脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片修復(fù)大鼠腹壁缺損時(shí)耐受感染能力的實(shí)驗(yàn)研究

李玥 廖芝偉 黃琦 周遠(yuǎn)航 湯睿 董建

·論 著·(實(shí)驗(yàn)研究)

脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片修復(fù)大鼠腹壁缺損時(shí)耐受感染能力的實(shí)驗(yàn)研究

李玥 廖芝偉 黃琦 周遠(yuǎn)航 湯睿 董建

目的探討脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)組織補(bǔ)片在污染或感染環(huán)境下一期修補(bǔ)大鼠腹壁缺損時(shí)耐受感染的能力。方法60只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為清潔(A組)、污染(B組)、感染組(C組)3組，每組20只，另設(shè)空白對(duì)照組1只，采用切除全部腹壁肌肉的方式制備腹壁缺損模型，清潔組直接用補(bǔ)片修復(fù)缺損；用大腸稀釋液涂抹補(bǔ)片、腹壁切口制備污染模型，后一期修補(bǔ)缺損；大腸縱向切開0.3 cm形成腸瘺制備感染模型，然后以脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片一期修復(fù)腹壁缺損。術(shù)后7 d、14 d各組分別處死一半大鼠，觀察切口愈合情況、補(bǔ)片感染情況并取補(bǔ)片及周圍組織進(jìn)行病理檢查。結(jié)果A組、B組實(shí)驗(yàn)大鼠均無死亡，C組術(shù)后1周內(nèi)死亡4只，均因腸瘺導(dǎo)致彌漫性腹膜炎，腹腔大量積液死亡。術(shù)后7 d污染、感染組切口感染率顯著高于清潔組(P=0.004)；術(shù)后14 d各組切口愈合情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)觀察顯示術(shù)后7 d污染組炎性反應(yīng)明顯較清潔、污染組嚴(yán)重，而在纖維增生、新生血管形成等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論從耐受感染的角度考慮，脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)組織補(bǔ)片可用于一期修補(bǔ)污染或感染狀態(tài)下腹壁缺損，該補(bǔ)片具有較強(qiáng)的耐受感染能力，其內(nèi)在機(jī)制可能與炎性細(xì)胞容易進(jìn)入補(bǔ)片及早期新生血管形成有關(guān)。

污染； 感染； 腹壁缺損； 脫細(xì)胞基質(zhì)

污染或感染狀態(tài)下腹壁缺損的修復(fù)是外科領(lǐng)域的難題，臨床病種多見，如腹壁、腹膜后巨大腫瘤聯(lián)合消化道臟器切除后腹壁缺損的修復(fù)，開放性腹壁損傷伴有污染或感染時(shí)腹壁缺損的修復(fù)，腹壁疝手術(shù)中分離粘連時(shí)腸管破損，補(bǔ)片修復(fù)后發(fā)生補(bǔ)片相關(guān)感染等情況時(shí)，如何選材、修復(fù)存在諸多爭議。在污染或感染狀態(tài)下的腹壁缺損修復(fù)時(shí)，傳統(tǒng)的觀念是先清創(chuàng)、引流，以后二期修補(bǔ)，但隨著外科材料和外科理念的進(jìn)步，清創(chuàng)后一期修復(fù)成為可能[1-3]。生物補(bǔ)片是目前進(jìn)行一期修復(fù)的首選材料，然而目前生物補(bǔ)片應(yīng)用的病例數(shù)尚不多、隨訪時(shí)間短，對(duì)于復(fù)雜性腹壁缺損的修補(bǔ)效果并不滿意[4]。本研究通過建立大鼠腹壁污染及感染型腹壁缺損的動(dòng)物模型，并應(yīng)用脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)組織補(bǔ)片進(jìn)行一期修復(fù)缺損，為污染或感染狀態(tài)下腹壁缺損的一期修復(fù)提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性大鼠61只，體重190～205 g，平均201 g，由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心按實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件喂養(yǎng)(清潔環(huán)境、溫度20℃、相對(duì)濕度50%～60%、每日12 h白晝和12 h黑夜)。

2. 材料 生物補(bǔ)片為脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)組織補(bǔ)片(由北京清源偉業(yè)生物組織工程科技有限公司制造)。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?建立清潔、污染、感染三組大鼠腹壁缺損模型，應(yīng)用脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)組織補(bǔ)片一期修復(fù)腹壁缺損，檢驗(yàn)修補(bǔ)效果及其機(jī)體內(nèi)的感染耐受性，通過對(duì)照研究，比較清潔、污染、感染狀態(tài)下生物補(bǔ)片修補(bǔ)效果，并通過病理學(xué)檢查，明確其在機(jī)體感染組織中的生理學(xué)變化。

2.實(shí)驗(yàn)分組 將61只入組實(shí)驗(yàn)大鼠由1～61編號(hào)并記錄，根據(jù)腹部缺損模型分為3組：清潔組(A組)、污染組(B組)、感染組(C組)，每組20只,分別編號(hào)為A1～A20、B1～B20、C1～C20。清潔組指腹壁缺損無消化液等污染者，本研究切除腹壁肌肉后直接行補(bǔ)片修補(bǔ)制備清潔組模型；污染組指腹壁缺損有消化液污染者，本研究用大腸液稀釋后涂抹腹壁缺損周圍組織與補(bǔ)片制備污染模型；感染組指?jìng)谝迅腥菊?，本研究將大鼠腸管部分切開引起急性腹膜炎制備污染模型。各組大鼠在體重、術(shù)前體溫等各方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另設(shè)空白對(duì)照大鼠(不作任何手術(shù)處理)一只。

3.實(shí)驗(yàn)方法 手術(shù)按照A1、B1、C1，A2、B2、C2……A20、B20、C20的次序進(jìn)行。脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)組織補(bǔ)片預(yù)先裁剪成大小1.5 cm×1.5 cm的正方形，并浸泡在生理鹽水中備用。術(shù)前大鼠禁食、禁水12 h，水合氯醛1.5～2 ml大鼠腹腔注射麻醉，術(shù)中根據(jù)麻醉效果加量。麻醉生效后，將大鼠仰臥固定在手術(shù)板上，剃毛刀剔除腹壁手術(shù)野發(fā)毛，聚維酮碘(碘伏)消毒，鋪無菌洞巾。取中腹部正中切口，分離皮膚與肌肉之間的間隙，于下腹正中切除1.5 cm×1.5 cm腹壁(包括腹膜、肌肉、筋膜組織)制成腹壁缺損。清潔組直接用1.5 cm×1.5 cm生物補(bǔ)片修補(bǔ)缺損；污染組抽取1 ml大腸液和1 ml生理鹽水稀釋后涂抹于切口周圍腹壁及補(bǔ)片，后一期修補(bǔ)缺損；感染組縱行切開大腸壁3 mm制備腸瘺腹腔感染模型，并用腸液涂抹于切口周圍腹壁及補(bǔ)片，然后用生物補(bǔ)片一期修復(fù)腹壁缺損。采用橋接方法置入生物補(bǔ)片，因補(bǔ)片具備一定的伸展性，補(bǔ)片與腹壁缺損邊緣腹壁重疊約0.2 cm，以1號(hào)絲線固定于腹壁缺損處肌肉邊緣，間斷縫合共8針。皮膚間斷縫合3針。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，觀察動(dòng)物每日活動(dòng)及進(jìn)食情況，檢測(cè)動(dòng)物體溫、體重，分別觀察切口愈合情況，有無腹壁隆起、腹壁疝發(fā)生。術(shù)后7 d、14 d分別由各組隨機(jī)抽取一半實(shí)驗(yàn)大鼠，眼角取血化驗(yàn)大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等指標(biāo)，再次手術(shù)解剖觀察補(bǔ)片與腹腔粘連情況，切取補(bǔ)片及其周圍約0.5 cm的腹壁組織進(jìn)行組織學(xué)觀察及免疫組化檢測(cè)，術(shù)后頸椎脫臼處死。

4.觀察指標(biāo) ①一般情況：有無實(shí)驗(yàn)大鼠死亡、進(jìn)食情況、體溫、體重變化，有無腹壁疝發(fā)生。②傷口愈合情況，術(shù)后7 d、14 d觀察傷口愈合情況，分為三級(jí)：甲級(jí)愈合，無紅腫滲出，無潰破；乙級(jí)愈合，傷口紅腫，少量分泌物，無潰破；丙級(jí)愈合，大量分泌物，潰破。③取補(bǔ)片及其周圍部分腹壁組織，HE染色光鏡下觀察補(bǔ)片植入后局部病理反應(yīng)情況，免疫組化CD31染色觀察新生血管生成情況。運(yùn)用半定量評(píng)分系統(tǒng)[5](表1)對(duì)補(bǔ)片周圍組織的纖維增生、周圍炎癥反應(yīng)和新生血管情況進(jìn)行評(píng)估。各項(xiàng)指標(biāo)的觀察根據(jù)雙盲原則，由未參與手術(shù)的第三者來評(píng)估記錄。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、術(shù)后一般情況

術(shù)后5、6 h大鼠恢復(fù)進(jìn)食進(jìn)水，術(shù)后早期大鼠活動(dòng)受限，排便正常，無麻醉過量死亡。清潔組及污染組術(shù)后無死亡，空白對(duì)照大鼠存活，感染組有4只大鼠死亡。其中1只于術(shù)后當(dāng)天死亡，2只于術(shù)后第1天死亡，1只于術(shù)后第3天死亡，解剖發(fā)現(xiàn)死亡原因均為腹腔大量積液(糞汁樣腹膜炎)。三組存活的大鼠分別為A組20只、B組20只、C組16只，存活大鼠腹壁缺損均得到完整修補(bǔ)，各組均未出現(xiàn)腹部膨隆、腹壁疝。三組大鼠術(shù)后平均體溫變化、WBC、CRP等均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組大鼠體重變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、傷口愈合情況

術(shù)后7 d及14 d各組傷口愈合情況見表2。術(shù)后7 d三組間切口愈合情況有顯著差異，P=0.02，但是由于最小期望值為2.29，而且有6個(gè)格點(diǎn)的期望值小于5，此結(jié)果不可信。將乙級(jí)和丙級(jí)愈合合并后進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，三組間甲級(jí)愈合率有顯著差異，清潔組傷口甲級(jí)愈合率顯著高于污染組及感染組(圖1)(P=0.004)。術(shù)后14 d污染組及感染組的傷口均自行愈合(圖2)，三組切口愈合情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.54)。

表2 各組術(shù)后7 d及14 d切口愈合情況(只)

三、病理學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后7 d及14 d分別解剖觀察并行病理組織學(xué)檢查，三組大鼠補(bǔ)片周圍組織纖維增生、炎癥反應(yīng)和新生血管半定量評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。術(shù)后7 d清潔組補(bǔ)片周圍組織少量炎性細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)較輕，污染和感染組炎癥反應(yīng)較重，甚至有局部小膿腫形成(圖3)；至術(shù)后14 d各組炎癥反應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。術(shù)后各組在纖維增生、新生血管生成(圖4)方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

討 論

污染或感染狀態(tài)下腹壁缺損的修復(fù)是外科領(lǐng)域的難題，生物相容性良好的聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯以及防粘連復(fù)合材料等高分子合成補(bǔ)片的問世，使巨大腹壁缺損的一期修復(fù)成為可能，并且顯著降低了術(shù)后復(fù)發(fā)率[6]。但在手術(shù)區(qū)域處于污染或感染狀態(tài)時(shí)，選用上述修復(fù)材料則可能發(fā)生感染、竇道、腸瘺等并發(fā)癥，術(shù)后感染是污染和感染腹壁缺損一期修補(bǔ)手術(shù)失敗的重要原因之一，提高修補(bǔ)材料耐受感染的能力成為手術(shù)成功的關(guān)鍵之一。

表1 組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表3 各組術(shù)后7 d及14 d組織學(xué)評(píng)分情況(分)

脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片[7-8]是人尸源性或動(dòng)物組織經(jīng)脫細(xì)胞、消毒殺菌、化學(xué)交聯(lián)等處理形成的脫細(xì)胞基質(zhì)，含有結(jié)構(gòu)性和功能性蛋白的生物補(bǔ)片植入人體后，作為支架誘導(dǎo)修補(bǔ)部位細(xì)胞和組織長入，補(bǔ)片自身逐漸完全被吸收，并最終被人體新生組織代替。與不可吸收高分子材料補(bǔ)片相比，生物補(bǔ)片生物相容性好且最終可吸收不留異物，理論上可以改善組織對(duì)污染和感染的耐受力。為進(jìn)一步驗(yàn)證脫細(xì)胞基質(zhì)補(bǔ)片耐受感染能力，本研究采用北京清源偉業(yè)生物科技工程有限公司生產(chǎn)的瑞諾脫細(xì)胞組織補(bǔ)片一期修復(fù)污染和感染狀態(tài)下大鼠腹壁缺損，與清潔狀態(tài)腹壁缺損作對(duì)照，比較清潔與污染或感染狀態(tài)下切口愈合情況，并通過病理學(xué)檢查，進(jìn)一步探討生物補(bǔ)片耐受感染的可能機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果除感染組有4只大鼠因腸瘺腹腔感染死亡外，其余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口均良好愈合，無腹壁疝發(fā)生，術(shù)后7 d污染+感染組切口感染率顯著高于清潔組，但無嚴(yán)重潰爛流膿等現(xiàn)象，無需去除補(bǔ)片，至術(shù)后14 d，污染+感染組89%的大鼠達(dá)到切口甲級(jí)愈合，與清潔組無顯著差異。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7 d污染、感染組切口及補(bǔ)片周圍出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，甚至出現(xiàn)局部微膿腫，清潔組炎癥反應(yīng)較輕，各組間炎癥反應(yīng)有顯著差異，而在纖維增生和新生血管形成等方面無明顯差異。通過組織學(xué)檢查進(jìn)一步證實(shí)術(shù)后7 d污染、感染組腹壁感染的存在，而到了術(shù)后14 d腹壁感染已經(jīng)自行好轉(zhuǎn)，各組間炎癥反應(yīng)并無顯著差異，切口基本達(dá)到甲級(jí)愈合標(biāo)準(zhǔn)，說明脫細(xì)胞基質(zhì)生物補(bǔ)片能夠耐受腹壁感染，而不影響最終愈合。

關(guān)于脫細(xì)胞基質(zhì)耐受感染的機(jī)制，我們認(rèn)為與其自身特質(zhì)密切相關(guān)。該補(bǔ)片將取自同種異體的片狀或膜狀組織通過生物學(xué)和化學(xué)的方法處理，完全脫除各種可被宿主識(shí)別為外來成分的細(xì)胞，而完整地保留了細(xì)胞外基質(zhì)成分和三維框架結(jié)構(gòu)，植入后，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞遷徙、黏附、分裂和增殖，利用宿主自身的細(xì)胞逐漸完成組織重建和血管再生，宿主細(xì)胞分泌的膠原最終替代脫細(xì)胞基質(zhì)(ACTM)，從而完成對(duì)組織缺損的修復(fù)和重建[9]。本研究證明，在術(shù)后7 d時(shí)補(bǔ)片內(nèi)就有新生血管生成，至術(shù)后14 d已經(jīng)有中等量的新生血管形成，快速的血管化過程可增強(qiáng)抗感染特性。楊碩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，具有微孔結(jié)構(gòu)的補(bǔ)片，新生血管更容易長入，炎性細(xì)胞游走更為廣泛，成纖維細(xì)胞聚集更為明顯，可以盡快于感染灶周圍形成抗菌環(huán)境，局部感染造成的炎癥刺激因子更容易被清除，這與本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果相符。

本研究證實(shí)，從耐受感染的角度考慮，脫細(xì)胞基質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以在腹壁污染或感染情況下提供有效的修補(bǔ)，為污染或感染狀態(tài)下腹壁缺損的一期修復(fù)提供了更好的選擇。臨床中一些學(xué)者已經(jīng)開始將脫細(xì)胞基質(zhì)用于復(fù)雜性、感染性腹壁缺損的治療，并取得了較滿意的效果。但是，污染和感染腹壁缺損的修復(fù)是一個(gè)比較復(fù)雜的問題，術(shù)后遠(yuǎn)期腹壁膨出就是另一個(gè)臨床中遇到的棘手問題[11]，其遠(yuǎn)期治療效果有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

(本文圖1～4見封四)

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Experimentalassessmentoftheresistanceofacellulartissuematrixmeshagainstinfectionforinfectedorcontaminatedabdominalwalldefectinrats

LiYue*,LiaoZhiwei,HuangQi,ZhouYuanhang,TangRui,DongJian.

*DepartmentofGeneralSurgery,BaoshanBranchofHuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200431,China

LiaoZhiwei,Email:rhyylzw@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the resistance of human acellular tissue matrix mesh against infection for infected or contaminated abdominal wall defect in rats.MethodsA total of 61 rats were randomly divided into clean group (group A,n=20), contaminated group (group B,n=20) and infected group (group C,n=20). All rats underwent total abdominal wall muscle resection to make the abdominal wall defect model. Additionally, in group B, we used Escherichia coli intestinal juice to contaminate the abdominal wall and patches, and in group C, the colon was incised longitudinally for 0.3 cm to establish infected model. The abdominal defect was then closed with acellular tissue matrix. The healing process of abdominal incision, and the mesh infection state were observed on the day 7 and day 14 after operation, and the specimens were obtained for pathological examination.ResultsFour rats died during the first 7 days from diffused peritonitis in group C, and no deaths occurred in group A and group B. Seven days after operation, the wound infection rate was significantly higher in groups B and C than in group A (P=0.004), but on the day 14, there was no statistically significant difference among three groups. Pathological examination suggested that the score of inflammatory reaction was higher in group C 7 days after operation, and the scores of proliferating fibroblasts and revascularization showed no significant difference among three groups.ConclusionsIn terms of the resistance against infection, the acellular tissue matrix mesh was feasible for primary closure of contaminated and infected abdominal wall defects. The potential mechanism may include superior inflammatory cell migration and rapid neovascularization.

Contamination; Infection; Abdominal defect; Acellular tissue matrix

上海市寶山區(qū)科委基金項(xiàng)目(2012-E-28)

200431 上海,復(fù)旦大學(xué)附屬華山北院寶山分院普外科(李玥、廖芝偉、黃琦、周遠(yuǎn)航、董建);同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院疝與腹壁外科(湯睿)

廖芝偉，Email:rhyylzw@hotmail.com

R657.3

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.05.020

2017-02-18)