PDZK1敲除對小鼠肝臟膽固醇代謝和膽囊結(jié)石形成影響的實(shí)驗(yàn)研究

焦龍 孫海東 陳超波 何川琦 王啟晗 趙剛 韓天權(quán) 胡海 蔣兆彥

·論 著·(膽道外科專題)

PDZK1敲除對小鼠肝臟膽固醇代謝和膽囊結(jié)石形成影響的實(shí)驗(yàn)研究

焦龍 孫海東 陳超波 何川琦 王啟晗 趙剛 韓天權(quán) 胡海 蔣兆彥

目的探討敲除PDZK1(Postsynaptic density-95,disks-large,ZO-1-domain K1,PDZK1)基因?qū)π∈蟾闻K膽固醇代謝調(diào)節(jié)和膽囊結(jié)石形成的影響。方法雄性成年P(guān)DZK1基因敲除小鼠(PDZK1 knockout,KO組)和野生型小鼠(wild type,WT組)，每組各10只，以成石飼料分別喂養(yǎng)4周，觀察膽囊成石情況，并收集肝臟和膽囊組織。采用蛋白印跡法測定肝臟PDZK1和清道夫受體B族1型(scavenger receptor B type 1,SRB1)表達(dá)。采用膽總管插管收集肝膽汁，測定膽汁分泌率和膽汁膽固醇含量。采用試劑盒酶法測定膽囊膽汁成分并計(jì)算膽汁膽固醇飽和指數(shù)(cholesterol saturation index,CSI)。以實(shí)時(shí)定量PCR檢測肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果成石飼料喂養(yǎng)4周后，WT組小鼠全部成石(10/10)，KO組小鼠則為40%(4/10)成石。兩組小鼠肝膽汁分泌率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但KO組小鼠肝膽汁膽固醇含量顯著降低(P<0.05)，膽汁酸含量增加(P<0.05)，且CSI降低(P<0.05)。KO組小鼠肝臟SRB1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，甾醇氧-酰基轉(zhuǎn)移酶基因1/2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，而肝型脂肪酸結(jié)合蛋白1和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(ATP結(jié)合盒b11)表達(dá)則顯著增加(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)DZK1影響SRB1在小鼠肝臟中表達(dá)，降低對高密度脂蛋白膽固醇攝取，減少膽汁膽固醇分泌，繼而降低膽囊結(jié)石形成。

膽固醇結(jié)石； 肝臟； PDZK1； 清道夫受體B族1型

膽固醇結(jié)石病(膽石病)是一種常見病。在我國，其發(fā)病率逐年攀升。近期對上海地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率達(dá)到13%[1]。目前對于膽石病的有效治療仍以手術(shù)為主。當(dāng)前臨床膽囊結(jié)石的類型主要為膽固醇結(jié)石，探索其發(fā)生的病理生理異常機(jī)制對于膽石病的防治具有重要意義。

從上世紀(jì)七八十年代以來的逐步研究顯示，膽石病與膽汁膽固醇過飽和[2]繼而膽固醇結(jié)晶形成并逐漸進(jìn)展成結(jié)石有關(guān)。此外，膽汁成核異常[3]和膽囊收縮能力減弱[4]對于膽石形成具有促進(jìn)作用。膽固醇過飽和被認(rèn)為是膽石病發(fā)生的必要條件。肝臟是膽固醇代謝的重要器官，包括膽固醇合成、攝取血漿脂蛋白膽固醇以及向膽汁分泌排出膽固醇等過程。機(jī)體血漿中60%的高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)膽固醇(HDL-C)由肝臟攝取經(jīng)膽道排泄清除[5]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，HDL-C是膽汁中膽固醇的主要來源[5]。清道夫受體B1型(scavenger receptor B type 1,SRB1)是肝細(xì)胞膜上的HDL受體，多在肝細(xì)胞的基底膜表達(dá)[6-8]。肝細(xì)胞SRB1表達(dá)增加可能是膽汁膽固醇過飽和及膽結(jié)石形成的重要機(jī)制[6-8]。我們測定膽石病病人肝臟組織發(fā)現(xiàn)SRB1蛋白表達(dá)增加，且與膽汁膽固醇含量相關(guān)[9]，進(jìn)一步證實(shí)了肝臟SRB1表達(dá)對膽石病發(fā)生的重要作用。SRB1在肝臟的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，特別是其在肝細(xì)胞膜表面表達(dá)，由PDZ domain-containing 1(PDZK1)作為適配器蛋白調(diào)控完成。PDZK1的相對分子質(zhì)量為70 000，因其序列中存在4個(gè)PDZ(取自具有類似結(jié)構(gòu)的3個(gè)蛋白質(zhì)：Pds95、Dlg和Zo-1的首字母縮寫)蛋白作用區(qū)域而被命名[10-11]。PDZK1 通過與SRB1蛋白羧基端的特定序列相結(jié)合，與SRB1 相互作用，維持其在肝細(xì)胞膜表面的正常表達(dá)和受體攝取功能[12]。

我們先前的研究采用腺病毒載體使小鼠肝臟過表達(dá)PDZK1基因發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞膜SRB1蛋白表達(dá)上調(diào)；相反，干擾PDZK1則降低細(xì)胞膜上SRB1的表達(dá)[13]，證實(shí)了PDZK1對于小鼠肝細(xì)胞膜SRB1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。在此基礎(chǔ)上，本課題旨在研究成石飼料喂養(yǎng)對PDZK1基因敲除(knockout,KO)小鼠肝臟膽固醇代謝和膽汁膽固醇成分的調(diào)節(jié)作用及其對膽囊結(jié)石形成的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及過程

PDZK1基因敲除小鼠采用雜合子×雜合子配種(PDZK1 +/-小鼠購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室)獲得PDZK1 -/- 小鼠(KO)及其同胞對野生型(+/+，wild type，WT)雄性小鼠各10只(基因型鑒定見圖1)。8周齡開始給予成石飼料(含1.25%膽固醇和0.5%膽酸，購自南通特洛非飼料科技有限公司)喂養(yǎng)4周。處死前，小鼠禁食過夜，不禁水。采用戊巴比妥(4.5 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉，眶周靜脈取血，離心取血清-80°C保存。采用腹部正中切口，暴露膽囊，觀察有無結(jié)石，結(jié)扎膽囊管切除膽囊于液氮凍存。采集肝臟組織凍于-80 ℃保存至檢測。

二、肝膽汁分泌率測定

WT 和KO組各5只小鼠在LD飼料喂養(yǎng)第28天行膽總管插管測定肝膽汁分泌率。術(shù)前禁食12 h，不禁水。采用戊巴比妥(4.5 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉，固定于解剖臺(tái)。采用腹部正中切口，暴露膽囊、膽總管，觀察膽囊有無結(jié)石并結(jié)扎膽囊管。將膽總管下端用絲線結(jié)扎，用眼科剪在膽總管中段剪開一個(gè)小口，沿此切口小心地將導(dǎo)管插入膽總管中并結(jié)扎固定，用臺(tái)燈照射保持小鼠體溫。插管另一端連接0.5 ml EP管，采用重力作用收集1 h肝膽汁，計(jì)算膽汁分泌率[以μl·g-1(體重)·h-1表示]，收集到的肝膽汁凍于-80 ℃保存至檢測。

三、血清生化分析和膽汁脂質(zhì)成分測定

血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(TG)、HDL-C和低密度脂蛋白(low density lipo-protein,LDL)膽固醇(LDL-C)以及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)均采用自動(dòng)生化儀測定。

肝膽汁和膽囊膽汁中膽固醇含量采用膽固醇試劑盒(德國羅氏公司)測定。膽囊膽汁膽汁酸含量和磷脂含量經(jīng)甲醇稀釋后分別采用膽汁酸試劑盒(上海執(zhí)誠生物科技有限公司)和磷脂試劑盒(北京伊普瑞斯公司，WAKO 296-63801)測定。采用Carey表計(jì)算膽囊膽汁膽固醇飽和指數(shù)(cholesterol saturation index,CSI)[14]。

四、蛋白印跡法

提取小鼠肝臟總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每個(gè)樣品50μg蛋白經(jīng)10%的聚丙烯酰氨凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜后，采用5%的牛血清白蛋白封閉2 h，分別以一抗(SRB1，PDZK1抗體：英國Abcam公司；內(nèi)參GAPDH：美國Proteintech公司)4 ℃過夜，洗膜后再用二抗(LI-COR公司)孵育2 h。采用蛋白印跡成像儀掃描成像。蛋白表達(dá)量采用灰度掃描測定，以GAPDH作為上樣內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

五、實(shí)時(shí)定量PCR

50 mg小鼠肝臟組織采用Trizol試劑(美國Life Technologies公司)提取總RNA。1 μg RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司,No.4368814)合成cDNA后用去離子水稀釋10倍。采用ABI 7900定量PCR儀進(jìn)行目的基因檢測，以GAPDH作為內(nèi)參。采用Delta CT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、膽囊成石情況

成石飼料喂養(yǎng)4周，WT小鼠全部成石，成石率100%(10/10)，而KO小鼠僅4只成石，成石率40%(4/10)(圖2)。

二、血脂及肝功能改變

如表1所示，PDZK1 KO小鼠血清TC和HDL-C明顯高于WT小鼠(P<0.05)，LDL-C、TG含量兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝功能指標(biāo)ALT、AST和AKP兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、肝臟SRB1蛋白表達(dá)

KO小鼠，肝臟無PDZK1表達(dá)(圖1B)，進(jìn)一步確認(rèn)了PDZK1表達(dá)喪失。KO小鼠肝臟SRB1蛋白表達(dá)也較WT小鼠顯著降低，P<0.05(圖3)。

A.鼠尾DNA分別采用WT和KO特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果,KO產(chǎn)物1100bp,WT產(chǎn)物1030bp,圖中樣本33～36為KO型,37～40為WT型,41為陰性對照;B.小鼠肝臟PDZK1蛋白表達(dá)圖1 PDZK1小鼠基因型鑒定

A.WT;B.KO圖2 成石飼料喂養(yǎng)4周WT和KO小鼠膽囊結(jié)石情況比較

表1 兩組小鼠血脂含量及肝功能比較

A.WesternBlot圖;B.兩組間SRB1蛋白相對表達(dá)量;經(jīng)LD喂養(yǎng)4周后,PDZK1KO肝臟SRB1蛋白相對表達(dá)量顯著低于WT組,兩組比較*P<0.05圖3 肝臟SRB1蛋白表達(dá)比較

四、膽汁脂質(zhì)含量比較

1 h肝臟膽汁分泌率在KO組為(2.82±0.57)μl·g-1·h-1，WT組為(3.80±0.49) μl·g-1·h-1，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05(圖4A)。但肝膽汁膽固醇含量在 KO小鼠為(3.64±1.11) mmol·g-1·h-1，顯著低于WT小鼠的(10.93±2.51) mmol·g-1·h-1,P<0.05(圖4B)，提示KO小鼠肝臟向膽汁中分泌膽固醇量降低。

WT小鼠膽囊膽汁中膽固醇含量(百分比)顯著高于KO小鼠，P<0.05；膽汁酸含量則KO小鼠明顯高于WT小鼠，P<0.05；磷脂含量在兩組間無明顯差異(圖4C)。WT小鼠膽汁CSI顯著高于KO小鼠，P<0.05(圖4D)。

A.肝膽汁分泌率;B.肝膽汁膽固醇含量;C.膽囊膽汁成分;D.膽固醇飽和指數(shù);兩組比較*P<0.05圖4 PDZK1WT和KO小鼠肝膽汁分泌率及膽汁脂質(zhì)含量

五、肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)差異

甾醇氧-酰基轉(zhuǎn)移酶1和2(sterol O-acyl transferase,Soat1/2)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)，其作用是將細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇合成為膽固醇酯，兩者基因表達(dá)在WT小鼠均顯著高于KO小鼠，P<0.05(圖5)。KO小鼠SRB1表達(dá)較WT小鼠降低，P<0.05。KO小鼠，F(xiàn)abp1表達(dá)則顯著升高，P<0.05，膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合盒B11(ATP binding cassette B11，Abcb11)也較WT小鼠明顯升高(P<0.05)。其他基因如膽小管側(cè)膜膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Abcg5/g8、低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDL-R)、膽汁酸合成限速酶--膽固醇7α羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,Cyp7α1)以及磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Abcb4等基因表達(dá)在兩組小鼠間無明顯差異。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)：①PDZK1基因敲除小鼠，肝臟SRB1蛋白表達(dá)降低(圖3)，導(dǎo)致血漿HDL-C含量升高(表1)；②成石飼料喂養(yǎng)下，PDZK1基因敲除小鼠，肝臟向膽汁分泌膽固醇減少(圖4)，膽囊膽汁膽固醇含量和CSI降低(圖4)，成石率減少(圖2)。

SRB1是第1個(gè)在分子水平上被確認(rèn)的高密度脂蛋白受體，具有509個(gè)氨基酸，是完整的跨膜糖蛋白，主要在肝臟、胃腸道和產(chǎn)固醇類器官表達(dá)[15]。SRB1在HDL攜帶外周組織膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)并經(jīng)膽道排泄過程中發(fā)揮重要作用，該過程也被稱為“膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)”[16]。SRB1在高爾基體合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞膜表達(dá)，需要配體連接蛋白 PDZK1參與[17]。PDZK1由519個(gè)氨基酸組成，除了肝細(xì)胞，在腎、胰腺、肝、胃腸道和腎上腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞[18]均有表達(dá)。PDZK1通過對SRB1的調(diào)節(jié)作用影響其對HDL代謝。我們之前采用腺病毒RNA干擾研究發(fā)現(xiàn)，干擾小鼠PDZK1基因表達(dá)可使肝細(xì)胞膜SRB1蛋白表達(dá)顯著降低[13]。在PDZK1敲除小鼠，肝臟SRB1蛋白表達(dá)則特異性的下降95%，小腸SRB1蛋白表達(dá)也降低約50%[19]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)(圖3)。Fuchs等[20]報(bào)道，普通小鼠成石飼料喂養(yǎng)，肝臟SRB1表達(dá)增加。我們發(fā)現(xiàn)，成石飼料無法上調(diào)PDZK1 KO小鼠肝臟SRB1表達(dá)，其SRB1相對表達(dá)量較WT降低約93.35%(0.05比0.79)。這可能是由于喪失PDZK1基因使得SRB1蛋白無法在細(xì)胞膜表達(dá)而被降解所致；另一方面PDZK1可能具有抵抗SRB1被蛋白降解的作用[19]。而在其他產(chǎn)類固醇激素組織，SRB1蛋白表達(dá)水平則不受影響，說明PDZK1的調(diào)控作用具有組織特異性(尤其是肝臟)[15]。由于缺失PDZK1所致肝臟細(xì)胞膜SRB1表達(dá)降低，導(dǎo)致HDL與SRB1結(jié)合減少，影響了肝細(xì)胞對血漿HDL-C攝入，所以血漿HDL-C含量增加[21]，我們的觀察結(jié)果與之一致(表1)。PDZK1對肝臟SRB1的特異性調(diào)節(jié)影響HDL的表達(dá)作用就好像常染色體隱性遺傳高膽固醇血癥主要受LDL受體激動(dòng)的調(diào)節(jié)[19]。

圖5 PDZK1WT和KO小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)比較 兩組比較*P<0.05

膽囊結(jié)石形成與膽汁膽固醇過飽和密切相關(guān)，而導(dǎo)致后者的原因主要是肝臟攝入過多外源性膽固醇并經(jīng)膽小管側(cè)膜膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG5/G8分泌到膽汁中有關(guān)。ABCG5/G8促進(jìn)向膽汁中膽固醇分泌及其導(dǎo)致膽石形成在小鼠[22-24]以及人體[9]均有報(bào)道證實(shí)。此外，多項(xiàng)研究顯示，膽汁中膽固醇主要來源于血漿HDL-C。Schwartz等[25]最早報(bào)道，HDL來源的膽固醇優(yōu)先分泌到人膽汁中。更多的小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)肝臟HDL受體SRB1缺失，膽汁膽固醇含量會(huì)降低[7]；相反，Kozarsky等[6]證實(shí)，過表達(dá)SRB1則降低血漿HDL含量，并升高膽汁膽固醇含量。這些研究均表明，SRB1在肝細(xì)胞表面表達(dá)及其對血漿HDL-C攝取的功能是調(diào)節(jié)膽汁膽固醇的重要因素。PDZK1作為目前發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)SRB1在肝細(xì)胞表面表達(dá)的重要蛋白，其對于HDL和膽汁膽固醇代謝也具有重要作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠PDZK1，抑制肝細(xì)胞SRB1表達(dá)，具有降低肝臟向膽汁分泌膽固醇的作用，進(jìn)而使膽囊膽汁膽固醇飽和度降低(圖4)，并減少結(jié)石的形成(圖2)。喪失PDZK1并不改變肝細(xì)胞膽小管側(cè)膜膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Abcg5/g8的表達(dá)，這說明KO小鼠肝膽汁膽固醇含量降低源于肝細(xì)胞經(jīng)HDL-C攝取降低，而非肝細(xì)胞向膽管分泌降低所致。該研究結(jié)果也再次證實(shí)了HDL-C在參與膽石形成中的重要作用。

然而，敲除PDZK1并未完全抑制小鼠結(jié)石形成，這可能與下列因素有關(guān)：①肝細(xì)胞表面SRB1表達(dá)并未完全喪失，殘存的受體仍具有部分HDL攝入功能。②經(jīng)其他受體途徑攝入的膽固醇如Ldlr進(jìn)入肝細(xì)胞并被導(dǎo)向膽汁分泌。我們的結(jié)果顯示兩個(gè)基因型小鼠肝臟Ldlr表達(dá)量是相似的。③PDZK1敲除并不改變小鼠膽汁膽汁酸分泌，膽汁酸通過其親脂性與磷脂形成的混合微粒對細(xì)胞膜上膽固醇的直接溶解作用進(jìn)入膽汁也具有部分代償作用。上述途徑可能在一定程度上替代了PDZK1敲除的影響。這與SRB1敲除小鼠無法抑制結(jié)石形成的結(jié)果比較類似[26]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PDZK1通過影響肝臟SRB1表達(dá)，具有調(diào)節(jié)血漿HDL代謝和膽汁膽固醇含量的作用。敲除PDZK1基因在一定程度上能減少小鼠結(jié)石形成。

1 蔣兆彥，吳健，韓天權(quán),等.膽固醇結(jié)石病防治研究的再發(fā)展.外科理論與實(shí)踐,2015,20:108-111.

2 Admirand WH,Small DM.The physicochemical basis of cholesterol gallstone formation in man.J Clin Invest,1968,47:1043-1052.DOI:10.1172/JCI105794.

3 Holan KR,Holzbach RT,Hermann RE,et al.Nucleation time:a key factor in the pathogenesis of cholesterol gallstone disease.Gastroenterology,1979,77:611-617.

4 Miyasaka K,Takata Y,Funakoshi A.Association of cholecystokinin A receptor gene polymorphism with cholelithiasis and the molecular mechanisms of this polymorphism.J Gastroenterol,2002,37:102-106.

5 Trigatti B,Rigotti A,Krieger M.The role of the high density lipoprotein receptor SR-BI in cholesterol metabolism.Curr Opin Lipidol,2000,11:123-131.

6 Kozarsky KF,Donahee MH,Rigotti A,et al.Overexpression of the HDL receptor SR-BI alters plasma HDL and bile cholesterol levels.Nature,1997,387:414-417.DOI:10.1038/387414a0.

7 Fluiter K,van der Westhuijzen DR,van Berkel TJ.In vivo regulation of scavenger receptor BI and the selective uptake of high density lipoprotein cholesteryl esters in rat liver parenchymal and Kupffer cells.J Biol Chem,1998,273:8434-8438.

8 Mardones P,Quinones V,Amigo L,et al.Hepatic cholesterol and bile acid metabolism and intestinal cholesterol absorption in scavenger receptor class B type I-deficient mice.J Lipid Res,2001,42:170-180.

9 Jiang ZY,Parini P,Eggertsen G,et al.Increased expression of LXR alpha,ABCG5,ABCG8,and SR-BI in the liver from normolipidemic,nonobese Chinese gallstone patients.J Lipid Res,2008,49:464-472.DOI:10.1194/jlr.M700295-JLR200.

10Silver DL.A carboxyl-terminal PDZ-interacting domain of scavenger receptor B,type I is essential for cell surface expression in liver.J Biol Chem,2002,277:34042-34047.DOI:10.1074/jbc.M206584200.

11Silver DL,Tall AR.The cellular biology of scavenger receptor class B type I.Curr Opin Lipidol,2001,12:497-504.

12Ikemoto M,Arai H,Feng D,et al.Identification of a PDZ-domain-containing protein that interacts with the scavenger receptor class B type I.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97:6538-6543.DOI:10.1073/pnas.100114397.

13蔡強(qiáng),吳健,蔡劬,等.PDZK1對成石喂養(yǎng)小鼠肝臟SRB1調(diào)節(jié)作用的研究.外科理論與實(shí)踐,2015，20:412-417.

14Carey MC.Critical tables for calculating the cholesterol saturation of native bile.J Lipid Res,1978,19:945-955.

15Rigotti A,Miettinen H,Krieger M.The role of the high-density lipoprotein receptor SR-BI in the lipid metabolism of endocrine and other tissues.Endocr Rev,2003,24:357-387.DOI:10.1210/er.2001-0037.

16Glomset JA,Nichols AV,Norum KR,et al.Plasma lipoproteins in familial lecithin:cholesterol acyltransferase deficiency Furthe studies of very low and low density lipoprotein abnormalities.J Clin Invest,1973,52:1078-1092.DOI:10.1172/JCI107273.

17Trigatti BL.SR-B1 and PDZK1:partners in HDL regulation.Curr Opin Lipidol,2017,28:201-208.DOI:10.1097/MOL.0000000000000396.

18Kocher O,Krieger M.Role of the adaptor protein PDZK1 in controlling the HDL receptor SR-BI.Curr Opin Lipidol,2009,20:236-241.DOI:10.1097/MOL.0b013e32832aee82.

19Kocher O,Yesilaltay A,Cirovic C,et al.Targeted disruption of the PDZK1 gene in mice causes tissue-specific depletion of the high density lipoprotein receptor scavenger receptor class B type I and altered lipoprotein metabolism.J Biol Chem,2003,278:52820-52825.DOI:10.1074/jbc.M310482200.

20Fuchs M,Ivandic B,Müller O,et al.Biliary cholesterol hypersecretion in gallstone-susceptible mice is associated with hepatic up-regulation of the high-density lipoprotein receptor SRBI.Hepatology,2001,33:1451-1459.DOI:10.1053/jhep.2001.24373.

21Cohen JC,Kimmel M,Polanski A,et al.Molecular mechanisms of autosomal recessive hypercholesterolemia.Curr Opin Lipidol,2003,14:121-127.DOI:10.1097/01.mol.0000064044.68936.6a.

22Wittenburg H,Carey MC.Biliary cholesterol secretion by the twinned sterol half-transporters ABCG5 and ABCG8.J Clin Invest,2002,110:605-609.DOI:10.1172/JCI16548.

23Yu L,Hammer RE,Li-Hawkins J,et al.Disruption of Abcg5 and Abcg8 in mice reveals their crucial role in biliary cholesterol secretion.Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99:16237- 16242.DOI:10.1073/pnas.252582399.

24Yu L,Li-Hawkins J,Hammer RE,et al.Overexpression of ABCG5 and ABCG8 promotes biliary cholesterol secretion and reduces fractional absorption of dietary cholesterol.J Clin Invest,2002,110:671-680.DOI:10.1172/JCI16001.

25Schwartz CC,Halloran LG,Vlahcevic ZR,et al.Preferential utilization of free cholesterol from high-density lipoproteins for biliary cholesterol secretion in man.Science,1978,200:62.

26Wang DQ,Carey MC.Susceptibility to murine cholesterol gallstone formation is not affected by partial disruption of the HDL receptor SR-BI.Biochim Biophys Acta,2002,1583:141-150.

EffectofPDZK1knockoutonhepaticcholesterolmetabolismandgallstoneformationinmice

JiaoLong*,SunHaidong,ChenChaobo,HeChuanqi,WangQihan,ZhaoGang,HanTianquan,HuHai,JiangZhaoyan.

*CenterofGallbladderDisease,ShanghaiEastHospital,InstituteofGallstoneDisease,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200120,China

JiangZhaoyan,Email:zhaoyanjiang@gmail.com;HuHai,Email:huhailc@sina.com

ObjectivePostsynaptic density-95,disks-large,ZO-1-domain K1 (PDZK1) is an adaptor which plays an important role in the expression of scavenger receptor B type 1 (SRB1) on the membrane of hepatocytes.This study aimed to investigate the influence of PDZK1 knockout (KO) on hepatic cholesterol metabolism and formation of gallstone in mice.MethodsAdult male PDZK1 KO and wild type (WT) mice (n=10/group) were fed on lithogenic diet (containing 1.25% cholesterol and 0.5% cholic acid) for 4 weeks.Liver and gallbladder were harvested.The expression of PDZK1 and SRB1 proteins was detected by Western blotting.Hepatic bile secretion rate and cholesterol content were measured by common bile duct cannulation for 1 h.Hepatic cholesterol and biliary composition were assayed by enzymatic kits and cholesterol saturation index (CSI) was calculated.The expression levels of hepatic genes involved in lipid metabolism were examined by quantitative real-time PCR.ResultsGallstone formed in all WT mice (100%,10/10) and 40% (4/10) in PDZK1 KO mice.No significant difference existed in the hepatic bile secretion rate between two groups.Cholesterol content in hepatic bile was lower in KO mice than in WT mice (P<0.05).As compared with WT mice,PDZK1 KO mice had decreased biliary cholesterol content (P<0.05),but increased bile acids (P<0.05).CSI was also lower in PDZK1 KO mice as well.Loss of PDZK1 decreased hepatic SRB1 protein expression (P<0.05).Hepatic mRNA expression of Soat1/2 was significantly lower in KO mice (P<0.05),while liver-type fatty acid binding protein 1 (L-Fabp1) and ATP binding cassette b11 (Abcb11) were significantly higher (P<0.05).ConclusionsOur results showed PDZK1 deficiency interfered with the expression of SRB1 on the membrane of hepatocytes,reduced uptake of cholesterol from high density lipoprotein and lower biliary cholesterol content,which might protect gallstone formation.

Cholesterol gallstone disease; Liver; Postsynaptic density-95,disks-large,ZO-1-domain K1; Scavenger receptor B type 1

國家自然科學(xué)基金(81570574；81570577；81070367)

200120 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院膽石病中心 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院膽石病研究所(焦龍、何川琦、王啟晗、趙剛、胡海、蔣兆彥)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科 上海消化外科研究所(孫海東、韓天權(quán))；江蘇省無錫市錫山人民醫(yī)院(陳超波)

蔣兆彥，Email:zhaoyanjiang@gmail.com；胡海，Email:huhailc@sina.com

R657.4+2

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2017.05.004

2017-06-12)