廣州地區(qū)桑椹菌核病病原鑒定

黃志君，易輝玉，李榮俏，李林山

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣州 510640）

廣州地區(qū)桑椹菌核病病原鑒定

黃志君1，易輝玉1，李榮俏1，李林山2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣州 510640）

桑椹菌核病是目前危害桑椹的主要真菌性病害，在廣州地區(qū)桑園一直都有發(fā)生，由多年前主要發(fā)生的肥大性菌核病變成小粒性菌核病，其菌核表面為大量的分生孢子和一些分生孢子梗，里面為相互交叉致密的菌絲，培養(yǎng)后的菌核周圍形成一層白色半透明的菌圈。使用真菌通用引物，由桑椹菌核病病果的菌核DNA擴(kuò)增ITS，測序后進(jìn)行Nucleotide BLAST和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其與4種桑椹菌核病病原菌中的肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）序列相似度最高、親緣關(guān)系最近，確認(rèn)該小粒性桑椹菌核病病原為肉阜狀杯盤菌。

桑椹菌核??；桑椹小粒性菌核??；形態(tài)鑒定；核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

桑椹，俗稱桑果，是長橢圓形聚合果，富含果汁，清甜可口，并具有極高的保健和藥用價值，被列為世界第3代水果，具有廣闊的開發(fā)利用前景。桑椹含有豐富的果糖、葡萄糖、丁二酸、無機(jī)鹽、7種維生素和人體所需的氨基酸等多種營養(yǎng)成分，也含有抗壞血酸、花青素（主要為矢車菊素）、白藜蘆醇和微量元素等活性成分［1-3］。桑椹除鮮食外，還可以制成桑椹酒、桑椹蜜餞、桑椹飲料等保健食品［4］。隨著人們生活水平的提高和追求高品質(zhì)水果及飲品，桑椹及桑果汁越來越受到人們的青睞；果桑的種植面積迅速發(fā)展，成為蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個新亮點(diǎn)。當(dāng)前正是果桑發(fā)展方興未艾之期，2016年廣東果桑種植面積已達(dá)1 500 hm2。但是，隨著果桑種植面積的擴(kuò)大，桑椹的毀滅性病害——桑椹菌核病也在不斷蔓延，該病傳染性極強(qiáng)、危害性大，直接影響桑椹的產(chǎn)量和質(zhì)量，發(fā)病嚴(yán)重時可導(dǎo)致全園桑椹絕收，給果桑產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性的危害［5］。

桑椹菌核病為真菌性病害，俗稱白果病，常見有桑椹肥大性菌核?。╩ulberry sorosus hypertrophic sclerote disease）、桑椹小粒性菌核?。╩ulberry sorosus parvulling sclerote disease）和桑椹縮小性菌核病（mulbery sorosus diminuting sclerote disease）3種。在國外，20世紀(jì)20年代Siegler與Jenkins就對桑椹小粒性菌核病的病原進(jìn)行了鑒定［6-7］；之后，在美國、日本和印度等國家都有桑椹菌核病相關(guān)的研究與報道［8-10］。Hong等通過對韓國果桑地的菌核進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，發(fā)現(xiàn)了在當(dāng)?shù)匕l(fā)生的兩種菌核病菌——核盤菌與核地杖菌，并對它們的形態(tài)進(jìn)行深入研究［11］。蒯元璋等對常見且公認(rèn)的3種桑椹菌核?。ㄉｉ┓蚀笮跃瞬　⑸ｉ┬×Ｐ跃瞬『蜕ｉ┛s小性菌核?。┘八鼈兊牟≡?shí)杯盤菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）和核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）的形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)的描述［5］。胡君歡等結(jié)合形態(tài)與分子鑒定，發(fā)現(xiàn)寧波天宮莊園桑果觀賞基地的菌核病菌除公認(rèn)的3種外，還有核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）［12］。

桑椹小粒性菌核病除直接危害桑果外，還會交叉感染桑樹其他組織，引起桑枝菌核?。〝嗌也。┑膰?yán)重發(fā)生。據(jù)藍(lán)月丘等報道，2007年5月廣西宜州市部分桑園暴發(fā)斷梢病，嚴(yán)重桑園發(fā)病率達(dá)80%～100 %，造成桑枝倒伏和干枯，桑葉減產(chǎn)60 %以上，給當(dāng)?shù)厣ＰQ帶來極大損害［13］。2014年4月華南農(nóng)業(yè)大學(xué)桑園桑枝菌核病（斷梢?。┮鹕鋫?0品種嚴(yán)重倒伏。根據(jù)對廣州桑椹菌核病的調(diào)查，近年該地區(qū)的桑椹菌核病主要為小粒性菌核病，但該菌核病是否有地理的特異性及病原是否有分化尚未有具體的研究。因此，本試驗(yàn)對華南農(nóng)業(yè)大學(xué)桑園桑菌核病病原菌的形態(tài)和分子進(jìn)行鑒定，為對其進(jìn)行對癥下藥和有效防控提供基礎(chǔ)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)桑園中采集桑椹菌核病病椹典型樣本2份，編號為gz01和gz02，用于直接進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究或-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)試劑：2 × Ace Taq Master Mix（Dye Plus）和DL2000 Plus DNA Marker，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 形態(tài)學(xué)研究

對采集的桑椹菌核病病椹菌核進(jìn)行切片觀察，并刮取菌核表面菌絲與孢子，進(jìn)行碘液染色，乳酚油作浮載劑制片，光學(xué)顯微觀察病原的形態(tài)特征。

對菌核進(jìn)行PDA培養(yǎng)，觀察菌絲與孢子形態(tài)。選擇新鮮菌核，切成大小3～4 mm2組織塊；將材料浸入75%酒精中2～3 s，再轉(zhuǎn)入0.1%升汞液處理0.5～2 min；然后經(jīng)無菌水清洗3次；用吸水紙吸干移入平板培養(yǎng)基上。每培養(yǎng)皿放置3～5塊材料，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)置于25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)組織塊長出菌絲，用移植針挑取邊緣菌絲制片觀察。

1.3 ITS分子鑒定

總DNA提?。簩⒕朔湃? mL離心管中，在全自動低溫組織勻漿儀上打碎后，用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

rDNA-ITS擴(kuò)增：用真菌ITS（核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，Internal Transcribed Spacer）的通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對菌核總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2 × Ace Taq Master Mix 25 μL；引物各1 μL；模板DNA 2 μL；加ddH2O至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃熱變性5 min；95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸45 s，此3步進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)終止后，取5 μL產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，120 V，電泳30 min。將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測序。

序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將測得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，選取并下載相關(guān)序列與目的序列一起進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。使用軟件MEGA 7.0，先采用ClustalW對所有序列進(jìn)行多序列比對分析，對位排列兩段對齊后，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），通過自舉分析（bootstrap）進(jìn)行置信度檢測，自展次數(shù)為1 000，用Kimura 2-parameter計算進(jìn)化距離，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑椹小粒性菌核病形態(tài)

病椹病征顯現(xiàn)初期，病椹仍呈正常淡紫紅色，但感病小果不斷膨大，顏色變淡，接著子房壁和花被由里到外逐漸變得透明，然后變白，而柱頭和萼片邊緣深褐色，最后整個病椹變白（圖1A、C，封三），病小果呈相互分隔澎大狀，容易掉落（圖1A，封三）。如果遇到雨水天氣，有的病椹變褐變黑，甚至腐爛（圖1B、D，封三）。如營養(yǎng)水分不足，病椹小果會顯得干枯和松散（圖1C，封三）。隨著病椹變白的過程，由病小果形成的菌核也不斷形成，剝開外層花被，可見由子房病變而成的黑色硬塊—桑椹小粒性菌核病菌核（圖2A，封三）。刮取菌核表面菌物質(zhì)觀察，可見大量的分生孢子以及一些分生孢子梗，孢子大小約2～3 μm，孢子梗呈分叉狀（圖2B，封三），對菌核進(jìn)行切片觀察，可見里面相互交叉致密的菌絲（圖2C、D，封三）。

圖1 桑椹菌核?。ò坠。┬螒B(tài)

圖2 桑椹小粒性菌核病菌核、孢子及菌核切片形態(tài)

通過對菌核的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在菌核周圍可形成一層白色半透明的菌圈（圖3A，封三），挑取菌落邊緣菌物進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其菌絲密集，菌絲多斷裂成小段，上面也存在著較多的分生孢子（圖3B，封三）。但通過培養(yǎng)沒有看到分生孢子的萌發(fā)（圖3B，封三）。

圖3 桑椹小粒性菌核病菌核培養(yǎng)的菌落、菌絲和孢子形態(tài)

2.2 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

由桑椹小粒性菌核病病果的菌核（gz01和gz02）提取總DNA，以它們?yōu)槟０澹谜婢ㄓ靡颕TS1和ITS4擴(kuò)增得到ITS片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖4）顯示，由菌核gz01和gz02擴(kuò)增得到的ITS片段大小相近，條帶位于500～750 bp之間，與真菌通用引物擴(kuò)增的條帶大?。?50 bp左右）相符。將擴(kuò)增得到的兩條ITS產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司純化后進(jìn)行測序。

圖4 ITS擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.3 ITS序列及其發(fā)育樹的構(gòu)建

序列比對發(fā)現(xiàn)，由gz01和gz02擴(kuò)增并測序的兩條ITS片段只有3個堿基的差異。在NCBI網(wǎng)站上對它們分別進(jìn)行Nucleotide BLAST分析，所測得的兩條ITS序列與多株Ciboria carunculoides菌株的ITS序列均有99%的相似性，與3株Ciboria shiraiana菌株的ITS序列有約90%的相似性，而與其它桑椹菌核病病原如Scleromitrula shiraiana的ITS序列則相似性較低。

根據(jù)BLAST結(jié)果，將所測得的兩條序列與NCBI登錄的桑椹菌核病病原ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖5），4種桑椹菌核病的病原—桑實(shí)杯盤菌（Ciboria shiraiana）、肉阜狀杯盤菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）均各成分支，Scleromitrula shiraiana與非桑椹菌核病病原—柔膜菌目真菌Cadophora melinii處于一支；其中Ciboria carunculoides和Ciboria shiraiana的親緣關(guān)系較近，Sclerotinia sclerotiorum和Scleromitrula shiraiana的關(guān)系較近。本實(shí)驗(yàn)研究的桑椹菌核病病原（gz01和gz02）與Ciboria carunculoides同源性最近。

圖5 桑椹菌核病病原菌系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 結(jié)論與討論

在植物病原分類鑒定方面，由于植物病原菌形態(tài)特征復(fù)雜，有些病原菌的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)受環(huán)境等外界因素影響而不穩(wěn)定，傳統(tǒng)的植物病原分類鑒定常引起分類系統(tǒng)的混亂或意見分歧。用于未知菌分類鑒定的核酸序列分析最常選用的是真菌核糖體脫氧核糖核酸（rDNA），rDNA序列保守性強(qiáng)，存在可變區(qū)和高變區(qū)。真菌基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA，它們在染色體上頭尾相連而串聯(lián)排列，相互之間由間隔區(qū)分隔；間隔區(qū)ITS1和ITS2是位于核糖體大小亞基基因之間的核苷酸序列，通過利用通用引物對間隔區(qū)ITS1和ITS2進(jìn)行克隆及測序分析，可以在種及亞種水平上進(jìn)行真菌的鑒定［14］。以PCR為基礎(chǔ)的ITS序列分析技術(shù)在植物病蟲害的研究上取得了突破性的進(jìn)展［14-15］。

目前，國內(nèi)對桑椹菌核病分子水平的研究才剛剛起步，其將是未來重要的研究方向。一般認(rèn)為桑椹菌核病包括桑實(shí)杯盤菌、肉阜狀杯盤菌和核地杖菌3種病原菌，但越來越多的研究表明桑椹菌核病病菌存在多樣性，近年來在形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上結(jié)合分子鑒定確認(rèn)其他病原菌如核盤菌等的存在［12，17-18］。賀磊等從發(fā)病桑椹上分離純化出一株真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定此菌株為一種桑椹致病菌—桑莖點(diǎn)霉（Phoma moricola）［16］。李如等從表現(xiàn)桑椹菌核病病癥的桑樹病果中分離到一株優(yōu)勢真菌菌株，其在PDA平板上培養(yǎng)的菌落外觀特征與在染病桑椹小核果間菌絲發(fā)育形成的菌核病菌類似，結(jié)合rDNA -ITS檢測分析，初步鑒定該菌株屬于擬莖點(diǎn)霉［17］。對華南農(nóng)業(yè)大學(xué)桑園桑菌核病病原菌的形態(tài)和分子進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)其病原菌主要為肉阜狀杯盤菌，表現(xiàn)為小粒性菌核??；但因取材的限制性，對其多樣性還有待進(jìn)一步的調(diào)查和研究。

另外，在病原侵染上，一般認(rèn)為桑椹菌核病菌的子囊孢子成熟噴發(fā)形成初次侵染，加上形成病椹后產(chǎn)生大量分生孢子形成再次侵染，侵染期長達(dá)1個多月；但我們調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在廣州地區(qū)，桑椹菌核病在后開花桑果中的為害較早開花的輕，這與分生孢子形成再次侵染的說法不相符；而且，我們對分生孢子進(jìn)行PDA、燕麥等培養(yǎng)基培養(yǎng)均不能使孢子萌發(fā)。張重梅對油菜的4株核盤菌的研究也發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中不能使核盤菌的分生孢子萌發(fā)［18］。因此，對桑椹菌核病分生孢子的侵染功能與機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Morphological and molecular identification of mulberry fruit sclerotiniose pathogen in Guangzhou

HUANG Zhi-jun1，YI Hui-yu1，LI Rong-qiao1，LI Lin-shan2

（1. College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Guangdong Sericulture Technology Extension Center，Guangzhou 510640，China）

Mulberry fruit sclerotiniose is the major fungal disease and becomes a serious threat to mulberry production. It often occurs in mulberry field of Guangzhou areas. And the harmful symptoms show that the major disease may change from mulberry sorosus hypertrophic sclerote disease to mulberry sorosus parvulling sclerote disease. In order to identify the pathogens of this disease，its morphological features were identified and the results showed that the suface of sclerotium had lots of conidia with some conidiophores and there were full of intersecting hyphae inside. When cultured on PDA media，a white and translucent zone was formed around the sclerotium.Moreover，the ITS conserved sequences of mulberry sorosus parvulling sclerote were analyzed and the results showed that the pathogen of mulberry sorosus parvulling sclerote disease wasCiboria carunculoides.

mulberry fruit sclerotiniose；mulberry sorosus parvulling sclerotiniose；morphological identification；internal transcribed spacer（ITS）

S888.71

A

1004-874X（2017）07-0091-05

黃志君，易輝玉，李榮俏，等. 廣州地區(qū)桑椹菌核病病原鑒定［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：91-95.

2017-04-22

廣東省協(xié)同創(chuàng)新與平臺環(huán)境建設(shè)項(xiàng)目（2015-09-11）

黃志君（1971-），男，博士，高級實(shí)驗(yàn)師，E-mail：hzj@scau.edu.cn

易輝玉（1981-），女，博士，講師，E-mail：yihy@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯 楊賢智）