納米基因擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用

桑付明 李 鑫 劉 佳

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 威海 264209)

納米基因擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用

桑付明*李 鑫 劉 佳

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 威海 264209)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種應(yīng)用廣泛的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，但目前該技術(shù)仍然存在著一些問題，如特異性差、靈敏度低和假陽性等。近年來，隨著納米科技的發(fā)展，一些納米粒子如金屬納米粒子、碳納米材料、量子點(diǎn)和納米金屬氧化物等被引入到PCR反應(yīng)體系中，即納米基因擴(kuò)增技術(shù)(NanoPCR)。該技術(shù)大幅度提高了PCR的擴(kuò)增效率、選擇性、靈敏度和特異性，推動(dòng)了生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文綜述了近年來納米基因擴(kuò)增技術(shù)的主要研究進(jìn)展、反應(yīng)機(jī)理，并探討了其應(yīng)用研究。

納米基因擴(kuò)增技術(shù)； 納米材料； 特異性； 擴(kuò)增效率； 熱啟動(dòng);評述

2017-02-17收稿； 2017-09-04接受

本文系國家自然科學(xué)基金(No. 21407035)、山東省自然科學(xué)基金(No. ZR2014BM021)和威海市大學(xué)共建項(xiàng)目(No. 2014XGJ15)資助

* E-mail: sangfuming@hitwh.edu.cn

1 引 言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是美國的Mullis于1985年提出的可以在體外進(jìn)行特定DNA復(fù)制的技術(shù)[1]。PCR技術(shù)操作簡單省時(shí)，可將微量的目的基因片段在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增到數(shù)百萬倍，已廣泛用于基因克隆[2]、DNA測序[3]、基因分析[4]、基因芯片[5]及法醫(yī)學(xué)[6]等領(lǐng)域。盡管PCR技術(shù)發(fā)展已經(jīng)很成熟，但在實(shí)際操作中，始終存在一些問題，如假陰性、假陽性、產(chǎn)物特異性差、擴(kuò)增效率低甚至不擴(kuò)增，以及富含GC堿基對的DNA很難通過PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物[7]等情況，限制了PCR技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展及其更廣泛的應(yīng)用，因此如何提高PCR技術(shù)的特異性、靈敏度及穩(wěn)定性至關(guān)重要[8]。目前，采用較多的方法是使用PCR增效劑，如二甲亞砜(DMSO)、甘油、甲酰胺和甜菜堿等[9～11]。這些增效劑有利于減少DNA的二級結(jié)構(gòu)并降低GC富集區(qū)的熔點(diǎn)及解鏈溫度，有助于模板完全變性，促進(jìn)模板與引物的特異性結(jié)合，因此在一定程度上提高了PCR的擴(kuò)增效率和特異性，但其擴(kuò)增結(jié)果仍然不理想，未完全解決PCR中存在的上述難題。

近年來，納米材料由于其獨(dú)特的化學(xué)、物理特性，例如大的比表面積、小尺寸效應(yīng)等，受到研究者的廣泛關(guān)注，并逐步滲透到生命領(lǐng)域，推動(dòng)了生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。一些納米材料如納米金[12]、量子點(diǎn)(Quantum dots, QDs)[13]、碳納米管[14]等被應(yīng)用到PCR擴(kuò)增中，形成了納米基因擴(kuò)增技術(shù)(NanoPCR)。該技術(shù)顯著地提高了PCR的特異性、擴(kuò)增效率及靈敏度，并加快了PCR反應(yīng)進(jìn)程，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本文主要從各種納米材料對PCR擴(kuò)增技術(shù)的影響、機(jī)理探討及其應(yīng)用3個(gè)方面分別進(jìn)行概述。

2 納米材料對PCR擴(kuò)增體系的影響

納米材料晶粒極小，比表面積大，因而具有許多特殊的性質(zhì)，如表面效應(yīng)、量子效應(yīng)等，但不同的納米材料又有不同的特性，如水溶性、生物相容性及熱穩(wěn)定性等[15]，因此對PCR體系的影響也不相同。

2.1納米金對PCR體系的影響

Li等[12]首先用檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑制備粒徑為10 nm的納米金，作為PCR增效劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)納米金濃度為0.4～0.8 nmol/L時(shí)，提高了兩輪再擴(kuò)增體系的特異性，明顯抑制了非特異性片段的擴(kuò)增(圖1)。但當(dāng)納米金濃度超過1.0 nmol/L時(shí)，過量的納米金對PCR產(chǎn)生抑制作用。另外，即使在較低的退火溫度(25 ～40℃)下，PCR擴(kuò)增特異性仍然非常高，即納米金拓寬了PCR的退火溫度。隨后，Pan等[16]以多輪PCR為研究體系，發(fā)現(xiàn)加入納米金后，經(jīng)過六輪擴(kuò)增，仍然可得到特異性強(qiáng)的目標(biāo)條帶，而普通PCR體系(未加入納米金)擴(kuò)增到第四輪時(shí)就不能得到目標(biāo)條帶，這進(jìn)一步證實(shí)了納米金可以提高PCR擴(kuò)增的特異性。Vu等[17]以多重PCR為研究體系，研究納米金對PCR擴(kuò)增的影響。他們認(rèn)為納米金不能直接提高PCR特異性，而是更有利于體系中小片段DNA的擴(kuò)增，對大片段DNA的擴(kuò)增起抑制作用；另外，他們推測AuNPs的這種作用源于其良好的表面效應(yīng)而非熱傳導(dǎo)效應(yīng)，且納米金與DNA聚合酶吸附作用更強(qiáng)，導(dǎo)致體系中聚合酶的實(shí)際濃度降低，促進(jìn)了小片段的擴(kuò)增。

Li等[18]研究了0.7 nmol/L 納米金(13 nm)對PCR擴(kuò)增的影響，發(fā)現(xiàn)納米金可以顯著提高PCR擴(kuò)增效率，縮短反應(yīng)時(shí)間。他們對不同的PCR體系、不同DNA聚合酶及不同長度的DNA片段分別進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)對于普通PCR，其靈敏度可以提高5～10倍，而對于實(shí)時(shí)定量PCR，至少可以提高104倍。Li等[18]將納米金的這些作用歸于其良好的熱傳導(dǎo)性，可以有效改善PCR體系的升降溫速率。納米金有助于雙鏈DNA的解鏈，利用這一點(diǎn)，Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，加入納米金可以促進(jìn)高GC模板GNAS1啟動(dòng)子區(qū)域(～84%GC)的擴(kuò)增。Girilal等[20]則從生物合成的角度出發(fā)，用嗜熱脂肪土芽孢桿菌的無細(xì)胞提取物來合成納米金。該方法合成的納米金具有良好的熱傳導(dǎo)效應(yīng)和熱穩(wěn)定性，可以縮短PCR的反應(yīng)時(shí)間，提高其特異性、擴(kuò)增效率。

圖1 納米金(0.4 nmol/L，10 nm)對PCR特異性的影響。λ-DNA為模板，目標(biāo)片段長度283 bp。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。M: maker。泳道1和泳道2：無納米金的PCR結(jié)果；泳道3和泳道4：添加納米金的PCR結(jié)果[12]Fig.1 Effect of gold nanoparticles ( 10-nm AuNPs, 0.4 nmol/L) on the specificity of polymerase chain reaction (PCR).PCR was performed by employing a 283-bp target sequence from a λ-DNA template, and PCR products were analyzed by agarose gel electrophores (1.5%). Lane M is marker; lanes 1 and 2 show the results of PCR performed in the absence of AuNPs; lanes 3 and 4 show the results of PCR performed with AuNPs. bp=base pair[12]

不同表面修飾的納米金與PCR組分的相互作用不同，因而其對PCR的影響也不同。Cao等[21]研究發(fā)現(xiàn)聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子(G5-NH2)可以提高PCR的特異性，隨后Chen等[22]采用氨基末端聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子(G5-NH2)包裹納米金(Au-DENPs)， 并將其應(yīng)用到PCR體系中。研究結(jié)果表明，Au-DENPs能夠有效地提高PCR的特異性及擴(kuò)增效率。當(dāng)Au原子與G5-NH2摩爾比例為100∶1時(shí)，檢出限可達(dá)0.37 nmol/L。作者認(rèn)為包含有納米金的樹形大分子可以保持3D球形形態(tài)，能更好地與PCR組分進(jìn)行相互作用。該課題組[23]還進(jìn)一步探究不同末端聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子(G5-NH2)包裹納米金(Au-DENPs)對于PCR體系的影響，發(fā)現(xiàn)氨基和羥基末端修飾的納米金更加有效，所需濃度最低。

2.2量子點(diǎn)對PCR反應(yīng)的影響

量子點(diǎn)作為一種新型熒光無機(jī)納米材料，具有發(fā)光波長可調(diào)性、發(fā)光效率高和發(fā)光峰窄等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注，例如單分子檢測、細(xì)胞成像、腫瘤靶向和診斷等應(yīng)用[24]。另外，量子點(diǎn)具有優(yōu)異的理化性質(zhì)及生物相容性，被用于PCR擴(kuò)增中，包括硫基乙酸修飾CdTe量子點(diǎn)和硫基乙酸修飾的CdSe以及CdSe/ZnS量子點(diǎn)等[25～27]。

Wang等[25]考察了在不同退火溫度和不同長度模板DNA條件下，羧基修飾的CdTe量子點(diǎn)對PCR體系特異性的影響。通過與納米金結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)可以顯著提高PCR體系的特異性，但當(dāng)CdTe量子點(diǎn)濃度超過最佳濃度時(shí)會產(chǎn)生抑制作用。特別對于短DNA片段，量子點(diǎn)的效果更加顯著。和納米金類似，采用量子點(diǎn)的PCR體系，在退火溫度范圍為30～45℃時(shí)仍可得到特異性強(qiáng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。

Ma等[26]采用硫基乙酸修飾量子點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在低退火溫度下(25～45℃)，仍可大幅度提高PCR體系產(chǎn)率和特異性。通過對不同表面修飾的量子點(diǎn)的研究，他們指出，量子點(diǎn)提高PCR特異性的原因是基于量子點(diǎn)核自身結(jié)構(gòu)與DNA聚合酶作用，而不是其表面狀態(tài)。Liang等[27]以多重PCR為研究模板，采用粒徑4.5 nm的CdTe QDs進(jìn)行研究，證實(shí)QDs可以減少多重PCR體系中非特異性的擴(kuò)增，因而顯著提高擴(kuò)增的特異性，進(jìn)一步證實(shí)了以前的研究結(jié)果。 本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)可以加快PCR的擴(kuò)增速率，將擴(kuò)增時(shí)間由143 min降到46 min[28]。

圖2 基于量子點(diǎn)的熱啟動(dòng)及其與熱啟動(dòng)酶結(jié)果的對比。 PCR體系在50℃下分別預(yù)溫浴不同時(shí)間(0-1 h)； 引物分別為 (A) B9-10； (B) B17-18； (C) A99-100；1.2 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。 M: MW DL2000[29]。Fig.2 Confirmation of hot-start (HS) effects by three pairs of primers with three test models after incubation for different time (0-1 h). (A) B9-10; (B) B17-18; and (C) A99-100. PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis (1.2%). Lane M: MW DL2000[29].

熱啟動(dòng)PCR是實(shí)現(xiàn)可重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)的基因擴(kuò)增的一種非常重要的技術(shù)。該技術(shù)利用各種物理、化學(xué)方法控制PCR反應(yīng)的必須組分，如DNA聚合酶和Mg2+等來影響PCR的進(jìn)行，從而有效的抑制非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成，提高引物和模板結(jié)合的效率。目前應(yīng)用廣泛的是商品化的熱啟動(dòng)酶，但其價(jià)格昂貴，不適合大量實(shí)際樣本的常規(guī)檢測。最近，本課題組發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)可以動(dòng)態(tài)調(diào)控常規(guī)PCR中高保真聚合酶(Pfu酶)的活性，實(shí)現(xiàn)類似“熱啟動(dòng)”的高效DNA體外復(fù)制過程[29]。加入了量子點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系在50℃分別溫育不同時(shí)間(0～1 h)，仍然得到特異性的擴(kuò)增，且結(jié)果可以與商品化的熱啟動(dòng)酶相媲美，而對照(未加量子點(diǎn))實(shí)驗(yàn)則出現(xiàn)了大量非特異性擴(kuò)增片段(如圖2)。

隨后，本研究組將該技術(shù)應(yīng)用于熒光定量PCR，構(gòu)建了基于量子點(diǎn)的高通量熒光定量PCR體系[30]。分別以質(zhì)粒 DNA和PCR 產(chǎn)物為模板，PCR反應(yīng)液在50℃溫育1 h， 即使是在再輪擴(kuò)增體系中，仍得到特異性強(qiáng)的擴(kuò)增(圖3)，而對照實(shí)驗(yàn)得到的都是二聚體以及非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，CdTe量子點(diǎn)對基于高保真聚合酶的PCR體系效果明顯，而普通Taq聚合酶則沒有明顯效果。實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了量子點(diǎn)與普通Taq聚合酶的非特異性吸附相互作用弱于其與高保真聚合酶之間的作用，所以對于普通Taq聚合酶沒有明顯效果。在低溫下量子點(diǎn)和聚合酶結(jié)合從而降低酶的活性，抑制了非特異性片段的擴(kuò)增；在高溫時(shí)，二者分離，聚合酶的活性恢復(fù)，因而量子點(diǎn)起到了很好的熱啟動(dòng)效果。不過考慮到PCR體系的復(fù)雜性，量子點(diǎn)影響PCR的機(jī)理還有待進(jìn)一步的探究。相對于其它熱啟動(dòng)技術(shù), 該技術(shù)具有簡單、成本低、重復(fù)性好、普適性好、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于大量實(shí)際樣品的高通量擴(kuò)增。

2.3碳納米管對PCR反應(yīng)體系的影響

碳納米管具有導(dǎo)電性好、比表面強(qiáng)度高、機(jī)械強(qiáng)度高[31]、韌性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于生物傳感器、DNA納米科技等方面，且該材料具有良好的表面性能和高熱傳導(dǎo)效率，因而碳納米管在PCR擴(kuò)增中也得到較多的應(yīng)用。

Cui等[32]首先提出單壁碳納米管(SWNTS)可以提高PCR的產(chǎn)率，但其濃度超過3 μg/mL時(shí)反而會起抑制作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，即使沒有Mg2+，SWNTS可以替代Mg2+的作用，保證DNA聚合酶的正常催化聚合活性。

為了滿足實(shí)驗(yàn)分析需要，DNA樣品通常需要重復(fù)擴(kuò)增多次。在實(shí)際PCR操作中，也會采用上一輪擴(kuò)增的結(jié)果來作為下一輪擴(kuò)增的模板DNA，因此當(dāng)遇到DNA擴(kuò)增效果不好、產(chǎn)率低的現(xiàn)象，便會導(dǎo)致重復(fù)擴(kuò)增次數(shù)增加，產(chǎn)物特異性降低?；谶@樣的考慮，Zhang等[33]提出碳納米管的懸浮體有助于這樣的重復(fù)PCR擴(kuò)增以及長片段PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)體系加入碳納米管后，PCR進(jìn)行到第六輪擴(kuò)增后仍可得到目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，該粒子還可提高長片段PCR的擴(kuò)增效率。 Zhang等[34]以長度為14.3 kb的長DNA片段作為模板，發(fā)現(xiàn)0.8～1.6 mg/mL多壁碳納米管(MWCNTs)可以提高PCR

圖3 基于量子點(diǎn)的熱啟動(dòng)在實(shí)時(shí)定量PCR中的應(yīng)用。模板為人類基因組的長度為963 bp的PCR產(chǎn)物，熒光染料是EvaGreen，PCR體系在50℃中預(yù)溫育1 h，采用Pfu聚合酶。(A)Pfu擴(kuò)增曲線; (B)Pfu+QDs擴(kuò)增曲線; (C)Pfu標(biāo)準(zhǔn)曲線; (D)Pfu熔解曲線; (E)Pfu+QDs熔解曲線;(F)Pfu+QDs標(biāo)準(zhǔn)曲線; (G)上述結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖(1.2%)。Lane M: MW DL2000[30]。Fig.3 Real time PCR analysis of the second round amplification of a 96.3 bp target from human genomic DNA after 1 h preincubation at 50℃ using the EvaGreen detection system. Pfu DNA polymerase was used as polymerase. (A) Linear amplification data for control without QDs; (B) linear amplification data with QDs; (C) standard curve for control without QDs; (D) melting curve analysis for control without QDs; (E) melting curve analysis with QDs; (F) standard curve with QDs; (G) agarose gel (1.2%) electrophoresis of real time PCR products for different template dilutions. Lane M: MW DL2000[30].

體系的產(chǎn)率和特異性，其最佳濃度為0.8 mg/mL。 另外納米碳粉也對PCR體系產(chǎn)生促進(jìn)作用，并且由于其尺寸和表面性能，濃度不同會產(chǎn)生不同的影響。Quaglio等[35]將MWCNTs與PDMS相結(jié)合，這種復(fù)合納米材料具有良好的熱傳導(dǎo)性和熱穩(wěn)定性，運(yùn)用到PCR體系中提高了PCR的擴(kuò)增效率，整體時(shí)間比之前減少了75%，因此通過改變復(fù)合碳納米管含量，可以更精確的控制生物反應(yīng)的流程效率。

2.4氧化石墨烯與還原石墨烯納米材料對PCR反應(yīng)體系的影響

石墨烯(GO)是碳原子以SP2雜化方式形成的一種單原子層厚度的準(zhǔn)二維的納米材料，具有高比表面積、良好的穩(wěn)定性和生物相容性等，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[36,37]。另外，其還具有良好的傳熱、導(dǎo)電以及與單鏈DNA及蛋白質(zhì)相結(jié)合的特性等，因而廣泛應(yīng)于于PCR擴(kuò)增中[38,39]。

Jia等[37]首先發(fā)現(xiàn)當(dāng)在PCR中添加12 mg/mL～60 mg/mL的GO時(shí)，可以提高 PCR擴(kuò)增的特異性，而GO濃度低于12 mg/mL時(shí)對PCR體系沒有影響，GO濃度高于70 mg/mL時(shí)則會產(chǎn)生抑制作用。還原石墨烯(rGO)對于PCR體系的最佳添加濃度為0.8 mg/mL，在添加濃度超過12 mg/mL時(shí)則會產(chǎn)生明顯的抑制作用。對于多輪PCR的擴(kuò)增，rGO作用更加明顯，經(jīng)過8輪擴(kuò)增后仍然得到特異性的擴(kuò)增，可能由于GO和rGO相比，其負(fù)電位較強(qiáng)，和DNA分子之間的斥力更大，因此效果不如rGO。

石墨烯良好的熱傳導(dǎo)性可以提高PCR的選擇性和特異性。Abdul等[39]研究也證明了GNFs可以提高PCR的導(dǎo)熱系數(shù)，且效果主要取決于GNFs的濃度。當(dāng)加入GNFs過量時(shí)，會起到抑制作用。同時(shí)，粒子的大小也是關(guān)鍵因素，影響其表面積，當(dāng)表面積增大時(shí)，PCR的產(chǎn)率也會提高。實(shí)驗(yàn)通過流體力學(xué)(CFD)模型模擬是否添加GNFs的對照實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果也說明了GNFs優(yōu)良的熱導(dǎo)效應(yīng)是增強(qiáng)PCR效率的主要原因。

2.5金屬氧化物納米材料對PCR體系的影響

TiO2和SiO2等金屬氧化物納米粒子對于PCR體系的影響也比較明顯。Abdul等[40]研究發(fā)現(xiàn)，將粒徑為25 nm的TiO2加入到不同DNA模板來源(如質(zhì)粒DNA，基因DNA，互補(bǔ)DNA)的PCR體系中，擴(kuò)增效率和空白對照組相比高2.9～6.9倍，且通過減少每個(gè)循環(huán)周期的時(shí)間，最終所用時(shí)間是原來的一半，其最佳使用濃度為0.4 nmol/L。TiO2良好的熱傳導(dǎo)效應(yīng)，加速了模板DNA的變性，從而縮短反應(yīng)時(shí)間。Wan等[41]也研究了TiO2在PCR中的作用，并與其它納米材料進(jìn)行比對。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TiO2濃度達(dá)到0.8 μg/mL時(shí)會對體系產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到5 μg/mL時(shí)，反應(yīng)被完全抑制。實(shí)驗(yàn)還證明了當(dāng)TiO2與銀納米粒子結(jié)合時(shí)，其促進(jìn)效果更加顯著。Lenka等[42]分別在普通 PCR、q-PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)中，對粒徑為7 nm的TiO2所產(chǎn)生的作用進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)在普通PCR體系中，0.2 nmol/L TiO2可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA在極低模板濃度下的擴(kuò)增，并且和前人的結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)加入小粒徑的TiO2的PCR產(chǎn)率是大粒徑(25 nm)的3倍甚至更高，但在q-PCR、RT-PCR中，則沒有明顯效果。

Park等[43]將聚多巴胺包覆的SiO2(PDA silica)和碳化的聚多巴胺包覆的SiO2(C-PDA silica)納米粒子分別加入到PCR反應(yīng)體系中，考察它們對PCR體系的作用。研究發(fā)現(xiàn)C-PDA粒子表面可以提供多個(gè)接觸點(diǎn)用來結(jié)合引物和聚合酶，增加了體系穩(wěn)定性，而碳化的聚多巴胺包覆的SiO2效果最突出。由此可見，復(fù)合納米材料可以不同程度改善PCR體系的環(huán)境，使其更有利于反應(yīng)的進(jìn)行。

Ma等[44]認(rèn)為磁性納米粒子具有良好的磁化強(qiáng)度、超順磁性，相對于其它納米材料，其表面更容易功能化，他們對粒徑為8～10 nm的表面修飾了羧基的Fe3O4納米材料進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，其可以提高PCR的靈敏度，檢出測限可達(dá)到4.26 amol/L。

3 納米PCR中納米材料的作用機(jī)理

引物錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增嚴(yán)重影響了PCR擴(kuò)增的靈敏度和特異性，而納米材料通常具有良好的表面性能、熱傳導(dǎo)作用以及與單鏈DNA和蛋白質(zhì)特異性結(jié)合等特性，廣泛地應(yīng)用于納米基因擴(kuò)增中，并極大地提高其擴(kuò)增特異性、靈敏度和產(chǎn)率。但是由于PCR體系自身的復(fù)雜性，目前對于納米PCR的機(jī)理仍然不是很清楚。根據(jù)目前的研究結(jié)果，推測納米材料優(yōu)化PCR主要基于以下兩個(gè)方面。

3.1納米材料的表面作用

納米材料表面積大，表面效應(yīng)強(qiáng)，其作用主要可以分為兩方面：一方面與引物或模板DNA作用，另一方面則是與體系中的聚合酶相互作用。

Li等[45]利用納米金團(tuán)聚所產(chǎn)生的顏色變化設(shè)計(jì)了雜交試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出，納米金對于單鏈DNA(ssDNA)作用更強(qiáng)。Li等[11]也采用納米金進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)論，并提出納米金與單鏈結(jié)合蛋白(SSB)作用類似。首先雙鏈DNA(dsDNA)由于磷酸基團(tuán)暴露在外面，與單鏈DNA(ssDNA)相比，堿基暴露程度小，由于靜電效應(yīng)，納米金更容易與ssDNA結(jié)合。在粒徑1～50 nm范圍內(nèi)，ssDNA相對dsDNA更加柔軟， 易于纏繞在納米金的表面。SSB或者納米金選擇性地結(jié)合ssDNA，阻礙引物和模板的錯(cuò)配，降低了體系錯(cuò)配的可能性，減少了非特異性的擴(kuò)增。

除DNA以外，PCR反應(yīng)體系中還包含蛋白質(zhì)等。 Yi等[46]觀考察了有無羧基化的多壁碳納米管和單壁碳納米管對于PCR體系的影響，研究結(jié)果表明，納米材料會與體系內(nèi)的限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶相互作用，從而降低甚至抑制酶的活性，基于此提出了蛋白質(zhì)和納米材料相互作用機(jī)理。Mi等[47]認(rèn)為納米金可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性，起到類似熱啟動(dòng)PCR 的作用，有效抑制非特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在較低溫度時(shí)，納米金會降低高保真Pfu聚合酶的活性，即使在30～60℃溫育1 h后，仍然可以得到特異性很高的單一目標(biāo)產(chǎn)物。 本研究組的研究也發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)具有類似的熱啟動(dòng)效應(yīng)[29]，初步認(rèn)為這種類似熱啟動(dòng)的效應(yīng)主要源于量子點(diǎn)和高保真聚合酶Pfu的相互作用，使得擴(kuò)增結(jié)果更加準(zhǔn)確可信，此外，還可以減少實(shí)驗(yàn)成本，對于未來研究具有重要意義。

Lou等[48]利用納米金進(jìn)一步驗(yàn)證了以上的結(jié)論，并從PCR作用流程進(jìn)行了深層次探究。首先，他們證明了納米粒子可以作用于體系中的聚合酶，通過良好的表面性能與聚合酶結(jié)合從而改變聚合酶的有效濃度。其次，他們更深入地探究了納米材料對于錯(cuò)配過程的影響， 發(fā)現(xiàn)納米材料的加入會使得錯(cuò)配體系溫度更低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 nmol/L 納米金可以使正反向錯(cuò)配體系的退火溫度降低1.0℃和1.7℃，而完全匹配體系則減少0.3℃和1.0℃，通過增加引物完全匹配和錯(cuò)配之間的退火溫度差增強(qiáng)PCR體系的特異性。 他們還提出了納米材料表面與PCR產(chǎn)物結(jié)合，在變性時(shí)促進(jìn)其分解的機(jī)理。

Bai等[49]采用氨基修飾的二氧化硅磁性納米材料(ASMNPs)對納米PCR反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了更全面的研究。首先，他們認(rèn)為納米材料表面的活性基團(tuán)會結(jié)合PCR中的DNA聚合酶、Mg2+、引物或DNA模板等，所以當(dāng)加入過量時(shí)，會降低反應(yīng)速率，抑制PCR的進(jìn)行。其次，納米材料并不會抑制因錯(cuò)配而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，而是低濃度的納米粒子會抑制長片段的擴(kuò)增，高濃度的納米粒子則會抑制小片段的擴(kuò)增，即納米粒子的表面性能對PCR產(chǎn)生顯著的影響。因此，了解每種納米材料的表面特征，對于優(yōu)化其在PCR上的作用有很大的幫助。

3.2納米材料的熱傳導(dǎo)性

納米材料良好的熱傳導(dǎo)性在PCR體系不同溫度變化的循環(huán)過程中也可能會起到重要的作用。Li等[18]通過改變PCR體系、DNA聚合酶、模板DNA的長度等探究其作用機(jī)理，提出納米材料良好的熱傳導(dǎo)性能，可以有效的改善PCR體系升/降溫速率，從而縮短反應(yīng)時(shí)間，使體系的反應(yīng)效率明顯增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米金可使PCR的靈敏度提高5～10倍，對于q-PCR的靈敏度可以提高104倍。Lin等[50]提出金納米粒子通過提高體系的熱傳導(dǎo)性，來提高熱循環(huán)效率，因而提高PCR體系的特異性和擴(kuò)增效率。納米金促進(jìn)DNA模板解鏈，同時(shí)大幅度提高引物、DNA片段與模板發(fā)生錯(cuò)配的解離速率，縮短了反應(yīng)時(shí)間，從而提高PCR的特異性和效率。Xun等[51]制備了表面修飾mPEG2000的CdSe/ZnS量子點(diǎn)(QD590-mPEG2000)，該量子點(diǎn)可在體系進(jìn)行40個(gè)熱循環(huán)后仍保持穩(wěn)定，熒光信號沒有降低，同時(shí)也保證了該材料在PCR體系中與其它成分的兼容性，作用不會受到影響，進(jìn)一步證實(shí)了納米材料的熱傳導(dǎo)性對于體系的調(diào)節(jié)起到不可忽視的作用。Abdul等[39]證明GNFs可以提高PCR體系的導(dǎo)熱系數(shù)，進(jìn)而提高PCR的擴(kuò)增效率及其特異性，其中GNFs的尺寸大小起到了關(guān)鍵性作用。

4 納米PCR的應(yīng)用及展望

NanoPCR具有高靈敏度、高特異性及高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，目前該技術(shù)在病毒檢測、基因測序中應(yīng)用廣泛。 Ma等[52]利用NanoPCR技術(shù)來檢測和區(qū)分野生型和基因缺失型偽狂犬病病毒(PPV)，從病毒中選取3組引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，分別得到431 bp(gB)、316 bp(gE)和202 bp(gG)3組產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)采用這種純化質(zhì)粒構(gòu)建的帶有特殊基因片段產(chǎn)物，其靈敏度是傳統(tǒng)PCR的100～1000倍。

Cui等[53]利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對豬細(xì)小病毒(PPV)的檢測，對該病毒有良好的靈敏度和選擇性，成功實(shí)現(xiàn)對109份試劑樣品的檢測，對于研究PPV有重要意義，同時(shí)也為研究其它病毒提供了新的思路。

Wang等[54]利用NanoPCR技術(shù)對豬的博卡病毒檢測(PBoV)進(jìn)行檢測，與普通PCR技術(shù)相比，靈敏度為原來的100倍，最低檢測限為6.70×101個(gè)拷貝。而Yuan等[55]則首次利用NanoPCR技術(shù)對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的RNA基因組進(jìn)行檢測，靈敏度是常規(guī)RT-PCR的100倍， PEDV RNA最低檢測限為2.7×10ng/μL，這項(xiàng)研究可以應(yīng)用于臨床診斷和PEDV的現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測。他們還利用這項(xiàng)技術(shù)對鴨坦布蘇病毒(DTMUV)進(jìn)行檢測56]，靈敏度提高了10倍，最低RNA檢測拷貝數(shù)為1.8 ×102/μL。該課題組還進(jìn)行腦心肌炎病毒(EMCV)方面的檢測[57]，在保證體系與樣品中其它病毒無交叉作用條件下，實(shí)現(xiàn)了最低檢測RNA拷貝數(shù)為1.2 ×102/μL，同時(shí)這也是nanoPCR技術(shù)在該病毒研究領(lǐng)域的首次應(yīng)用。而Elhusseini等[58]則采用粒徑為15 nm的納米金加入到PCR體系中，將馬皰疹病毒1型(EHV-1)的檢出限從104～105個(gè)降到102個(gè)DNA拷貝，并改善了原檢測體系出現(xiàn)假陰性的問題。

在人類病毒研究方面，沙門氏菌在很多發(fā)展中國家依舊是對健康有嚴(yán)重威脅的病毒，對于這樣的傷寒類病毒多采用血樣檢測，靈敏度和對病毒的選擇性都有待提高。Rehman等[59]采用磁性納米粒子對PCR技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，降低了基于VNTRs的傷寒桿菌PCR檢測的非特異性，促進(jìn)了該技術(shù)的發(fā)展。

細(xì)菌氣溶膠含量微小，且成分復(fù)雜，其定量檢測一直是難點(diǎn)。Xu等[60]利用TiO2納米粒子結(jié)合銀納米粒子引入PCR中來檢測空氣中的細(xì)菌氣溶膠。通過檢測大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)將兩種納米粒子混合后的效果明顯高于單個(gè)納米粒子，最低檢測濃度可達(dá)到40 pg/μL，靈敏度約為傳統(tǒng)PCR的500倍。

NanoPCR技術(shù)的發(fā)展為生物分子的研究開辟了一個(gè)新的思路和方向，相比傳統(tǒng)PCR技術(shù)，當(dāng)體系中添加入納米材料時(shí)，通過其優(yōu)良的表面性能和熱傳導(dǎo)效應(yīng)，可以有效縮短反應(yīng)時(shí)間，提高擴(kuò)增效率和體系特異性，進(jìn)而提高檢測靈敏度。NanoPCR在實(shí)際研究尤其是在病毒檢測方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義，為人類病毒的研究發(fā)展提供了新的可能，在未來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。另一方面，由于PCR反應(yīng)體系的復(fù)雜性以及納米材料的自身特點(diǎn)等原因，NanoPCR的反應(yīng)機(jī)理仍然不清楚，因此詳實(shí)的探究NanoPCR的反應(yīng)機(jī)理非常重要，而開發(fā)更多無毒高效的納米材料并將其應(yīng)用PCR技術(shù)中是未來重要的研究方向。

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This works was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21407035)

卓立漢光新品推出：Omni-λBright300光纖輸出可調(diào)單色光源

卓立漢光多年專注于光譜儀與高穩(wěn)定光源研發(fā)，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，可提供多種可調(diào)單色光源(其組件包括氙燈、溴鎢燈、氘燈等光源以及光譜儀)，主要用于光、電元器件的表征。典型應(yīng)用如下：光探測器量子效率(QE)測量系統(tǒng)、太陽能電池光電轉(zhuǎn)換效率測量(QE/ IPCE)系統(tǒng)、各類CCD/CMOS 影像器件模組光色標(biāo)定系統(tǒng)等。 承載十年研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，全新推出高性能、高輸出功率的可調(diào)單色光源Omniλ-Bright 系列。

典型應(yīng)用：

PEC光電化學(xué)測試； 透反吸測試系統(tǒng)； 太陽能電池量子效率測試系統(tǒng)； 用于熒光光譜測試系統(tǒng)的激發(fā)光源； 表面光電壓測試； 探測器光譜響應(yīng)度測試系統(tǒng)； 光學(xué)鏡頭透過率測試系統(tǒng)； 防護(hù)眼鏡產(chǎn)品測試系統(tǒng)； CCD/CMOS影像器件模組的光色標(biāo)定。

Omni-λBright 系列可調(diào)單色光源主要由200 mm 焦距影像光譜儀、75W 氙燈光源以及其他配件組成。整個(gè)系統(tǒng)的光學(xué)設(shè)計(jì)經(jīng)過多次優(yōu)化，以保證最佳的分辨率和最大的光通量，同時(shí)又最大強(qiáng)度地抑制了雜散光，提升測量的準(zhǔn)確度, 用戶通過簡單的幾個(gè)步驟就可以快速實(shí)現(xiàn)測試。

FENXIHUAXUECHINESEJOURNALOFANALYTICALCHEMISTRY(月刊，1972年創(chuàng)刊)(Monthly，Started1972)第45卷 第11期 2017年11月Vol．45 No．11 November 2017編 輯主 編主 管主 辦出 版印刷裝訂訂 購國內(nèi)總發(fā)行國外發(fā)行《分析化學(xué)》編委會地址：長春市人民大街5625號郵政編碼：130022電話：0431-85262017http：//www．a(chǎn)nalchem．cnE?mail：fxhx@ciac．a(chǎn)c．cn楊秀榮中國科學(xué)院中國化學(xué)會中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所地址：北京東黃城根北街16號 郵政編碼：100717吉林省保隆冠彩印刷有限公司國內(nèi)：全國各地郵政局吉林省報(bào)刊發(fā)行局中國國際圖書貿(mào)易總公司地址：北京399信箱 郵政編碼 100044EditedbyEditor?in?ChiefSuperintendedbySponsoredbyPublishedbyPrintedbySubscriptionsForeignEditorialBoardofChineseJournalofAnalyticalChemistryAdd:5625RenminStreet,Changchun130022,ChinaTel:0431?85262017http://www.analchem.cnE?mail:fxhx@ciac.ac.cnYANGXiu?RongChineseAcademyofSciencesChineseChemicalSocietyChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciencesSciencePressAdd:16DonghuangchenggenNorthStreet,Beijing100717,ChinaJilinBaolongguancaiPrintingCo.,Ltd.LocalPostOfficesChinaInternationalBookTradingCorporationAdd:P.O.Box399,Beijing100044,China

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DevelopmentofNano-PolymeraseChainReaction
andItsApplication

SANG Fu-Ming*, LI Xin, LIU Jia
(SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnology(Weihai),Weihai264209,China)

Polymerase chain reaction (PCR) has become one of the powerful technique since its invention in 1980s. Nevertheless, PCR technique is still frequently impaired by its low specificity, poor sensitivity, false positive results, etc. Recently, nanomaterials including metal nanoparticles, carbon nanomaterials, quantum dots and nano metal oxide have been added into PCR solution to improve both quality and productivity of PCR. The nanoparticles assisted PCR (NanoPCR) has

considerable attentions due to its unprecedented sensitivity, selectivity and efficiency. In this view, the mainly used nanoparticles in NanoPCR, including gold nanoparticles, quantum dots, carbon nanomaterials, graphene and metallic oxide, was firstly summarized. And then, the possible mechanisms for highly improved sensitivity and selectivity were discussed. Finally, recent applications of NanoPCR were described.

NanoPCR; Nanomaterials; Specificity; Amplification efficiency; Hot-start；Review

17 February 2017; accepted 4 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170097