RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應用

單長林，周 圓，李孝軍，楊賽軍，邵煒冬

（舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316021）

RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應用

單長林，周 圓，李孝軍，楊賽軍，邵煒冬

（舟山出入境檢驗檢疫局，浙江 舟山 316021）

利用玉米褪綠斑駁病毒外殼蛋白基因為靶標序列設計引物，通過優(yōu)化反應溫度、引物濃度、反應時間以及評價環(huán)引物效果，建立了檢測玉米褪綠斑駁病毒反轉錄環(huán)介導等溫擴增 （RT-LAMP） 方法，并與RT-PCR方法比較。結果表明，RT-LAMP在64℃等溫條件下反應45 min，最低可檢測到280 fg的目的片段，靈敏度是RT-PCR的100倍。以甘蔗花葉病毒、玉米矮花葉病毒、小麥線條花葉病毒、玉米白線花葉病毒及玉米褪綠斑駁病毒等5種病毒為檢測對象，證明該方法針對玉米褪綠斑駁病毒具有很強的特異性。利用RT-LAMP方法對100份模擬病毒感染的玉米種子進行檢測，病毒檢出率為100%。

玉米褪綠斑駁病毒；反轉錄環(huán)介導等溫擴增方法；RT-PCR；檢測

玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）是侵染玉米的重要病毒，主要通過種子遠距離傳送等方式傳播［1-3］，可侵染玉米、高粱等多達15～19種植物［4］，目前主要分布在墨西哥、美國部分地區(qū)、秘魯、阿根廷、法國、希臘、意大利、羅馬尼亞、西班牙、瑞士、澳大利亞、厄瓜多爾、南非、尼日利亞、肯尼亞、埃塞俄比亞、剛果、盧旺達及泰國等地［5-12］。有研究表明，該病毒既可以單獨侵染玉米，也可與小麥線條花葉病毒（WSMV）［13］、甘蔗花葉病毒（SCMV）［14-15］、玉米矮花葉病毒（MDMV）［15］復合侵染，導致玉米致死性壞死病。

2007年我國將MCMV列為進境檢疫性有害生物。2010年我國首次從進口玉米種子中檢出MCMV［16］，1年之后，Xie L等在我國云南的玉米植株上發(fā)現(xiàn)了MCMV［17］，到2015年，Deng等又在臺灣省甜玉米上檢測出MCMV［18］。饒玉燕等通過構建MCMV損失評判指標體系，對其在我國潛在經(jīng)濟損失作出評估，高達140.95億元［19］。加強進境糧食檢驗檢疫監(jiān)管，防范玉米褪綠斑駁病毒的入侵與擴散迫在眉睫。

目前針對MCMV的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、RT-PCR、實時熒光RT-PCR方法、表面等離子生物傳感器法等［20-22］。酶聯(lián)免疫法對快速檢測意義重大，但由于包被抗體特異性不強及保存不當?shù)仍?，易出現(xiàn)假陽性等問題；實時熒光RT-PCR技術，存在需大型儀器設備支持且運行成本高等問題，不利于基層檢測現(xiàn)場推廣。環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是由日本學者Notomi研發(fā)的一種恒溫擴增反應，可在恒溫條件下1 h內完成反應，結果清晰肉眼可辨，反應靈敏度高，準確性和特異性好且不需要大型儀器支持［23］。RT-LAMP 是在 LAMP 基礎上，加入反轉錄酶，使反轉率和核酸擴增同時進行，其獨有的檢測優(yōu)勢迅速得到廣大科研工作者的偏愛，廣泛應用于動植物病原微生物檢測［24-26］。

本研究主要利用RT-LAMP技術，并與RTPCR比較，分析其特異性和靈敏性，建立一種簡便易操作、特異性強、靈敏度高的方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒，為該病毒的田間診斷、口岸現(xiàn)場檢疫等提供更好的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米褪綠斑駁病毒、甘蔗花葉病毒由浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術研究所吳建祥教授提供，玉米矮花葉病毒、小麥線條花葉病毒及玉米白線花葉病毒（MWLMV）陽性質控物購自美國Agdia公司。

試劑、儀器：RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技有限公司），PrimeScriptTM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（大連寶生物公司），F(xiàn)luorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit （日本榮研公司）；

LA-320C實時濁度儀（日本榮研公司），PCR儀（ABI），NANODROP2000分光光度計（Thermo），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計合成 根據(jù)GenBank 發(fā)布的MCMV 外殼蛋白cDNA序列（登錄號分別為 AM490793.1，JQ943666.1，GU594293.1，JF422772.1，AY587605.1），通過 MEGA 6 軟件進行比對分析，找出外殼蛋白基因3′端保守序列，以此為模板，使用在線軟件Primer3 Input（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/），設計5條引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列比對結果及靶序列結合區(qū)域見圖1。

表1 玉米褪綠斑駁病毒RT-LAMP 檢測引物

圖 1 序列比對分析結果及各引物在基因組中對應的位置

1.2.2 總RNA 提取 取病毒樣品和健康玉米葉片，利用植物總RNA提取試劑盒分別提取RNA，用NANODROP 2000分光光度計測定核酸濃度（表2）與純度，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表 2 測定的幾種病毒的 RNA 濃度

1.2.3 RT-PCR 檢測 利用反轉錄試劑盒PrimeScript TM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit將提取的RNA反轉錄成 cDNA ，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用 Primer Premier 5.0 設計 RTPCR 引物：F-MCMV：TTATGCCACAAAA CCGCACTGT；R-MCMV：TAGGATTGCTGCT CCACGGT。擴增片段大小為190 bp。反應體系為 10μL 2×Taq PCR StarMix，1μL 引物F-MCMV / R-MCMV（10 umol/L），1μL模板cDNA，加水至20μL。PCR反應條件為94℃預變性 3 min；94℃變性 30 s，53℃退火 40 s，72℃延長1 min，進行35次循環(huán)；72℃延伸5 min。反應結束后，取5μL反應產(chǎn)物，1.6 %瓊脂糖凝膠電泳 30 min（100 V），紫外成像檢測。

1.2.4 RT-LAMP 檢測體系的優(yōu)化 基本檢測體系為：12.5μL 反應緩沖液 RM，1.0μL 酶溶液EM，1.0μL 熒光目視檢測試劑鈣黃素，1.0μL 模板 RNA，終濃度為 1.6μmol/L的MCMV-FIP/MCMV-BIP和終濃度為0.2μmol/L的MCMV-F3/MCMV-B3，最后加水至25μL。RT-LAMP反應條件為 63℃ 1 h，80℃ 5 min。LA-32℃實時濁度儀檢測濁度變化，并在反應結束后觀察熒光目視染料是否由橙色變?yōu)榫G色。

分別對反應溫度、引物濃度設置不同梯度進行優(yōu)化。將反應溫度設置為62、63、64、65℃，保持其他因素不變以篩選出最佳反應溫度；再將MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）引物終濃度設置為1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225） μmol/L，保持其他因素不變以篩選出最佳引物濃度；最后以（FIP/BIP）∶（LB）∶（F3/B3）=8∶4∶1加入環(huán)引物MCMV-LB以驗證環(huán)引物效果。試驗中用滅菌水為模板，以基本檢測體系進行陰性對照。

1.2.5 RT-LAMP 與 RT-PCR特異性比較 以MCMV、SCMV、MDMV、WSMV和MWLMV的RNA為模板，進行RT-LAMP檢測，觀察濁度及目視試劑顏色變化；同時進行RT-PCR檢測，凝膠電泳驗證。比較分析兩種方法的特異性。

1.2.6 RT-LAMP 與 RT-PCR靈敏度測定 以提取的MCMV RNA為原液，用RNase Free dH2O將RNA進行10倍梯度稀釋，分別獲得原液（280 ng/μL）、10倍稀釋液（28 ng/μL）、102倍稀釋液（2.8 ng/μL）、103倍稀釋液（280 pg/μL）、104倍稀釋液（28 pg/μL）、105倍稀釋液（2.8 pg/μL）、106倍稀釋液（280 fg/μL）、107倍稀釋液（28 fg/μL）、108倍稀釋液（2.8 fg/μL）。根據(jù)建立的RT-LAMP 反應體系進行擴增，觀察濁度及目視試劑顏色變化；同時進行RT-PCR反應，凝膠電泳驗證。比較分析兩種方法的靈敏性。

1.2.7 RT-LAMP檢測玉米種子樣本的應用 選取三葉期玉米幼苗（品種為農(nóng)大108），摩擦接種，15 d后表現(xiàn)典型癥狀，采集新鮮葉片，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集到的葉片與PBS緩沖液按照質量比1∶1等比例研磨，紗布過濾獲取病毒液，備用。選取健康玉米種子研磨成粉末，與10倍梯度稀釋病毒液混勻，模擬種子帶毒，作為待測樣本（100個）。利用植物總RNA 提取試劑盒提取模擬待測樣本RNA，同時進行RT-LAMP和RT-PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 RT-LAMP 檢測體系優(yōu)化

2.1.1 最適反應溫度的選擇 試驗設62、63、64、65℃4個反應溫度梯度，結果（圖2）顯示，在64℃條件下，反應濁度超出檢出限（濁度AABs=0.2）僅需要 24 min，到達平臺期（濁度AABs=0.8）僅需要37 min；而65℃則分別需要 26、39 min，62℃需要 33、47 min ，63℃需要35、54 min。因比當反應溫度為64℃時，反應進行最為迅速。

圖2 RT-LAMP 不同反應溫度試驗

2.1.2 引物濃度優(yōu)化 將引物MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）反應濃度設置為1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225）μmol/L等5個濃度梯度，結果（圖 3）顯示，在引物濃度為1.8（0.225）μmol/L條件下，反應濁度超出檢出限（濁度AABs=0.2）僅需要 27 min，到達平臺期（濁度AABs=0.8）只需要39 min，其他濃度條件下到達檢測限和反應平臺期的時間（分別為54、＞60 min，45、57 min，43、53 min，35、54 min）均有所延遲。因此最佳引物濃度為1.8（0.225）μmol/L。

圖3 RT-LAMP 反應不同引物濃度試驗

圖4 RT-LAMP中環(huán)引物效果試驗

2.1.3 環(huán)引物效果 由圖 4可知，未加入環(huán)引物反應在27 min 時濁度達到檢測線（AABs=0.2），且達到平臺期（AABs=0.8）需要長達39 min；加入環(huán)引物后，濁度達到檢測線時間提前到21 min，反應進行到平臺期所用時間減少6 min。由此可見，環(huán)引物可加速反應，效果明顯。

2.1.4 RT-LAMP 檢測體系的確定 經(jīng)過以上對RT-LAMP反應溫度、引物濃度及環(huán)引物加入與否等條件的優(yōu)化，確定RT-LAMP檢測體系為：12.5 μL 反應緩沖液 RM，1.0 μL 酶溶液EM，1.0 μL 熒光目視檢測試劑鈣黃素，1.0 μL 模板RNA，終濃度為1.8μmol/L的MCMVFIP/MCMV-BIP，終濃度為 0.225μmol/L 的MCMV-F3/MCMV-B3和終濃度為0.45μmol/L的MCMV-LB，最后加水至25 μL。由圖5可知，整個反應在45 min內可以完成，故RT-LAMP反應條件為64℃ 45 min。

2.2 特異性檢測

以 SCMV、WSMV、MDMV、MWLMV及MCMV的RNA為模板進行RT-LAMP檢測，結果（圖5）顯示僅有MCMV進行擴增反應，反應在45 min內完成且目視試劑顏色由橙黃色變?yōu)榫G色；RT-PCR反應結果（圖6）顯示僅有以MCMV為模板的反應擴增出190 bp大小的條帶。由此可知，RT-LAMP與RT-PCR均能特異性檢測MCMV。

圖5 RT-LAMP 特異性驗證

圖6 RT-PCR特異性驗證

2.3 靈敏度檢測

將 RNA 原液、101、102、103、104、105、106、107、108倍稀釋液分別作為模板，利用所建立的RT-LAMP 反應體系和RT-PCR檢測方法進行靈敏度比對。從圖7可以看出，RT-PCR 以103倍稀釋液為模板可以檢測到顯著的條帶；以104倍稀釋液為模板，電泳檢測的條帶模糊不清；以105倍稀釋液為模板，電泳沒有檢測到任何條帶。而RT-LAMP 檢測時，如圖8所示，以106稀釋液為模板，濁度仍可以在45 min內達到檢測線（AABs=0.2）。因此，RT-LAMP檢測MCMV的靈敏性比普通RT-PCR至少高100倍，并且RT-LAMP比RT-PCR節(jié)省時間，非常有利于MCMV的檢測應用。

圖7 RT-PCR靈敏度試驗電泳結果

2.4 RT-LAMP檢測玉米評價

利用植物總RNA提取試劑盒，提取100個模擬帶毒玉米種子樣本RNA，分別進行RTLAMP和RT-PCR 檢測。結果表明，RT-LAMP方法對100個待測樣本的病毒檢出率為100%（100/100）；RT-PCR方法對100個待測樣本的病毒檢出率為78%（78/100），針對部分低病毒濃度模擬樣本，由于靈敏度限制無法檢出。

圖8 RT-LAMP 靈敏度試驗

3 結論與討論

玉米在我國糧食生產(chǎn)中占據(jù)重要的地位，2012—2014年間，我國玉米進口總量超過1 000萬t。玉米褪綠斑駁病毒隨進口玉米傳入我國的風險很高。為更好地服務口岸檢疫部門，本研究利用RT-LAMP技術，建立針對MCMV的RTLAMP檢測方法，并與普通RT-PCR方法進行比較，證實RT-LAMP檢測方法具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。

實驗中RT-LAMP反應中環(huán)引物的加入使反應達到檢測線（AABs=0.2）及進入平臺期（AABs=0.8）時間提前6 min，整個反應效率大大提高，確保RT-LAMP 檢測在64℃等溫條件下反應進行45 min即可完成，比RT-PCR反應過程節(jié)省約1 h 。在RT-LAMP反應中，利用濁度儀實時監(jiān)測反應過程中濁度變化，將反應結果數(shù)據(jù)化，更加理性、客觀。通過加入可視試劑鈣黃素，使反應結果一目了然，避免傳統(tǒng)凝膠電泳等過程，簡化整個檢測流程，節(jié)約時間且有效避免反應產(chǎn)物交叉污染等問題，且整個反應過程不需要大型儀器設備的支持，方便口岸現(xiàn)場實驗室檢疫。

本實驗建立的RT-LAMP檢測方法，快速、靈敏且特異性強，能滿足針對玉米褪綠斑駁病毒的田間診斷、口岸現(xiàn)場檢疫的要求。

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Comparison and application of RT-LAMP and RT-PCR methods for MCMV detection

SHAN Chang-lin，ZHOU Yuan，LI Xiao-jun，YANG Sai-jun，SHAO Wei-dong
（Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316021，China）

For the detection of Maize chlorotic mottle virus（MCMV），a reverse-transcription，loop mediated isothermal amplification（ RT-LAMP） assay with high sensitivity and specificity was established. A set of five primers were designed，based on the coat-protein sequence of MCMV. By optimizing the concentration of primers，the best temperature，the suitable reaction time，and loop primer，the RT-LAMP was built by incubation at 64℃ for only 45 min with loop primer. The detection limit of RT-LAMP assay was 280 fg of MCMV RNA，which was 100 times more sensitive than that of RT- PCR assay. High species-specificity of RT- LAMP method was confirmed by the assay of 5 pathogens such as MCMV，SCMV，MDMV， WSMV and MWLMV. In addition，all the simulated samples were detected by LAMP assay，detection rate was 100%.

MCMV；RT-LAMP；RT-PCR；detection

S435.131.4

A

1004-874X（2017）07-0083-08

單長林，周圓，李孝軍，等. RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（7）：83-90.

2017-04-26

舟山市科技計劃項目（2015C31051）

單長林（1987-），男，碩士，助理農(nóng)藝師，E-mail：changlin_shan@163.com

（責任編輯 楊賢智）