基于微流控芯片的細(xì)菌趨化性檢測(cè)研究進(jìn)展

臧瀟倩 李哲煜 張笑顏 江 雷 任南琪 孫 凱*

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150090)2(中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所, 北京 100101)

評(píng)述與進(jìn)展

基于微流控芯片的細(xì)菌趨化性檢測(cè)研究進(jìn)展

臧瀟倩1李哲煜1張笑顏1江 雷2任南琪1孫 凱*1

1(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150090)2(中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所, 北京 100101)

細(xì)菌趨化性是指有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)梯度產(chǎn)生響應(yīng)，趨向某些化學(xué)誘導(dǎo)劑或避開某些化學(xué)驅(qū)避劑的移動(dòng)行為，是微生物適應(yīng)環(huán)境變化而生存的一種基本屬性。研究細(xì)菌趨化性對(duì)于利用細(xì)菌治理環(huán)境、控制病原菌侵染機(jī)體以及開發(fā)微生物工業(yè)項(xiàng)目等方面都具有重要意義。微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌趨化性的定性與定量檢測(cè)，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，可以更好地對(duì)細(xì)菌的微環(huán)境進(jìn)行控制，有較高的靈敏度。近年來，基于微流控技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌趨化性研究得到了飛速發(fā)展。本文從微流控芯片的結(jié)構(gòu)、工作方式及主要應(yīng)用3個(gè)方面對(duì)近年出現(xiàn)的微流控趨化性檢測(cè)裝置進(jìn)行了介紹和評(píng)述。

微流控； 細(xì)菌； 趨化性； 微環(huán)境； 評(píng)述

2017-04-24收稿；2017-05-18接受

本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.61674046)資助

* E-mail: ksun@hit.edu.cn

1 引 言

在自然環(huán)境中，適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所都有一定的離子濃度和營養(yǎng)成分，細(xì)菌能夠感受周圍環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，并沿著化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度定向運(yùn)動(dòng)，這種性質(zhì)稱為趨化性[1]。細(xì)菌朝著化學(xué)物質(zhì)高濃度的方向運(yùn)動(dòng)，稱為正趨，該化學(xué)物質(zhì)就是引誘劑；反之為負(fù)趨，該化學(xué)物質(zhì)為趨避劑。在大多數(shù)情況下，正趨化物能作為細(xì)菌的碳源和能源，而負(fù)趨化物則對(duì)細(xì)菌有毒害作用。細(xì)菌靠趨化作用趨向有利環(huán)境，避離不良環(huán)境，這樣細(xì)菌就能夠有選擇地吸附到某些藻類、甲殼類或貝殼類等動(dòng)植物的表面得以生存，因而趨化性是細(xì)菌在特定環(huán)境中定居的一個(gè)重要生態(tài)學(xué)因素。細(xì)菌趨化性在諸如原位生物除污、生物膜的形成、感染的發(fā)病機(jī)制、固氮化作用、微生物在地下環(huán)境和土壤中的遷移以及微生物采油等領(lǐng)域的研究中具有重要意義[2]。

傳統(tǒng)研究細(xì)菌趨化性的方法有很多種，每種傳統(tǒng)研究方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)[3]，如毛細(xì)管檢測(cè)法、停留擴(kuò)散室檢測(cè)法、群板檢測(cè)法等方法簡(jiǎn)單易行，且發(fā)展成熟，但只能進(jìn)行趨化性定性分析，而不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)；栓細(xì)胞檢測(cè)法和游動(dòng)細(xì)胞自動(dòng)追蹤檢測(cè)法可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行跟蹤觀察，為細(xì)菌趨化性機(jī)理和理論模型的研究提供了方法，但是栓細(xì)胞檢測(cè)法觀察過程耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的檢測(cè)重復(fù)性差，并且不能對(duì)濃度梯度產(chǎn)生反應(yīng)；而游動(dòng)細(xì)胞自動(dòng)追蹤檢測(cè)法每次只能追蹤一個(gè)細(xì)胞，且需要高度復(fù)雜的數(shù)據(jù)記錄設(shè)備。這也使得利用傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌趨化性進(jìn)行定量分析和對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)進(jìn)行精確表征較難實(shí)現(xiàn)。

近年來，微流控芯片技術(shù)逐漸發(fā)展成熟[4]，憑借分析快速、成本低、消耗低、重現(xiàn)性好、通量高、多功能、集成好并可以在接近生理環(huán)境下運(yùn)行等特點(diǎn)，成為近年來熱點(diǎn)前沿分析技術(shù)之一，為細(xì)菌趨化性的定性及定量研究提供了新的平臺(tái)。

2趨化性微流控芯片的材料選擇和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

根據(jù)使用目的, 可見選擇不同的微流控芯片材料、結(jié)構(gòu)及加工手段。為了將微流控芯片應(yīng)用于細(xì)菌趨化性的研究之中，需要在微流控芯片中形成可控的、穩(wěn)定的、可量化的趨化劑濃度梯度，并且在通道內(nèi)創(chuàng)建適宜微生物生存的微環(huán)境，使微生物保持正常的生理結(jié)構(gòu)與生理機(jī)能，且能夠在環(huán)境中自由運(yùn)動(dòng)。因此，在趨化性研究中，需要根據(jù)所選擇的研究對(duì)象以及所需的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)微流控芯片的通道結(jié)構(gòu)及尺寸進(jìn)行設(shè)計(jì)與加工，使得裝置內(nèi)可以形成所需的流體流動(dòng)狀態(tài)、溶液混合方式、細(xì)菌與趨化劑的接觸方式及各種濃度梯度等。

2.1趨化性微流控芯片的材料選擇

研制微流控芯片的過程中，首先要考慮芯片材料的選取，選取原則大體有下述幾點(diǎn): (1)與工作介質(zhì)之間要有良好的化學(xué)和生物相容性；(2)應(yīng)有很好的電絕緣性和散熱性；(3)應(yīng)具有良好的光學(xué)性能，對(duì)檢測(cè)信號(hào)干擾小或無干擾；(4)表面要具有良好的可修飾性，可產(chǎn)生電滲流或可固載生物大分子；(5)制作工藝簡(jiǎn)單，成本低廉[5]。在利用微流控芯片對(duì)細(xì)菌趨化性進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，除滿足上述幾個(gè)條件外，還要考慮實(shí)驗(yàn)所用菌種與芯片材料之間的相互作用，使細(xì)菌在通道內(nèi)可以保持正常的生理活性，不發(fā)生吸附或粘附，能夠自由運(yùn)動(dòng)。

用于制作微流控芯片的材料主要有石英、玻璃以及有機(jī)高分子聚合物，如熱塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)[6,7]和聚碳酸酯(PC)[8]、熱固型材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)[9]等。石英和玻璃是最早引入的微流控芯片基片材料，具有良好的電滲性質(zhì)和優(yōu)良的光學(xué)特性，表面吸附和表面反應(yīng)能力強(qiáng)，化學(xué)穩(wěn)定性好，因此在細(xì)菌趨化性檢測(cè)時(shí)，常用作芯片的基片材料。PMMA具有良好的透光性、一定的耐沖擊性和耐久性，但是與微生物的相容性差，存在難以進(jìn)行表面修飾的問題，且可變性較強(qiáng)，因此實(shí)驗(yàn)過程中再現(xiàn)性差[6,7]。PC是一種強(qiáng)韌的熱塑性樹脂，具有良好的透光性、耐熱性、耐沖擊性和抗氧化性，在適宜溫度范圍內(nèi)具有良好的機(jī)械性能，但是PC材料耐水解穩(wěn)定性不高，耐磨性差，且易受有機(jī)化學(xué)品侵蝕，因此需要在芯片材料的耐受性范圍內(nèi)選擇實(shí)驗(yàn)條件[8]。PDMS又稱硅橡膠，是目前制作微流控芯片應(yīng)用最多的一種材料。該材料透光度/透氣性好、化學(xué)惰性強(qiáng)、無毒廉價(jià)、韌性好、強(qiáng)度高，且可以通過等離子體氧化直接與自身或其他材料進(jìn)行粘合或鍵合，不需要粘合劑。但PDMS具有疏水性，會(huì)造成通道中積蓄氣泡，通過表面修飾改性能夠解決該問題；PDMS能吸收周圍環(huán)境中的有機(jī)溶劑和小分子物質(zhì)，在用于微生物趨化性實(shí)驗(yàn)時(shí)，通道內(nèi)的生物分子和某些藥物分子會(huì)被PDMS材料吸收，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，因此需要對(duì)其進(jìn)行修飾和改性，如利用硅原子[10]、聚電解質(zhì)多層膜[11]、表面活性劑涂層[12]及磷脂雙層膜[13]等對(duì)PDMS進(jìn)行修飾，以滿足實(shí)驗(yàn)要求[9]。

2.2趨化性微流控芯片的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

用于研究細(xì)菌趨化性的微流控芯片除了要滿足材料、溫度等的要求外，還要考慮到細(xì)菌的生理活動(dòng)特征?；谖⒘骺匦酒募?xì)菌趨化性研究表明，不同生理特性的細(xì)菌所需的實(shí)驗(yàn)條件不同，因此需要對(duì)微流控芯片的結(jié)構(gòu)與通道內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行精確設(shè)計(jì)與調(diào)控[14]。

一方面，細(xì)菌會(huì)向狹小空間或死角聚集，使該區(qū)域的細(xì)菌濃度升高。Park等[15,16]為了探究細(xì)菌在微小結(jié)構(gòu)中的行為，設(shè)計(jì)了一種微結(jié)構(gòu)(圖1A)，中間為250 μm × 250 μm的方形濃縮池，通過40 μm寬的通道與外界相連。實(shí)驗(yàn)時(shí)向芯片內(nèi)通入菌液，使細(xì)菌均勻分布，經(jīng)過一段時(shí)間后，觀察到細(xì)菌會(huì)通過微細(xì)通道聚集到方形濃縮池中。在此基礎(chǔ)上，該研究組又設(shè)計(jì)了一種迷宮結(jié)構(gòu)(圖1B)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌會(huì)在半封閉區(qū)域聚集，從而使菌濃度升高，這是由于細(xì)菌自身生理活動(dòng)分泌出的某些物質(zhì)，可作為細(xì)菌的趨化劑而發(fā)揮作用?？梢姡诶梦⒘骺匦酒M(jìn)行細(xì)菌趨化性實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要考慮到細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的特性，避免通道中出現(xiàn)死角，積存細(xì)菌，或直接利用這一特性在芯片中設(shè)計(jì)濃縮孔，使細(xì)菌聚集，便于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行量化分析，并且有效降低檢測(cè)限。

另一方面，細(xì)菌能夠通過分裂繁殖或者改變自身形態(tài)穿過微米級(jí)通道[17,18]。Mannik等[18]設(shè)計(jì)了含有亞微米級(jí)通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片(圖1C)，微細(xì)通道由6個(gè)腔室分隔開，并且逐級(jí)變細(xì)，通過各級(jí)通道內(nèi)菌的運(yùn)動(dòng)，探究菌的移動(dòng)情況。結(jié)果表明，大腸桿菌在0.4～0.8 μm通道內(nèi)能利用鞭毛進(jìn)行自主運(yùn)動(dòng)，而在小于0.4 μm(小于大腸桿菌直徑)通道內(nèi)，會(huì)通過分裂繁殖或改變自身形態(tài)穿過通道進(jìn)入下一個(gè)腔室，亞微米級(jí)的通道和腔室可以使得細(xì)菌有更加豐富的生理形態(tài)，增加了細(xì)菌形態(tài)的多樣性。因此，在設(shè)計(jì)微流控芯片時(shí)需考慮到細(xì)菌的這一特性，根據(jù)所需的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)通道寬度，保證細(xì)菌在通道的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和活動(dòng)范圍。

圖1 細(xì)菌在微米級(jí)通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況: (A)GFP標(biāo)記的大腸桿菌在芯片內(nèi)分布情況熒光圖像，大腸桿菌通過40 μm寬的微米級(jí)通道進(jìn)入250 μm×250 μm的中央濃縮孔，3 h后孔內(nèi)的菌濃度比外部菌濃度高近7倍[15,16]；(B)左圖為哈維氏弧菌在迷宮結(jié)構(gòu)芯片中培養(yǎng)8 h后的暗場(chǎng)成像，右圖為反應(yīng)菌體內(nèi)部熒光反應(yīng)的光子計(jì)數(shù)成像，表示細(xì)菌高度聚集區(qū)域的活躍群體感應(yīng)現(xiàn)象[15,16]；(C)細(xì)菌在微細(xì)級(jí)通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為，(1)實(shí)驗(yàn)芯片結(jié)構(gòu)圖，(2)細(xì)菌在0.6 μm的通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況，(3)細(xì)菌在1.2 μm寬的通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況[18]。Fig.1 Movement of bacteria in microchannels: (A) Epifluorescence images of green fluorescent protein(GFP)-labeled E. coli in M9 minimal media as they accumulate into a central 250 μm × 250 μm enclosure via a 40-μm-wide channel. After 3 h the density of cells inside is more than seven times greater than outside[15,16]. (B) Dark-field image of V. harveyi after cultivation for 8 hours in the maze. Photon-counting image of the intrinsic luminescence, indicating active quorum sensing in areas where the cells have accumulated at high density[15,16]. (C) Setup for studying bacterial movement in small constrictions. (1) Schematic of the experiment. (2)Time-lapse fluorescent images of bacterial growth in a 0.6 μm wide channel. (3) Time-lapse images of an E. Coli bacterium that swims through a 1.2-μm wide channel[18].

3 用于細(xì)菌趨化性檢測(cè)的微流控裝置

用于研究細(xì)菌趨化性的微流控芯片需要在通道內(nèi)形成一定的濃度梯度，根據(jù)其微流控芯片通道內(nèi)部形成濃度梯度的方式，可以將其分為基于動(dòng)態(tài)流體的微流控裝置(Flow-based microdevice)和基于靜態(tài)擴(kuò)散的微流控裝置(Diffusion-based microdevice)[19]，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。

3.1動(dòng)態(tài)流體微流控裝置

動(dòng)態(tài)流體微流控裝置主要通過設(shè)計(jì)不同構(gòu)型的微通道，利用通道中液體的層流混合建立濃度梯度[19]。其優(yōu)勢(shì)在于可以通過改變芯片微通道構(gòu)造或液體流速等條件，在通道內(nèi)快速形成多種分布形式的穩(wěn)定濃度梯度。

第一個(gè)“T”型通微流控芯片是由Mao等[21]在2003年設(shè)計(jì)并提出的(圖2A)。裝置由兩側(cè)入口分別通入趨化劑和緩沖劑，兩溶液在主通道匯合，基于通道內(nèi)兩層流體間的擴(kuò)散產(chǎn)生濃度梯度，在出口處設(shè)計(jì)了呈扇形對(duì)稱分布的22條回收通道，因此實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌趨化性的定性及定量分析。利用此裝置進(jìn)行了大腸桿菌對(duì)幾種氨基酸的趨化性檢測(cè)，其靈敏度高，檢測(cè)限相比于毛細(xì)管檢測(cè)法低了近3個(gè)數(shù)量級(jí)，作者還通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌對(duì)L-亮氨酸的雙重趨化反應(yīng)。在這款微流控裝置中，趨化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過通道末端22個(gè)回收通道中的相對(duì)菌量測(cè)定的，因此細(xì)菌在通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為會(huì)對(duì)測(cè)量結(jié)果有很大影響，通道內(nèi)流體對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的干擾會(huì)使測(cè)量結(jié)果存在一定的偏差。其次，主通道上游位置的趨化劑濃度梯度最高，沿通道向下會(huì)由于層流液體間的擴(kuò)散作用逐漸降低，使得細(xì)菌的趨向運(yùn)動(dòng)發(fā)生變化，加快液體流速會(huì)減緩擴(kuò)散的發(fā)生，但同時(shí)也會(huì)減小細(xì)菌與趨化劑的接觸和響應(yīng)時(shí)間，影響測(cè)量結(jié)果的精確度。

Lanning等[22]在文獻(xiàn)[20]的三入口平行流通道基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)了一種微流控芯片，裝置也呈“T”型，但只有兩個(gè)入口(圖2B)。細(xì)菌菌液不是作為單獨(dú)的液流通入通道內(nèi)，而是將細(xì)菌加入到緩沖溶液及趨化劑中，從兩個(gè)入口同時(shí)通入芯片，初始階段細(xì)菌沿通道橫向呈均勻分布，沿通道向下，兩液體擴(kuò)散混合產(chǎn)生趨化劑濃度梯度，細(xì)菌的分布會(huì)逐漸發(fā)生變化，不再呈現(xiàn)均勻分布。該研究使用光散射法對(duì)細(xì)菌分布進(jìn)行測(cè)量，將觀察所得的分布結(jié)果與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)方程[23]的數(shù)值解進(jìn)行擬合，得到趨化靈敏度系數(shù)[24]。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在通道內(nèi)充滿液體后停止通入，使液體不再流動(dòng)，只在橫向上發(fā)生擴(kuò)散，取固定位置，觀察細(xì)菌分布隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果表明，0.1～1.0 mm/s的流量不會(huì)影響大腸桿菌在通道內(nèi)的趨化遷移，說明細(xì)菌在通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)是由趨化性而非水力因素或非生物因素引起的。該裝置保證了細(xì)菌初始階段在通道內(nèi)的均勻分布，更加還原了自然環(huán)境條件下細(xì)菌的分布狀況，可用于研究地下水或土壤中細(xì)菌的趨化性行為。

Kim等[25]開發(fā)了一種“Y”字型的微流控芯片(圖2C)，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在于主通道兩側(cè)由箭頭形棘齒結(jié)構(gòu)組成的濃縮孔陣列。3個(gè)入口包括兩側(cè)的趨化劑入口、緩沖劑入口及中間的菌液入口，實(shí)驗(yàn)中主通道內(nèi)會(huì)形成趨化劑的濃度梯度，誘導(dǎo)細(xì)菌從中間向兩側(cè)做偏移運(yùn)動(dòng)，表現(xiàn)出趨化性，并根據(jù)通道兩側(cè)濃縮孔中細(xì)菌濃度量化表征趨化性。濃縮孔的箭頭形棘齒結(jié)構(gòu)有利于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離誘導(dǎo)，使其只能單向移動(dòng)進(jìn)入濃縮孔且不易逸出，可以在濃縮孔中積累細(xì)胞，從而提高了細(xì)菌趨化反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度。這一裝置優(yōu)于其它“Y”型通道的特點(diǎn)在于可以通過分析通道不同距離處濃縮孔內(nèi)的細(xì)菌濃度，對(duì)特定趨化劑條件下化學(xué)受體的靈敏度進(jìn)行定量分析及對(duì)比，空間與時(shí)間兩個(gè)維度上實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌趨化性行為進(jìn)行探究和表征。但由于棘齒型濃縮孔結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)節(jié)加工的要求較高，且容易在濃縮孔中聚集難以排除的氣泡，因此需要在實(shí)驗(yàn)前與實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)芯片進(jìn)行清洗與抽真空處理。

“圣誕樹”型結(jié)構(gòu)[26]是最常見的濃度梯度微流控芯片結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)前端設(shè)置有兩個(gè)入口，分別通入趨化劑溶液與緩沖溶液，通過層層分流與混合后匯入同一條通道，由于層流作用在通道內(nèi)形成濃度梯度。Englert等[27]在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了一種微流控芯片(圖2D)，將“圣誕樹”型通道裝置與“Y”型通道相連接，趨化劑溶液與緩沖溶液同時(shí)通入芯片，流經(jīng)“圣誕樹”型通道形成濃度梯度后，進(jìn)入“Y”型通道內(nèi)，通入“Y”型通道的細(xì)菌直接進(jìn)入到已經(jīng)建立好的濃度梯度溶液中，避免了細(xì)菌突然暴露在高濃度趨化劑下而擾亂其化學(xué)感受器，并且保證細(xì)菌對(duì)趨化劑濃度梯度有足夠的反應(yīng)時(shí)間，從而提高了微流控芯片的檢測(cè)精度。

動(dòng)態(tài)流體微流控裝置需要從外部接入壓力注入設(shè)備，并且會(huì)使細(xì)菌暴露在流體剪切力下，使細(xì)菌除自身運(yùn)動(dòng)外，還受到外部壓力的影響。此外，在流體微流控裝置中，通道內(nèi)的趨化劑濃度梯度分布沿通道向下會(huì)發(fā)生變化，因而細(xì)菌在通道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)也會(huì)受到一定影響。

圖2 動(dòng)態(tài)流體微流控芯片裝置: (A)扇形分布出口的微流控芯片裝置，設(shè)有3個(gè)入口及22個(gè)均勻分布的出口[21]；(B)“T”型通道裝置，設(shè)有兩個(gè)入口分別通入菌液和趨化劑[22]；(C)“Y”型通道裝置，主通道的兩側(cè)設(shè)置有箭頭型棘齒結(jié)構(gòu)濃縮空陣列[25]；(D)“圣誕樹”結(jié)構(gòu)通道裝置，由圣誕樹結(jié)構(gòu)的濃度梯度發(fā)生器和Y型趨化性檢測(cè)區(qū)域組成[27]。Fig.2 Flow-based devices for microfluidic chemotaxis assays: (A) A fan-distribution outlets microfluidic chip device with 3 inlets and 22 outlets[21]; (B) A T-shape device with two inlets for bacteria and attractant[22]; (C) Y-shaped device that combined with arrowhead-shaped ratchet structures beside the main channel[25]; (D) Schematic representation of the μFlow device. The device consists of a gradient-mixing module and a chemotaxis observation module[27].

3.2靜態(tài)擴(kuò)散微流控裝置

靜態(tài)擴(kuò)散微流控裝置克服了動(dòng)態(tài)流體微流控裝置的缺點(diǎn)，它是在靜態(tài)穩(wěn)定的無流體環(huán)境中，建立化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度，細(xì)菌僅依靠自身擴(kuò)散表現(xiàn)趨化性。此設(shè)備可以不依賴于外部壓力設(shè)備， 并且可以保證外部流體對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的影響達(dá)到最小化，但是，擴(kuò)散微流控裝置在對(duì)化學(xué)物質(zhì)濃度梯度分布的控制上靈活性較差。靜態(tài)擴(kuò)散微流控裝置主要是在微流控芯片通道中或通道下方加入多孔介質(zhì)，如水凝膠、瓊脂糖層等，能夠在無液體流動(dòng)的情況下提供穩(wěn)定的趨化劑濃度梯度，此類裝置主要有3種工作方式: 一通道法、兩通道法和三通道法[28]。

一通道法是將趨化劑溶液和緩沖溶液兩平行流體通入通道內(nèi)并穩(wěn)定后，停止流動(dòng)，細(xì)菌處在由停流擴(kuò)散產(chǎn)生的趨化劑濃度梯度下，這種方式只能建立不穩(wěn)定的濃度梯度，維持時(shí)間較短。Seymour等[29]設(shè)計(jì)了一個(gè)兩入口單通道微流控芯片(圖3A)，兩入口分別通入趨化劑和菌液，待液流穩(wěn)定后關(guān)閉注射器泵，由于通道內(nèi)液體為層流狀態(tài)，可認(rèn)為在注射器泵關(guān)閉時(shí)，通道內(nèi)流體立刻停止流動(dòng)，只進(jìn)行靜態(tài)擴(kuò)散，細(xì)菌也會(huì)在趨化作用下進(jìn)行橫向運(yùn)動(dòng)。利用此芯片研究了3種海洋微生物對(duì)多種趨化因子的趨化反應(yīng)，還分析了細(xì)菌群在營養(yǎng)斑塊內(nèi)的移動(dòng)速度，證實(shí)了一些海洋細(xì)菌能夠進(jìn)行快速持續(xù)的趨化反應(yīng)。這一裝置還可實(shí)現(xiàn)兩種分析模式: (1)實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)菌群體數(shù)據(jù)，可以確定實(shí)驗(yàn)過程中的趨化遷移率、解離常數(shù)、趨化敏感性及隨機(jī)運(yùn)動(dòng)系數(shù)；(2)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，可以獲得趨化性行為的運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、移動(dòng)距離及旋轉(zhuǎn)角度的信息。其優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)測(cè)量細(xì)菌分布和運(yùn)動(dòng)軌跡以及趨化劑濃度分布，并且還可以將細(xì)菌運(yùn)動(dòng)及分布情況與趨化劑的濃度分布聯(lián)系起來進(jìn)行測(cè)量與分析。

圖3 靜態(tài)擴(kuò)散微流控芯片裝置: (A)有獨(dú)立菌液入口和趨化劑入口的單通道裝置，(1)結(jié)構(gòu)示意圖，(2)為虛線框內(nèi)的熒光圖像[29]；(B)設(shè)有凝膠通道與觀測(cè)通道的微流控芯片，在觀測(cè)通道內(nèi)無液體流動(dòng)[30]；(C)裝置包含兩條主通道和3條垂直通道，圖中顏色表示不同位置處染色劑的不同濃度，濃度與顏色對(duì)應(yīng)值在右側(cè)圖例標(biāo)出[19]。Fig.3 Diffusion-based devices for microfluidic chemotaxis assays: (A)Single channel microfluidic device with separate inlet for bacterias and for chemotaxis, (1)Schematic of the device,(2)Epifluorescent image of the region in the dashed box[29]; (B)Microfluidic device with agarose gel channel and observation channel where is no flow[30]; (C)Microfluidic device with two main channels and three vertical channels, Colors in the figure represent different concentrations of the dye at different locations in the device, The concentration of the dye corresponds to each color is shown in the legend[19].

兩通道法是通過源通道和匯通道在靜態(tài)流體室內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，將細(xì)胞暴露在穩(wěn)定無液體流動(dòng)的二維濃度梯度下。Si等[30]設(shè)計(jì)的微流控芯片(圖3B)，通道兩端設(shè)有源孔和匯孔，由一條通道連接，源孔一側(cè)的通道是由瓊脂凝膠填充的20條平行通道，稱為瓊脂凝膠通道，在匯孔一側(cè)的通道為細(xì)菌可以自由運(yùn)動(dòng)的觀測(cè)通道。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先向匯孔內(nèi)加入菌液，靜置1 h，使細(xì)菌通過自由擴(kuò)散進(jìn)入到觀測(cè)通道；再向源孔加入所需檢測(cè)的趨化劑溶液，通過擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂凝膠通道和觀測(cè)通道，形成精確的濃度梯度，細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)趨化反應(yīng)。該裝置操作簡(jiǎn)單，可以表征及對(duì)比分析細(xì)菌對(duì)幾種不同趨化劑/驅(qū)避劑的趨化性反應(yīng)，還可篩選趨化性種群類型，實(shí)現(xiàn)對(duì)趨化劑和驅(qū)避劑的快速檢測(cè)和量化分析。Murugesan等[19]設(shè)計(jì)的芯片(圖3C)可在約10 mm寬的通道內(nèi)建立穩(wěn)定的濃度梯度，使趨化性實(shí)現(xiàn)可視化，并大大提高了趨化性的檢測(cè)范圍，作者選用山梨糖醇為趨化劑，硫酸鎳為驅(qū)避劑，分別做了正/負(fù)趨化性實(shí)驗(yàn)，以及雙重趨化劑濃度梯度實(shí)驗(yàn)，與此相比，其它微流控裝置只能在幾微米的寬度內(nèi)建立濃度梯度。在實(shí)驗(yàn)過程中，源/匯通道內(nèi)的流體處于流動(dòng)狀態(tài)，且流體壓力極難平衡，非常容易對(duì)靜態(tài)流體室內(nèi)的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)造成大的干擾，甚至導(dǎo)致細(xì)菌逃逸。

三通道法則通過納米結(jié)構(gòu)膜、凝膠層等多孔材料形成更穩(wěn)定的靜態(tài)流體室，極大地減少了匯/源通道內(nèi)的流體流動(dòng)對(duì)中間檢測(cè)通道的干擾。Weng等[31]設(shè)計(jì)了一款微流控芯片研究尿素對(duì)幽門螺旋桿菌趨化性的影響，該裝置設(shè)有3條微通道，中間通道為靜態(tài)流體室，通過納米結(jié)構(gòu)膜與兩側(cè)的源/匯通道隔開(圖4A)，實(shí)驗(yàn)時(shí)先通入菌液，待菌液充滿通道后封閉出入口，并向兩側(cè)的通道中分別通入緩沖劑和尿素溶液，尿素分子會(huì)透過納米結(jié)構(gòu)膜擴(kuò)散進(jìn)入靜態(tài)流體室，產(chǎn)生濃度梯度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除通過熒光強(qiáng)度進(jìn)行細(xì)菌群體運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)的觀察外，優(yōu)良的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)使檢測(cè)系統(tǒng)捕捉和記錄到了單個(gè)細(xì)菌體的旋轉(zhuǎn)和翻滾行為，并發(fā)現(xiàn)隨尿素濃度梯度增加，幽門螺旋桿菌的運(yùn)動(dòng)速率會(huì)下降。為了方便靈活調(diào)控結(jié)構(gòu)孔徑，Son等[32]開發(fā)了另一種結(jié)構(gòu)方式，即在源/匯通道與細(xì)菌檢測(cè)通道之間設(shè)置PDMS微柱陣列，并通入液體凝膠，待凝膠固化將源/匯通道與檢測(cè)通道隔開(圖4B)，實(shí)驗(yàn)時(shí)先向檢測(cè)通道通入菌液并封住出入口，從而在細(xì)菌檢測(cè)通道形成靜態(tài)流體室。通過這一裝置對(duì)海洋細(xì)菌溶藻弧菌的趨化性行為進(jìn)行了探究，結(jié)果表明，與大腸桿菌不同，溶藻弧菌的趨化性運(yùn)動(dòng)的強(qiáng)弱并非取決于趨化劑濃度梯度，而主要由其運(yùn)動(dòng)速度決定，提出了一種由運(yùn)動(dòng)速度建立起來的新的趨化性運(yùn)動(dòng)模型。Ahmed等[23]構(gòu)建了基于水凝膠的微流控芯片(圖4C)，與上述實(shí)驗(yàn)建立的線性濃度梯度相比，此裝置通過中間通道的特殊構(gòu)型實(shí)現(xiàn)了不隨時(shí)間變化的非線性濃度梯度分布，探究了線性濃度梯度(圖4C(1))和非線性濃度梯度(圖4C(2))兩種模式下的趨化性反應(yīng)，通過實(shí)驗(yàn)得到了大腸桿菌在線性及非線性濃度梯度下的趨化性分布情況，結(jié)果與數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)結(jié)果較為相符。Kim等[33]也利用結(jié)構(gòu)類似的三通道微流控芯片，探究了沙雷氏菌在氧氣或/和核黃素濃度梯度下的趨化性運(yùn)動(dòng)，結(jié)果表明，沙雷氏菌會(huì)趨向高氧濃度或高核黃素濃度的方向運(yùn)動(dòng)；此外，與有氧條件相比，沙雷氏菌在無氧條件下對(duì)核黃素的趨化性趨勢(shì)顯著增強(qiáng)，證明了雙電子受體在沙雷氏菌的趨化性和運(yùn)動(dòng)中的重要性。Zhuang等[34]的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象不是個(gè)體分散的細(xì)菌，而是表面黏附有粘質(zhì)沙雷氏菌的聚苯乙烯顆粒(圖4D)，通過對(duì)細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的微顆粒的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，首次闡明了附著于微結(jié)構(gòu)上細(xì)菌群的合作趨化性的基本作用機(jī)制，結(jié)果表明，不同于單個(gè)細(xì)菌勻速且定向的趨化性運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌驅(qū)動(dòng)微顆粒的運(yùn)動(dòng)速度相對(duì)穩(wěn)定，但運(yùn)動(dòng)方向是不斷變化的。

圖4 靜態(tài)擴(kuò)散微流控芯片裝置: (A)通過納米結(jié)構(gòu)膜分割開3條通道，尿素分子可以穿過膜在檢測(cè)通道形成濃度梯度[31]；(B)芯片制作完成后，通過凝膠入口通入液體凝膠，在源/匯通道與檢測(cè)通道之間形成凝膠層[32]；(C)基于擴(kuò)散的微流控芯片裝置示意圖，可以建立線性濃度梯度(1)和非線性濃度梯度(2)[23]；(D)基于凝膠層的三通道結(jié)構(gòu)，表面附有粘質(zhì)沙雷氏菌的聚苯乙烯顆粒作為研究對(duì)象通入中間的檢測(cè)通道[34]。Fig.4 Diffusion-based devices for microfluidic chemotaxis assays: (A)Three channels was separated by the nanostructured membrane, urea molecules can pass through the membrane and form a concentration gradient in the test channel[31];(B)After the chip was finished, the liquid hydrogel was passed into the inlet and formed a hydrogel layer between the source/sink and the test channel[32];(C)Schematic of a diffusion-based device which can generate gradient for (1) linear and (2) nonlinear gradients[23].；(D)A three-channel microfluidic chip based on hydrogel, the microswimmers that attached by Serratia marcescens bacteria is introduced into the test channel[34].

4 微流控趨化性檢測(cè)的應(yīng)用

研究微生物趨化性對(duì)于控制病原菌侵染機(jī)體、研究細(xì)菌抗藥性、利用細(xì)菌治理環(huán)境以及開發(fā)微生物工業(yè)項(xiàng)目等方面都具有重要的研究?jī)r(jià)值。微流控芯片在細(xì)菌遷移和趨化性研究方面的技術(shù)已逐漸趨于成熟，因此將微流控檢測(cè)法應(yīng)用于趨化性研究，在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域也引起廣泛關(guān)注。

趨化性在微生物的致病機(jī)理中起著重要的作用，很多情況下病原細(xì)菌需要依靠趨化性進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。而在生物醫(yī)學(xué)方面，對(duì)人體內(nèi)特定細(xì)胞的趨化性進(jìn)行研究也有著重要的意義。Butler等[35]開發(fā)了一種簡(jiǎn)單的微流控裝置(圖5A)，探究了人體內(nèi)中性粒細(xì)胞與燒傷細(xì)胞的關(guān)系。裝置由一條主通道和側(cè)面幾條垂直排列的側(cè)向通道構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)中，首先向主通道中通入趨化劑，在壓力作用下趨化劑會(huì)流入側(cè)向通道，待側(cè)向通道內(nèi)充滿趨化劑溶液后停止通入；然后將中性粒細(xì)胞懸浮在緩沖溶液中通入主通道，由于溶液的層流混合擴(kuò)散作用，在側(cè)向通道內(nèi)會(huì)形成趨化劑的濃度梯度，中性粒細(xì)胞則會(huì)在趨化性作用下向側(cè)向通道內(nèi)運(yùn)動(dòng)，根據(jù)側(cè)向通道內(nèi)中性粒細(xì)胞的數(shù)量對(duì)其趨化性進(jìn)行定性及定量分析，可以運(yùn)用該裝置對(duì)潛在性自身免疫性疾病進(jìn)行診斷。

在抗藥性研究方面，可以通過微流控趨化性技術(shù)實(shí)時(shí)觀察跟蹤細(xì)菌的變化，從而更加深入地了解細(xì)菌的抗藥性。Zhang等[36]設(shè)計(jì)了一種可產(chǎn)生濃度梯度的微流控芯片(圖5B)，上側(cè)通道通入細(xì)菌營養(yǎng)液，下側(cè)通道通入細(xì)菌營養(yǎng)液和環(huán)丙沙星(約高于最小抑制濃度200倍)，在兩通道之間形成了環(huán)丙沙星的濃度梯度，將細(xì)菌加入到芯片中間的腔室，在10h時(shí)便在含有環(huán)丙沙星的通道內(nèi)出現(xiàn)了細(xì)菌，即為抗藥性細(xì)菌，結(jié)果表明細(xì)菌在不均勻的環(huán)境條件下會(huì)更快地出現(xiàn)抗藥性。Balaban等[37]用微流控芯片跟蹤了暴露于抗生素的大腸桿菌的生長(zhǎng)，細(xì)菌個(gè)體在抗生素作用下生長(zhǎng)速度慢，但當(dāng)重新通入培養(yǎng)基時(shí)它們也能夠轉(zhuǎn)變到正常狀態(tài)再生長(zhǎng)。Jiang等[38]采用微流控芯片系統(tǒng)(圖5C)對(duì)抗生素敏感細(xì)菌及耐藥性細(xì)菌進(jìn)行了研究，結(jié)果表明無論是耐藥性細(xì)菌還是敏感細(xì)菌，其中生長(zhǎng)速率慢的細(xì)菌都表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗藥性。

圖5 微流控趨化性研究在致病機(jī)理及抗藥性研究中的應(yīng)用: (A)左側(cè)主通道內(nèi)通入中性粒細(xì)胞懸浮液，其中中性粒細(xì)胞在趨化性作用下進(jìn)入右側(cè)的測(cè)向通道[35]；(B)細(xì)菌抗藥性研究芯片簡(jiǎn)圖，中間為細(xì)菌通入腔室，上下邊緣通道為培養(yǎng)基及抗生素流經(jīng)通道[36]；(C)細(xì)菌抗藥性及耐藥性研究芯片裝置，裝置分為4個(gè)主通道，每條主通道兩側(cè)都有小的細(xì)菌培養(yǎng)腔室[38]。Fig.5 Applications in pathogenic and drug resistance of microfluidics-based chemotaxis studies: (A)Microfluidic chip with meutrophils in the main channel[35]; (B)An overview of the microfluidic chip showing the flow of the nutrient streams and the nutrient +Cipro containing streams[36]; (C) Microfluidic chip which can monitor the responses of sensitive and drug resistant strains, including four separated main channels and small chambers on both sides of the channels[38].

此外，微流控趨化性檢測(cè)在環(huán)境中的應(yīng)用也逐漸得到重視，主要包括環(huán)境監(jiān)測(cè)、物質(zhì)的毒性測(cè)試、土壤中或水中的細(xì)菌對(duì)污染物的趨化性等。Buffi等[39]將一種與砷接觸會(huì)發(fā)出綠色熒光的大腸桿菌包裹在瓊脂糖小球中放入微流控芯片(圖6A)，使小球聚集在芯片下游的腔室中，當(dāng)含有砷的水樣通入芯片后，與腔室中小球內(nèi)部的大腸桿菌接觸反應(yīng)，使大腸桿菌發(fā)出綠色熒光，根據(jù)大腸桿菌發(fā)出熒光的強(qiáng)弱可檢測(cè)水中砷的含量，檢測(cè)限可精確到μg/L級(jí)別；Zheng等[40]采用了“圣誕樹”型結(jié)構(gòu)的微流控芯片來探究重金屬毒性(圖6B)，這一裝置是通過圣誕樹結(jié)構(gòu)產(chǎn)生濃度梯度，在下半部趨化性檢測(cè)部分的小室中通入海洋微藻，微藻由于不同濃度的重金屬影響，其運(yùn)動(dòng)行為受到了干擾，最后通過計(jì)算芯片小室中海洋微藻的運(yùn)動(dòng)來檢測(cè)重金屬的毒性。Boehm等[41]開發(fā)了一種可以快速檢測(cè)和識(shí)別細(xì)菌的微流控芯片(圖6C)，該芯片基于電阻抗的方法檢測(cè)細(xì)菌，通過固定的單克隆抗體，成功檢測(cè)出水中濃度為104CFU/mL的大腸桿菌。

圖6 微流控趨化性研究在環(huán)境中的應(yīng)用: (A)將細(xì)菌趨化性用于探究污水中砷含量的微流控芯片[39]；(B)將圣誕樹結(jié)構(gòu)微藻動(dòng)力檢測(cè)微流控芯片應(yīng)用于重金屬毒性檢測(cè)[40]；(C)懸浮細(xì)胞(1)或附著細(xì)胞(2)阻抗式細(xì)胞傳感器應(yīng)用于水中細(xì)菌的快速檢測(cè)[41]。Fig.6 Application of microfluidics-based chemotaxis studies in environment: (A) A microfluidic biosensor for arsenite detection in aqueous samples[39]; (B) Microalgal motility measurement microfluidic chip for toxicity assessment of heavy metals[40]； (C) Schematic drawing of impedance-based bacteria sensor for suspended (1) and attached cells (2)[41].

目前，在環(huán)境領(lǐng)域，微流控芯片的研究主要集中在大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌等常見易培養(yǎng)的細(xì)菌，如果將微流控芯片技術(shù)引入到污水細(xì)菌的研究中，把傳統(tǒng)的搖瓶、孔板或反應(yīng)器轉(zhuǎn)變?yōu)樾〉男酒?，可能?huì)為污水中細(xì)菌的抑制或降解實(shí)驗(yàn)提供一種新的方法，并獲得比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法更多的信息。

5 結(jié) 語

由于微流控裝置的材料和結(jié)構(gòu)靈活多變、易于調(diào)控，且可以根據(jù)檢測(cè)需要選擇合適的工作方式，因此為微生物趨化性檢測(cè)提供了新的方法。但是，在未來的發(fā)展中，仍然需要解決一些瓶頸問題，主要包括: (1)功能單一，目前的研究多數(shù)停留在趨化性檢測(cè)的定性與定量階段，難以實(shí)現(xiàn)有效的混菌篩選。(2)定量分析困難，現(xiàn)有的研究更多集中在趨化劑濃度梯度調(diào)控和和流體剪切力影響，對(duì)于微生物所處微環(huán)境的更多要素缺少調(diào)控。(3)預(yù)處理問題，如何減少預(yù)處理對(duì)微生物活性的影響，尤其是厭氧微生物或者未培養(yǎng)微生物。(4)檢測(cè)手段的局限性，雖然熒光標(biāo)記技術(shù)獲得了快速的發(fā)展，但是相對(duì)種類龐大的微生物家族仍然不足。微流控與電化學(xué)以及拉曼成像技術(shù)的結(jié)合或?qū)⒊蔀榻鉀Q途徑。

隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，趨化性檢測(cè)技術(shù)會(huì)趨于更加便攜可控、形式創(chuàng)新的方向發(fā)展，不僅在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中提供便利，還會(huì)在實(shí)際工程中發(fā)揮重要作用。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.61674046).

AdvanceinBacteriaChemotaxisonMicrofluidicDevices

ZANG Xiao-Qian1, LI Zhe-Yu1, ZHANG Xiao-Yan1, JIANG Lei2, REN Nan-Qi1, SUN Kai*1
1(StateKeyLaboratoryofUrbanWaterResourceandEnvironment,
HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China)
2(TechnicalInstituteofPhysicsandChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China)

Chemotaxis is the response ability of motile cells to chemicals gradients in environment and the migration toward higher concentration of chemoattractant or lower concentration of repellent. This mechanism is a basic nature of microorganisms to adapt to the environmental changes. The research of microbial chemotaxis is of great significance in utilizing bacteria to solve environment problems, control the pathogen infection, and develop microbial industrial projects. Microfluidic devices can realize qualitatively and quantitatively detect of bacterial chemotaxis. In comparison with traditional detect methods, microfluidic assay has an accurate control over bacterial microenvironment, with a higher sensitivity. In the past few years, bacterial chemotaxis study based on microfluidic assay was developed rapidly. In this paper, the microfluidic chemotaxis detectors that appeared in recent years were introduced from the aspect of chip structure, working principle and their applications. Finally, we provided insights into the challenges of bacterial chemotaxis and provided future perspectives.

Macrofluidics; Bacteria; Chemotaxis; Microenvironment; Review

24 April 2017; accepted 18 May 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170259