 PBD（326-603 aa）轉(zhuǎn)化宿主菌株Rosetta BL21(DE3) 后，以0.5 mmol/L IPTG，20 ℃誘導 12 h，目的蛋白在30 kD 附近有明顯的條帶并大部分以可溶形式表達（圖 1 箭頭處），故本研究選用上述表達條件為最終表達方案。將裂解上清液經(jīng)HisTrapTMHP 親和層析柱分離純化，以咪唑濃度梯度洗脫，樣品進行 SDS-PAGE 電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色后呈單一蛋白條帶，表明已制備出較高純度的 PLK1 PBD 蛋白（圖 1）。純化的蛋白經(jīng)透析后，其濃度達0.85 mg/ml（約 24 μmol/L）。

2.2 FITC-Poloboxtide 工作濃度的確定

隨著 FITC-Poloboxtide 濃度的逐漸升高，mP 值逐漸降低。在 25 ~ 35 nmol/L 時，mP 值趨于穩(wěn)定并始終維持在 11.82 ~ 8.25 之間，具有較低的背景值（圖 2）。所以，在后續(xù) FP 實驗中采用終濃度 30 nmol/L FITC-Poloboxtide 作為其最佳工作濃度。

2.3 PLK1 PBD 工作濃度的確定

隨著 PLK1 PBD 濃度的上升，mP 值逐漸升高。當 PLK1 PBD 濃度達到500 nmol/L 時，mP 值達到最大（mPmax= 198.62）并趨于平臺期（圖 3）。經(jīng) GraphPad Prism 5.0 軟件擬合結(jié)合曲線，計算其結(jié)合反應(yīng)的 Kd值約為 130 nmol/L。為了使其結(jié)合反應(yīng)在 FP 實驗體系中接近飽和狀態(tài)，實際使用的 PLK1 PBD 濃度應(yīng)達到 Kd值的 1.5 倍左右[13]。故此，在后續(xù) FP 實驗中采用終濃度 200 nmol/L PLK1 PBD 作為其最佳工作濃度。

kD 1 2 3 4 5 6 10070 50 40 30 20

Figure 1 Expression and purification of PLK1 PBD

mP75 60 45 30 15 0 10 20 30 40 50 濃度（nmol/L）Concentration (nmol/L)

Figure 2 Optimal FITC-Poloboxtide concentration in FP assay

Figure 3 Optimal PLK1 PBD concentration in FP assay

2.4 DMSO 濃度對熒光偏振篩選模型的影響

DMSO 濃度在 0% ~ 5% 時，mP 值趨于穩(wěn)定并維持在 150 ~ 130 之間，其對 PLK1 PBD/FITC-Poloboxtide 結(jié)合未產(chǎn)生顯著的影響（圖 4）。故此，選用 0.5% DMSO 濃度進行后續(xù)的 FP 高通量篩選是切實可行的。

mP160 120 80 40 0 5 10 15 20 濃度（%）Concentration (%)

Figure 4 Effect of DMSO concentrations on PLK1 PBD/FITC-Poloboxtide binding

2.5 特異性評價

以上述優(yōu)化 FITC-Poloboxtide 和 PLK1 PBD 濃度的 FP 篩選模型進行 poloxin 的抑制實驗，poloxin 的 IC50≈（4.27 ± 0.69）μmol/L（圖 5），其與文獻報道的 IC50值（4.8 ± 1.3）μmol/L 基本一致[9]。這表明所建立的熒光偏振篩選模型具有較好的特異性。

抑制率（%）Inhibition (%)100 75 50 25 0 –0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Poloxin 濃度（μmol/L）的對數(shù)Log[Poloxin(μmol/L) ]

Figure 5 Poloxin inhibitory activity in FP assay

2.6 Z' 因子及其他參數(shù)的測定

通過綜合分析及計算，本篩選模型 Z'因子值約為 0.74，滿足高通量篩選中 Z'因子> 0.5 的基本要求（圖 6）。

mP200 150 100 50 0 30 60 孔次Well sequence

Figure 6 Determination of Z' factor in FP assay

除 Z'因子外，信號本底比（S/B）、信號窗（SW）、信噪比（S/N）、信號/本底變異系數(shù)（CV）四個指標也完全滿足高通量篩選的基本要求（表 1）。

表 1 熒光偏振高通量篩選模型的綜合評價

3 討論

自 1926 年法國物理學家 Perrin 首次提出熒光偏振理論以來，熒光偏振技術(shù)在研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、抗原-抗體相互作用、激素-受體相互作用、免疫分析、蛋白激酶活性及酶動力學及血藥濃度監(jiān)測等基礎(chǔ)科學研究領(lǐng)域和藥物篩選研究領(lǐng)域得到了極大的應(yīng)用與發(fā)展。

熒光偏振技術(shù)主要基于熒光分子的偏振性與其受激發(fā)時熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度密切相關(guān)的原理[6]。當熒光分子受平面偏振光激發(fā)時，如果熒光分子在受激發(fā)時保持靜止狀態(tài)，那么發(fā)射光將位于同樣的偏振平面；如果熒光分子在受激發(fā)時保持旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，那么發(fā)射光將位于與激發(fā)光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激發(fā)熒光素，可以在垂直的和水平的偏振平面檢測發(fā)射光光強（發(fā)射光從垂直平面偏向水平平面的程度與熒光素標記的分子的遷移率有關(guān)）。如果分子量較大，受激發(fā)時熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度較慢，則發(fā)射光偏振程度較高；如果分子量較小，受激發(fā)時熒光分子的旋轉(zhuǎn)速度較快，則發(fā)射光相對于激發(fā)光平面將去偏振化。

相對于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用與蛋白質(zhì)-核酸相互作用的傳統(tǒng)方法，熒光偏振技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，不但避免了放射性同位素的使用和有害的放射性廢物的產(chǎn)生，而且使檢測方法更靈敏、操作流程更快速、篩選成本更低廉。此外，由于熒光偏振技術(shù)在溶液中進行，可以最大程度地模擬真實的生命環(huán)境；熒光偏振技術(shù)也是均相檢測形式（中間不含分離/洗滌步驟）的最佳解決方案，其允許實時跟蹤監(jiān)測分子間結(jié)合/分離的動力學變化，所需樣品量少，重復(fù)性好，且對樣品無破環(huán)性，可以實現(xiàn)大樣本的簡便、快速的高通量篩選與分析[7,14]。

筆者在擬建立熒光偏振高通量篩選模型進行靶向 PLK1 PBD 小分子抑制劑篩選工作之前，曾試圖建立基于熒光免疫吸附法原理的篩選模型進行高通量篩選，但是經(jīng)過反復(fù)嘗試均以失敗告終。探究其根本原因，可能是由于以固相化方式包被 PLK1 PBD 蛋白后導致其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變，使得 PLK1 PBD 與 FITC-Poloboxtide 的空間結(jié)構(gòu)依賴性和磷酸化依賴性的結(jié)合極大地減弱，致使難以檢測到穩(wěn)定熒光信號的產(chǎn)生。所以，在后續(xù)的實驗設(shè)計中，我們建立具有均相檢測和液相反應(yīng)形式的熒光偏振高通量篩選模型來進行靶向 PLK1 PBD 小分子抑制劑的高效、快速篩選。

Z'因子是公認的藥物篩選模型評價中的核心參數(shù)，一般認為 Z'因子大于 0.5 才可用于高通量篩選[10]。根據(jù)上述一系列反應(yīng)條件優(yōu)化，我們所建立的熒光偏振高通量篩選模型的 Z'因子為 0.74，表明該篩選模型具有較好的靈敏性和穩(wěn)定性。在此條件下，poloxin 在本模型中的 IC50約為（4.27 ±0.69）μmol/L，與文獻報道基本一致，也進一步證實了本篩選模型的靈敏性和特異性。故此，本研究所建立的熒光偏振高通量篩選模型符合高通量篩選的基本要求，具有較好的靈敏性、穩(wěn)定性和特異性，對于靶向 PLK1 PBD 小分子抑制劑的規(guī)?；Y選具有重要意義。

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Development of a novel fluorescence polarization-based high-throughput screening method for PLK1 PBD inhibitors

CHEN Yun-yu, MIAO Dong-dong, ZHANG Ye-ming, LIU Xiao-ping, ZHANG Jing

School of Pharmacy, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China (CHEN Yun-yu, MIAO Dong-dong, ZHANG Ye-ming, LIU Xiao-ping); Laboratoty of Chemical Biology, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022, China (CHEN Yun-yu); National Laboratory for Screening New (Microbial) Drugs, Institute of Medicinal Biotechnology, Academy of Chinese Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (CHEN Yun-yu, ZHANG Jing)

To develop a novel fluorescence polarization (FP)-based high throughput screening (HTS) method for PLK1 PBD inhibitors.Rosetta BL21(DE3) competent cells were transformed with pET-28a-PLK1 PBD plasmid. PLK1 PBD proteins were expressed after induction and purified. The HTS assay was based on the fluorescence polarization principle, and FITC-Poloboxtide served as the molecular probe for binding to PLK1 PBD. The FP-based HTS assay was established and optimized using an optimal concentration of FITC-Poloboxtide and PLK1 PBD. Besides, the inhibitory activity of poloxin was measured by this FP assay.PLK1 PBD was successfully expressed and purified. The FP-based HTS assay was performed using 30 nmol/L FITC-Poloboxtide and 200 nmol/L PLK1 PBD, with the Z' factor of 0.74. Furthermore, the IC50value of poloxin was (4.27 ±0.69) μmol/L in this FP assay.A reliable FP-based HTS assay is successfully developed for screening PLK1 PBD inhibitors.

Fluorescence polarization immunoassay; High-throughput screening assays; PLK1 PBD inhibitors

LIU Xiao-ping, Email: liuxiaoping@wnmc.edu.cn; ZHANG Jing, Email: jingjing-506@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.001

國家自然科學基金面上項目（81370087）；吉林省科技發(fā)展計劃（20160520045JH）；皖南醫(yī)學院博士科研啟動基金（rcqd201617）

劉曉平，Email：liuxiaoping@wnmc.edu.cn；張晶，Email：jingjing-506@hotmail.com

2017-08-31