低強(qiáng)度激光修復(fù)術(shù)對(duì)小型巴馬豬退變椎間盤(pán)水通道蛋白-3表達(dá)的影響*

黃 明 孫瑩杰△ 張鐵錚 李 凱 鄭昊龍 何寶文 陳克研

(1沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110016；2沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng)110031)

低強(qiáng)度激光修復(fù)術(shù)對(duì)小型巴馬豬退變椎間盤(pán)水通道蛋白-3表達(dá)的影響*

黃 明1#孫瑩杰1#△張鐵錚1李 凱2鄭昊龍1何寶文1陳克研1

(1沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110016；2沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng)110031)

目的：通過(guò)構(gòu)建小型巴馬豬椎間盤(pán)退行性病變模型，觀察低強(qiáng)度激光對(duì)豬椎間盤(pán)水通道蛋白-3(Aquaporin-3，AQP-3) 表達(dá)的影響。方法：小型巴馬豬9頭，隨機(jī)分為對(duì)照組 (Con組)，造模組 (Mod組)及激光治療組 (Las組)，每組3頭。Con組不進(jìn)行任何處理，Mod組及Las組在C形臂X光引導(dǎo)下利用16G針刺入豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間盤(pán)進(jìn)行破壞，Las組豬椎間盤(pán)退變模型建立1個(gè)月后，對(duì)已處理的椎間盤(pán)進(jìn)行低能量激光治療再觀察1個(gè)月，進(jìn)行MR檢測(cè)，并取椎間盤(pán)HE染色、免疫組化及Western檢測(cè)AQP-3的表達(dá)情況。結(jié)果：三組在造模前、造模后1個(gè)月、治療后1個(gè)月，Con組豬的椎間盤(pán)T2加權(quán)像呈高信號(hào)，Mod組信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，Las治療組呈中、高信號(hào)影。HE染色Con組結(jié)構(gòu)完整，Mod組結(jié)構(gòu)遭到破壞，Las組結(jié)構(gòu)較Mod組顯著恢復(fù)。與Con組比較，Mod組和Las組豬椎間盤(pán)的AQP-3表達(dá)均顯著降低 (P ＜ 0.05)，而Las組AQP-3表達(dá)較Mod組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)。結(jié)論：低強(qiáng)度激光對(duì)小型巴馬豬退變的椎間盤(pán)具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)其間盤(pán)組織水通道蛋白表達(dá)有關(guān)。

強(qiáng)度激光；椎間盤(pán)退化；巴馬豬；水通道蛋白-3

椎間盤(pán)突出是一個(gè)漫長(zhǎng)的病理過(guò)程，椎間盤(pán)主要由纖維環(huán)、髓核以及上下終板構(gòu)成，其中髓核被富含水分的纖維環(huán)所包繞，髓核含水量較纖維環(huán)高，其髓核含水量約80%，纖維環(huán)含水量約為 65%。腰椎間盤(pán)退變的發(fā)生與發(fā)展是人體在生長(zhǎng)發(fā)育停止后開(kāi)始，多于25歲左右，纖維環(huán)與髓核相繼發(fā)生退變，髓核脫水及吸水功能減弱，體積減小，彈性下降，椎間盤(pán)內(nèi)壓力變化不均，導(dǎo)致軟骨終板損傷，導(dǎo)致椎間盤(pán)營(yíng)養(yǎng)改變，椎間盤(pán)組織細(xì)胞成分改變，加速椎間盤(pán)退變，椎間盤(pán)退變導(dǎo)致纖維環(huán)出現(xiàn)裂痕，中央的髓核在受到周圍的壓力，在最薄弱處膨出、突出甚至脫出。

既往的研究顯示水通道蛋白-3 (Aquaporin-3，AQP-3) 與椎間盤(pán)退變有明顯的相關(guān)性[1～3]，AQP-3在椎間盤(pán)的生理代謝過(guò)程中具有重要的作用，可維持正常的滲透壓及能量的合成，參與維持椎間盤(pán)細(xì)胞的正常形態(tài)以及能量代謝[4,5]，本文通過(guò)構(gòu)建小型巴馬豬椎間盤(pán)退行性病變動(dòng)物模型,探討低強(qiáng)度激光修復(fù)術(shù)對(duì)豬椎間盤(pán)退行性病變的作用及其水通道蛋白-3表達(dá)的影響，為低能激光技術(shù)用于治療椎間盤(pán)突出疾病，提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方 法

1.動(dòng)物分組

健康成年小型巴馬豬9頭，雌雄不限，體重50～60 kg，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將上述巴馬豬隨機(jī)分為3組，每組3頭，分別為空白對(duì)照組 (Con組)，造模組 (Mod組)和低能量激光治療組 (Las組)。Con組不進(jìn)行任何處理，進(jìn)行觀察2個(gè)月，Mod組建立豬椎間盤(pán)退變模型后再觀察2個(gè)月，Las組建立豬椎間盤(pán)退變模型觀察1個(gè)月進(jìn)行低能量激光治療，再觀察1個(gè)月。

2.模型的建立及處理

術(shù)前取耳緣靜脈穿刺建立靜脈通路，靜脈給予3 mg/kg丙泊酚實(shí)施麻醉。麻醉成功后，將小型巴馬豬以左側(cè)位躺臥在具有C形臂X線引導(dǎo)的手術(shù)臺(tái)上，持續(xù)泵入丙泊酚8 ml/h維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測(cè)生命體征。術(shù)中靜脈輸注生理鹽水，并給與160萬(wàn)單位青霉素預(yù)防感染。

參照文獻(xiàn)[6]報(bào)告的方法建立椎間盤(pán)退行性變模型。在C形臂X線引導(dǎo)下確定豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間隙，用1%的利多卡因進(jìn)行浸潤(rùn)麻醉，用16 G的引導(dǎo)針沿定位點(diǎn)穿刺椎間盤(pán)。穿透纖維環(huán)后側(cè)后，呈放散狀將椎間盤(pán)進(jìn)行針刺破壞。術(shù)后連續(xù)應(yīng)用3天青霉素80萬(wàn)單位，每日觀察大小便以及飲食情況，1周后去除敷料，術(shù)后1個(gè)月行MR檢測(cè)驗(yàn)證模型是否成功。

在造模成功1個(gè)月后，對(duì)造模的椎間盤(pán)進(jìn)行低強(qiáng)度激光治療。C形臂X線引導(dǎo)下確定針尖位置無(wú)誤后，沿著引導(dǎo)針向椎間盤(pán)中間導(dǎo)入直穿刺針。向穿刺針中導(dǎo)入外徑為400 μm的光纖，光纖連于激光設(shè)備，設(shè)置激光器功率3瓦，預(yù)設(shè)能量900焦耳。激光輻射時(shí)間（曝光時(shí)間）30秒。波長(zhǎng)λ = 970 nm (0.97 μm)的激光輻射強(qiáng)度為3 W。輻射能量為90焦耳。激光作用后，注入少量(0.2～0.5 ml)生理鹽水。借助影像確定彎頭針的位置，拔出引導(dǎo)針。將彎頭針拉近纖維環(huán)部位，然后重新向前進(jìn)入髓核內(nèi)直至相同深度，重復(fù)3～5次。

3.豬椎間盤(pán)影像學(xué)檢查

在豬進(jìn)行造模前、造模后1個(gè)月、手術(shù)后1個(gè)月分別進(jìn)行MR檢測(cè)，觀察椎間盤(pán)狀態(tài)，每次行MR檢查均將豬進(jìn)行全麻，并監(jiān)測(cè)生命體征。進(jìn)行MR后密切觀察豬的飲食及二便3天，一切均正常后，進(jìn)行統(tǒng)一飼養(yǎng)。并運(yùn)用P fi rrmann分級(jí)系統(tǒng)對(duì)椎間盤(pán)進(jìn)行評(píng)估[6]。

4.標(biāo)本采集與檢測(cè)

2個(gè)月后，三組豬頸動(dòng)脈放血處理，游離相對(duì)應(yīng)椎間盤(pán)，取出纖維環(huán)，放于-80℃冰箱保存，采用Western Blot方法檢測(cè)APQ-3的表達(dá)，另取椎間盤(pán)組織(每只豬取L2-3、L3-4、L4-5、L5-6共4個(gè)椎間盤(pán))，連同上、下部分椎體，固定于甲醛，脫鈣行組織切片，片厚5 μm。常規(guī)蘇木精-伊紅染色。所有椎間盤(pán)組織標(biāo)本用10%甲醛常規(guī)固定，椎間盤(pán)EDTA液脫鈣,經(jīng)脫水、透明、包埋，連續(xù)5μm橫斷面切片，其中一片HE染色，觀察每個(gè)正中矢狀面椎間盤(pán)，并留影。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩變量間相關(guān)性分析用Person相關(guān)分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.影像學(xué)觀察

如圖1所示，在Con組椎間盤(pán)纖維環(huán)呈中等信號(hào)，髓核呈高信號(hào)影,纖維環(huán)信號(hào)略有不均勻，局部呈低信號(hào)影；在Mod組椎間隙變窄，椎間盤(pán)后突，硬膜囊受壓，髓核信號(hào)基本喪失，椎間盤(pán)變形；在Las組脊柱形態(tài)也出現(xiàn)了一定的退行性改變，髓核呈中高信號(hào)，間盤(pán)出現(xiàn)一定的形變，信號(hào)有部分缺失，部分區(qū)域呈低信號(hào)影，但基本完整，由于造模過(guò)程中對(duì)組織損傷較大，部分椎體高度發(fā)生明顯變化。

影像學(xué)分級(jí)結(jié)果如表1所示， 通過(guò)表1椎間盤(pán)影像學(xué)分級(jí)統(tǒng)計(jì)得出結(jié)果。Con組中的MR影像均為Ⅰ-Ⅱ級(jí)，未見(jiàn)明顯的退變征象；Mod組中主要以Ⅲ-Ⅳ級(jí)為主，可見(jiàn)明顯的退行性改變；Las組以Ⅱ-Ⅲ級(jí)為主，退變輕； Con組椎間盤(pán)的Ⅰ、Ⅱ級(jí)總數(shù)為100%、Mod組Ⅰ、Ⅱ級(jí)總數(shù)為16.7%、Las組Ⅰ、Ⅱ級(jí)總數(shù)為58.3%。

2.豬椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)變化

肉眼觀察椎間盤(pán)組織可發(fā)現(xiàn)，Con組椎間盤(pán)未見(jiàn)明顯退變,髓核呈白色膠凍狀、含水量多,結(jié)構(gòu)清晰，纖維環(huán)與髓核之間有較為明顯的分界，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)清楚、呈同心圓樣排列，Thompson分級(jí)為I級(jí)；而Mod組的椎間盤(pán)可見(jiàn)明顯的退化征象，纖維環(huán)局部出現(xiàn)明顯破裂帶，可見(jiàn)一個(gè)瘢痕樣針刺通道,貫穿整個(gè)纖維環(huán)及髓核，周圍出現(xiàn)硬化，Thompson分級(jí)分劃分至Ⅲ-Ⅳ級(jí)；Las組椎間盤(pán)厚度下降,間質(zhì)成分有所減低，髓核顏色為灰白色，纖維環(huán)與髓核之間分界略模糊，髓核周圍出現(xiàn)白色纖維樣組織，Thompson分級(jí)為Ⅱ-Ⅲ級(jí)(見(jiàn)圖2)。

HE染色顯示：Con組椎間盤(pán)組織結(jié)構(gòu)較清晰，軟骨基質(zhì)豐富，走形清楚，排列有序，細(xì)胞眾多，胞核較小，呈圓形，位于中央,纖維環(huán)結(jié)構(gòu)正常；Mod組組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠原纖維變大、走形不規(guī)則，并有炎性始終及壞死，纖維增粗，并出現(xiàn)玻璃樣變性，髓核細(xì)胞減少，纖維排列紊亂，分層不清晰，膠原纖維重度扭曲,部分?jǐn)嗔?。?xì)胞數(shù)目明顯減少，胞核增大，細(xì)胞介于軟骨細(xì)胞和纖維細(xì)胞；Las組髓核內(nèi)部可見(jiàn)裂隙,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚清晰，排列出現(xiàn)輕微的紊亂，細(xì)胞數(shù)中等，胞核與胞漿比例基本正常，并伴有輕微的炎性壞死及滲出(見(jiàn)圖3，表2)。

圖1 各組小型巴馬豬椎間盤(pán)MR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 MRI results of intervertebral discs of Bama miniature pigs

表1 椎間盤(pán)影像學(xué)分級(jí)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Intervertebral disc imaging grading table

表2 三組豬椎間盤(pán)病理分級(jí)表Table2 Pathological grading table of three groups of porcine intervertebral disc

圖2 三組小型巴馬豬間盤(pán)大體病理改變Fig.2 Gross pathological changes of plate among the three group

圖3 三組巴馬小型豬椎間盤(pán)病理組織學(xué)變化 HE染色Fig.3 Histopathological changes of intervertebral discs in three groups of Bama miniature pigs by HE staining

3.間盤(pán)纖維化AQP-3表達(dá)的變化

如圖4所示，細(xì)胞漿染為棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。Con組間盤(pán)切片有明顯陽(yáng)性表達(dá),細(xì)胞漿被染為棕黃色或棕褐色；Mod組幾乎無(wú)陽(yáng)性顆粒，結(jié)構(gòu)紊亂；Las組可見(jiàn)部分表達(dá)染色明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較Con組明顯減少，但明顯多于Mod組。

4.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示

與Con組比較，Mod組和Las組的AQP-3表達(dá)明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜ 0.05)；與Mod組比較，Las組的AQP-3表達(dá)顯著增加 (P ＜ 0.05，見(jiàn)圖5)。

WB結(jié)果顯示，對(duì)照組(Con組) AQP-3的表達(dá)明顯較造模組(Mod組)及激光組(Las組)顯著升高(P ＜ 0.05)。AQP-3在Mod組WB的表達(dá)較弱，條帶較窄；與Mod組相比，Las組的表達(dá)顯著升高 (P ＜ 0.05)。

圖4 三組小型巴馬豬椎間AQP-3免疫組化變化Fig.4 AQP-3 change among three group

圖5 三組巴馬小型豬椎間盤(pán)AQP-3 WesternBlot結(jié)果Fig.5 Western Blot Results of AQP3 in three groups of Bama miniature pig intervertebral discs*P ＜ 0.05，與 Mod 組及 Las組比較；#P ＜ 0.05，與 Mod組度比較

討 論

近年來(lái)， AQPs在間盤(pán)細(xì)胞水及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)越來(lái)越被大家所認(rèn)同。AQPs是一種小分子疏水性跨膜蛋白，大小約為26-34 kD,可選擇性通透水，廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物中。由于成人椎間盤(pán)缺少血液供應(yīng)，軟骨終板和纖維環(huán)的AQPs可能在椎間盤(pán)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝過(guò)程中起重要作用。Richardson等[3]研究發(fā)現(xiàn)在人纖維環(huán)及髓核中有AQP-1、AQP-3的表達(dá),而無(wú)AQP-2表達(dá),在外層纖維環(huán)中有少量的AQP-3表達(dá)而無(wú)AQP1表達(dá),原野等也在退行性變的椎間盤(pán)中發(fā)現(xiàn)AQP-3的表達(dá)明顯低于正常的椎間盤(pán)組織[7,8]。

椎間盤(pán)內(nèi)正常流體力學(xué)功能喪失是啟動(dòng)椎間盤(pán)退變的共同通路,間盤(pán)所承受的壓力負(fù)荷不斷變化，其內(nèi)水分的含量也隨壓力的改變而改變，液體的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)間盤(pán)的彈性異常重要。正常間盤(pán)在不斷活動(dòng)中產(chǎn)生形變，所以水份進(jìn)出間盤(pán)的速度也很快。纖維環(huán)為致密的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，單純彌散不足以解釋這一生理現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)中有AQPs的表達(dá)，AQPs在椎間盤(pán)維持脊柱穩(wěn)定、緩沖和均勻分配中發(fā)揮重要作用[9～13]。

目前治療椎間盤(pán)突出比較成熟方法是通過(guò)椎間盤(pán)微創(chuàng)技術(shù)對(duì)突出部分切除或者通過(guò)高溫?zé)崮夹g(shù)將突出的髓核進(jìn)行消融。雖說(shuō)暫時(shí)解決了突出壓迫的問(wèn)題，但可能對(duì)椎間盤(pán)造成不可逆的損傷，難以保證長(zhǎng)期效果，低能激光這項(xiàng)技術(shù)的獨(dú)創(chuàng)性在于，它不追求在椎間盤(pán)中建立所謂的一般認(rèn)為在負(fù)壓作用下“突出體組織”會(huì)向之移動(dòng)的“儲(chǔ)備腔”，取而代之的是在椎間盤(pán)中形成總體積小于椎間盤(pán)體積1%的若干細(xì)小渠道。通過(guò)多通道激光穿刺椎間盤(pán)重構(gòu)修復(fù)術(shù)使用0.97 μm波長(zhǎng)的輻射，減小了對(duì)椎間盤(pán)的破壞，又對(duì)突出的髓核進(jìn)行治療，通過(guò)多通道激光穿刺椎間盤(pán)重構(gòu)修復(fù)術(shù)，可以顯著地?cái)U(kuò)大經(jīng)皮激光穿刺治療腰椎間盤(pán)源性疾病的適應(yīng)癥范圍，并最大程度上不損傷椎間盤(pán)本身的結(jié)構(gòu)[14,15]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小型巴馬豬來(lái)模擬臨床病人，制成與臨床相似的椎間盤(pán)退變模型。穿刺造模后1個(gè)月進(jìn)行MR檢查，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行穿刺的椎間盤(pán)出現(xiàn)間隙變窄，椎間盤(pán)后突，硬膜囊受壓，髓核信號(hào)缺失，纖維環(huán)變形等改變，按照P fi rrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，處理后的椎間盤(pán)在Ⅲ-Ⅳ級(jí)，提示造模成功。在造模成功1個(gè)月后，進(jìn)行低強(qiáng)度激光治療，結(jié)果顯示，治療組椎間盤(pán)MRI P fi rrmann分級(jí)較模型組明顯降低，大體標(biāo)本和HE染色結(jié)果也證實(shí)治療組椎間盤(pán)退行病變明顯減輕，提示低強(qiáng)度激光對(duì)椎間盤(pán)具有一定修復(fù)功能，并且低強(qiáng)度激光是通過(guò)生物波的形式，刺激周圍組織，在治療的過(guò)程中相對(duì)減少了對(duì)周圍椎間盤(pán)的破壞作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組免疫組化示間盤(pán)切片幾乎無(wú)黃染顆粒。Las組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯多于模型組，Wester檢測(cè)結(jié)果也顯示，激光治療組的AQP-3明顯增加。

本研究中獲得的標(biāo)本均是手術(shù)摘除的椎間盤(pán)組織，由于初次進(jìn)行椎間盤(pán)解剖，相對(duì)操作不是非常規(guī)范,肉眼較難分辨出椎間盤(pán)各個(gè)組織，在取材過(guò)程中可能會(huì)破壞周邊組織造成實(shí)驗(yàn)誤差，加之樣本量相對(duì)不足，所以對(duì)同一頭豬的同一脊柱多次取材。這樣可能會(huì)從某種程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，低強(qiáng)度激光修復(fù)術(shù)可通過(guò)生物波進(jìn)行治療，對(duì)退變的椎間盤(pán)具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，其機(jī)制與上調(diào)水通道蛋白-3有關(guān)。

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THE INFLUENCE OF LOW-INTENSITY LASER ON THE EXPRESSION OF AQUAPORIN-3 IN DEGENERATIVE DISC OF THE MINIATURE BAMA PIG*

HUANG Ming1#, SUN Ying-Jie1#△, ZHANG Tie-Zheng1, LI Kai2, ZHENG Hao-Long1, HE Bao-Wen1,CHEN Ke-Yan1
(1Department of Anesthesia, General Hospital of Shenyang Military Command Area，Shenyang 110031,China;2Department of Anesthesia, NO.4 Hospital of Shenyang, Shenyang 110031, China)

Objective:To investigate the effect of low intensity laser irradiation on porcine intervertebral disc aquaporin-3 (AQP-3) expression by constructing the miniature Bama pig degenerative disc model. Methods: Nine miniature Bama pigs were randomly divided into three groups: control group (Con), model group (Mod) and laser treatment group (Las). Con group did not undergo any treatment, while the Mod group and the Las group underwent Type C arm X-ray guidance puncture with 16G needles to break down the L2-3, L3-4, L4-5, L5-6intervertebral discs. After one month, the discs were treated with low-energy laser treatment for another month. MR imaging was performed for 1 month. The expression of AQP-3 was detected by HE staining, immunohistochemistry and Western blot.Results:The T2-weighted images of the intervertebral discs showed a high signal intensity in the three groups before modeling, one month after modeling and one month after treatment. The signal intensity of the Mod group decreased significantly, and the signal intensity in the Las group was moderate and high compared with the Mod group.The structure of Con group was damaged and the structure of Las group was restored compared with Mod group.Compared with Con group, the expression of AQP-3 was signi fi cantly decreased in Mod and Las groups (P ＜ 0.05),but the expression of AQP-3 in Las group was signi fi cantly higher than Mod group (P ＜ 0.05) . Conclusion: Low intensity laser has a protective effect on degenerated intervertebral disc of Bama miniature pig, and its mechanism is possibly related to the up-regulation of aquaporin expression.

Low intensity laser; Intervertebral disc degeneration; Bama miniature pigs; AQP-3

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.004

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No：F14-158-9-11)

#共同第一作者

△通訊作者 sunyingjie9@hotmail.com