一種改良方法制備大鼠痛風(fēng)模型及其炎癥和疼痛效應(yīng)評(píng)價(jià)*

柴文新 施合歡 金雯麗 臺(tái) 燕 劉伯一△ 方劍喬△

（

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院針灸神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州310053；2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備管理處，杭州310053）

·論 著·

一種改良方法制備大鼠痛風(fēng)模型及其炎癥和疼痛效應(yīng)評(píng)價(jià)*

柴文新1施合歡1金雯麗1臺(tái) 燕2劉伯一1△方劍喬1△

（

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院針灸神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，杭州310053；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備管理處，杭州310053）

目的：采用一種改良方法制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并對(duì)造模后大鼠出現(xiàn)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要癥狀，即關(guān)節(jié)局部炎癥和疼痛進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。最后驗(yàn)證吲哚美辛是否能夠?qū)υ撃Ｐ痛笫蟀l(fā)揮有效鎮(zhèn)痛作用。方法實(shí)驗(yàn)一：把24只雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和對(duì)照組（n = 6）。模型組大鼠左踝后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30～40°方向穿刺關(guān)節(jié)腔，注射1.25 mg/50 μl尿酸鈉，制備大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。對(duì)照組則以同樣方式注射等量磷酸鹽緩沖液。對(duì)兩組大鼠造模前及造模后的2 h，4 h，8 h，24 h和48 h踝關(guān)節(jié)腫脹程度測(cè)量，進(jìn)一步利用動(dòng)物行為學(xué)方法對(duì)大鼠疼痛行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括自發(fā)性疼痛行為評(píng)分、機(jī)械縮爪閾值和熱痛敏潛伏期。實(shí)驗(yàn)二：將12只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組 (n = 6)，造模后24 h對(duì)其踝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行病理學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)三：把18只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和治療組 (n = 6)。模型成功建立后，進(jìn)一步利用行為學(xué)方法觀察腹腔注射吲哚美辛后對(duì)模型大鼠4 h，8 h，24 h機(jī)械縮爪閾值的影響。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一：利用改良法造模2 h后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)明顯腫脹，模型組踝關(guān)節(jié)腫脹情況可持續(xù)48 h以上。造模2 h后，模型組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)自發(fā)性疼痛行為，并且機(jī)械縮爪閾值開(kāi)始出現(xiàn)顯著降低 (P ＜ 0.05)。造模4 h后，熱痛敏潛伏期也開(kāi)始出現(xiàn)顯著下降 (P ＜ 0.05)。模型組大鼠上述各項(xiàng)疼痛指標(biāo)一直持續(xù)到模型建立后的第24 h (P ＜ 0.01)。實(shí)驗(yàn)二：模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織相比對(duì)照組出現(xiàn)廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)三：吲哚美辛可以有效緩解該模型大鼠機(jī)械痛過(guò)敏情況 (P ＜ 0.05)。結(jié)論：采用該改良方法制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可引發(fā)大鼠出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎癥及疼痛等急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)的主要臨床癥狀。并且非甾體抗炎藥對(duì)該模型可發(fā)揮顯著鎮(zhèn)痛作用。因此提示這一方法可用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備，并用于鎮(zhèn)痛藥物的篩選，值得進(jìn)一步推廣。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；機(jī)械縮爪閾值；熱痛敏潛伏期；炎癥；疼痛；吲哚美辛

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于單尿酸鈉鹽(monosodium urate, MSU) 結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)周?chē)M織引起的急性炎癥反應(yīng)[1,2]。關(guān)節(jié)腫脹與關(guān)節(jié)部位劇痛是該病病人最明顯的臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成關(guān)節(jié)畸形。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎會(huì)給病人身體帶來(lái)難以忍受的痛苦和心理上的巨大負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展、人口老齡化趨勢(shì)日漸明顯以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)發(fā)病人數(shù)正在逐年上升，已經(jīng)成為人民健康的重大威脅。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)任何根治痛風(fēng)的辦法。西醫(yī)治療藥物分為治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和糾正高尿酸血癥。前者有非甾體抗炎藥、秋水仙堿和糖皮質(zhì)激素等，它們能快速有效緩解疼痛，減輕炎癥；后者包括別嘌呤醇等抑制尿酸生成的黃嘌呤氧化酶抑制劑和丙磺舒、苯溴馬隆等促進(jìn)尿酸排泄的藥物。上述藥物雖然可暫時(shí)緩解痛風(fēng)癥狀，然而伴隨的不良反應(yīng)較多。

穩(wěn)定的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立能夠?yàn)橥达L(fēng)發(fā)病機(jī)制的闡明以及相關(guān)治療藥物的篩選提供巨大幫助。國(guó)內(nèi)外有幾種急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備方法[3～7]，但是目前普遍采用的仍然是Coderre提出的方法，即從踝關(guān)節(jié)背側(cè)以45°方向沿脛骨內(nèi)側(cè)穿刺踝關(guān)節(jié)腔，注射200 μl MSU，從而誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[8,9]。然而近期有研究發(fā)現(xiàn)這種穿刺方法會(huì)破壞大鼠踝關(guān)節(jié)部位軟骨組織，導(dǎo)致滑膜組織充血水腫，誘發(fā)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生，并且容易導(dǎo)致MSU向其他部位彌散，從而嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]。該研究又進(jìn)一步提出了一種改良后的踝關(guān)節(jié)穿刺方法，即將注射器在大鼠踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)30°刺入關(guān)節(jié)腔，注射50 μl MSU。這種改良方法相比傳統(tǒng)方法操作更加簡(jiǎn)單，并且對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷小，能夠顯著提高模型制備的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性[10]。然而這項(xiàng)研究?jī)H利用該方法對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)注射了一定體積生理鹽水，并未進(jìn)行模型制備。因此尚不能肯定利用該改良方法是否可以成功建立穩(wěn)定的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

本研究準(zhǔn)備進(jìn)一步利用該改良方法向大鼠踝關(guān)節(jié)腔注射一定劑量MSU（50 μl），并通過(guò)對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)炎癥以及若干疼痛行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行觀察，從而確立該方法是否可以用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立。我們發(fā)現(xiàn)采用該改良方法制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可引發(fā)大鼠出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)炎癥及疼痛等急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)的主要臨床癥狀，并且非甾體抗炎藥對(duì)該模型可發(fā)揮顯著鎮(zhèn)痛作用。因此提示這一方法可用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備，并用于鎮(zhèn)痛藥物的篩選，值得進(jìn)一步推廣。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重(220±20) g，均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)（2013-0016）。

2.主要儀器與試劑

磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：20161110，凱基生物公司生產(chǎn)）、尿酸鈉（批號(hào)：BCBR7559V，Sigma公司生產(chǎn)）、吲哚美辛（批號(hào)：17378，Sigma公司生產(chǎn)）、足底熱輻射測(cè)痛儀（37370，意大利UGO BASILE ）、纖毛機(jī)械刺激針（Von Frey Hairs test觸覺(jué)纖維絲，美國(guó)Stoelting）、美奈特?cái)?shù)碼游標(biāo)卡尺（上海美奈特實(shí)業(yè)有限公司）。

3. 分組與造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)6天，采用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)大鼠進(jìn)行分組。實(shí)驗(yàn)一：24只雄性SD 大鼠分為對(duì)照組（Veh組）、模型組（MSU組），每組12只。實(shí)驗(yàn)二：雄性12只SD 大鼠分為對(duì)照組（Veh組）、模型組（MSU組），每組6只。實(shí)驗(yàn)三：雄性18只SD 大鼠分為模型組（MSU + Veh組）、對(duì)照組（Veh組）和治療組（MSU + Indo組），每組6只。MSU組、MSU + Veh組和MSU + Indo組參照呂軍等人報(bào)道的改良方法于大鼠左踝后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)以30～40°方向穿刺關(guān)節(jié)腔，注射1.25 mg/50 μl尿酸鈉，Vehicle組則以同樣方式注射等量磷酸鹽緩沖液[10]。MSU + Indo組腹腔注射100 μl吲哚美辛(10 mg/kg)，MSU + Veh組腹腔注射100 μl相應(yīng)溶劑。

4.踝關(guān)節(jié)腫脹程度

采用數(shù)碼游標(biāo)卡尺測(cè)量造模前以及模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠內(nèi)外踝之間的直徑，連續(xù)測(cè)量三次并取其均值作為檢測(cè)結(jié)果。踝關(guān)節(jié)腫脹程度 = 測(cè)定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)直徑 - 初始直徑。

5.踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)二在造模后24 h，處死Vehicle組和MSU組大鼠并取大鼠患側(cè)的踝關(guān)節(jié)滑膜組織于 4%多聚甲醛固定， 經(jīng)脫水，包埋，切片后進(jìn)行蘇木素一伊紅染色。光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

6.自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分

造模后第2 h、4 h、8 h和24 h將大鼠置于透明觀察箱中，預(yù)適應(yīng)20分鐘。待大鼠安靜后，根據(jù)大鼠足爪表現(xiàn)的形態(tài)進(jìn)行等級(jí)評(píng)分[9]。0分：正常情況，右爪完全著地；1分：右爪未完全展開(kāi)，出現(xiàn)縮爪現(xiàn)象；2分：右爪輕微抬起；3分：右爪完全抬起。

7.50% 機(jī)械縮爪閾值（paw withdrawal threshold, PWT）檢測(cè)

分別于造模前和造模后的第2 h、4 h、8 h和24 h，采用Chaplan等創(chuàng)建的經(jīng)典的von-Frey刺激絲（力量分別是 0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g和26.0 g）Up-Down方法對(duì)兩組大鼠進(jìn)行機(jī)械痛閾的檢測(cè)[11,12]。測(cè)量前，先把大鼠放在特定的鐵絲網(wǎng)上，并蓋上透明的有機(jī)玻璃罩（20 cm×20 cm×15 cm）。待大鼠逐漸適應(yīng)環(huán)境，從而安靜下來(lái)（停止探索和梳理毛發(fā)）。大鼠安靜后，首先從4.0 g開(kāi)始，我們把von-Frey絲垂直刺向大鼠足底中央（避開(kāi)足墊），垂直用力使其輕微彎曲，每次的刺激時(shí)間≤ 5 s，間隔時(shí)間＞ 2 min。當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足或者舔足即為陽(yáng)性反應(yīng)，那么我們就記錄下“X”，下一次就換大一級(jí)的6.0 g來(lái)刺激；反之，若出現(xiàn)陰性反應(yīng)（大鼠一動(dòng)不動(dòng)），那么記錄下“O”， 接下來(lái)?yè)Q小一級(jí)的2 g繼續(xù)刺激。由此可得到一串以“O”或“X”組合的序列。我們以第一次出現(xiàn)“X”的前一次“O”作為起點(diǎn)，選擇包括該起點(diǎn)的連續(xù)6次的檢測(cè)結(jié)果作為推算50% PWT的關(guān)鍵序列。計(jì)算公式為50%PWT(g) = 10^ (xf+k*δ-4)。xf為序列中最后一根von Frey絲的對(duì)數(shù)值，k為根據(jù)檢測(cè)所得“X”“O”序列查表所得，δ在此約為0.231。

8.足爪熱痛敏潛伏期 (Paw withdrawal latency,PWL) 檢測(cè)

分別于造模后的2 h，4 h，8 h，24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)，采用足底熱痛敏測(cè)試儀(Ugobasile, Italy)檢測(cè)兩組大鼠患側(cè)足趾PWL。測(cè)量時(shí)，將大鼠置于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，室溫保持在25±2℃。大鼠安靜后（停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng)），將測(cè)試儀上的“十”字形標(biāo)記置于大鼠左后跖足底中央并避開(kāi)足墊。接下來(lái)開(kāi)啟儀器，從開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間作為大鼠的熱痛閾值。每只腳照射 3 次，每次間隔 5～6 min。我們把3次結(jié)果的平均值作為大鼠的PWL。為防止大鼠被熱輻射燙傷，我們將PWL測(cè)定的時(shí)間上限值設(shè)定為 20 s[13]。

9. 吲哚美辛對(duì)痛風(fēng)大鼠鎮(zhèn)痛療效觀察

實(shí)驗(yàn)三于造模后的6 h和22 h，MSU + Veh組大鼠腹腔注射100 μl溶劑，MSU + Indo組大鼠腹腔注射100 μl吲哚美辛(10 mg/kg)。Vehicle組不造模，只在踝關(guān)節(jié)注射生理鹽水。分別于造模后的0 h，4 h，8 h，24 h時(shí)間點(diǎn)，對(duì)MSU + Veh、MSU + Indo和Vehicle組三組大鼠進(jìn)行PWT的檢測(cè)。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.在實(shí)驗(yàn)一造模后對(duì)照組和模型組大鼠踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)及腫脹程度進(jìn)行觀察

造模24 h后，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠左足踝關(guān)節(jié)部位出現(xiàn)明顯腫脹（見(jiàn)圖1）。

圖1 造模后對(duì)照組和模型組大鼠患側(cè)足爪對(duì)比A ：對(duì)照組（Vehicle組）；B：模型組（MSU組）Fig.1 The comparison of the paw of rats between Vehicle and MSU-treated group A: Vehicle group; B: MSU group.

接下來(lái)對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度隨時(shí)間的變化進(jìn)行觀察。造模前，兩組大鼠左足踝關(guān)節(jié)直徑相比并無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在造模后的第2 h、4 h、8 h、24 h和48 h，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度相比對(duì)照組出現(xiàn)顯著上升（P ＜ 0.01）。踝關(guān)節(jié)腫脹程度在MSU注射后第2 h迅速達(dá)到高峰，且一直持續(xù)24 h（P ＜ 0.01）。在24 h后踝關(guān)節(jié)腫脹程度逐漸出現(xiàn)下降，但在第48 h，與對(duì)照組相比，模型組仍表現(xiàn)出明顯腫脹現(xiàn)象（P ＜ 0.01，見(jiàn)圖2）。

圖2 造模后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度比較(n=12,±SEM)**P ＜ 0.01，與 Vehicle 組相比Fig.2 The comparison of paw swelling of Vehicle and MSU-treated group in different time points (n=12,±SEM)**P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

2.實(shí)驗(yàn)二對(duì)造模后24 h大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)進(jìn)行觀察

由圖3A和B可知，H&E染色結(jié)果提示，造模后24 h，與對(duì)照組相比，模型組大鼠左踝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)了廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象（見(jiàn)圖3）。

圖3 滑膜組織H&E染色 (×40, Bar scale = 50 μm)造模后24 h大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察 A ：Vehicle組；B：MSU組Fig.3 Ankle synovial tissue pathology analysis of Vehicle and MSU-treated group 24 h after model establishment (×40, Bar scale = 50 μm)A: Vehicle group; B: MSU group.

3.實(shí)驗(yàn)一造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠表現(xiàn)的自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分

由圖4可知，在造模前，兩組大鼠自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在造模后的第2 h、4 h、8 h和24 h，模型組大鼠左側(cè)后肢表現(xiàn)出明顯的縮爪、抬爪等與自發(fā)性疼痛相關(guān)的行為學(xué)變化。模型組自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分相比對(duì)照組顯著上升（P ＜ 0.01或P ＜ 0.05），且在第8 h表現(xiàn)最為明顯（P ＜ 0.01）。造模后第48 h，模型組大鼠自發(fā)性疼痛行為恢復(fù)正常水平，與對(duì)照組評(píng)分相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)圖4）。

圖4 造模后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠的自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與 Vehicle組相比Fig.4 The ongoing pain score of Vehicle and MSU groups at each time point after model establishment (n=12,±SEM)* P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

4.造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠機(jī)械痛過(guò)敏行為的觀察

由圖5可知,造模前兩組大鼠50% PWT無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在造模后的第2 h，模型組大鼠50% PWT開(kāi)始出現(xiàn)顯著下降，提示機(jī)械痛過(guò)敏現(xiàn)象的發(fā)生（P ＜ 0.05）。這種機(jī)械痛過(guò)敏可一直持續(xù)到模型建立后的第24 h。在第48 h，模型組大鼠的機(jī)械痛過(guò)敏現(xiàn)象逐漸得到恢復(fù)（見(jiàn)圖5）。

5.實(shí)驗(yàn)一造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象的觀察

由圖6可知，造模前，模型組和對(duì)照組大鼠PWL無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從造模后第4 h開(kāi)始，模型組大鼠的PWL出現(xiàn)顯著下降， 提示熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象的發(fā)生（P ＜ 0.05或P ＜ 0.01）。這種熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象可一直持續(xù)到模型建立后的第24 h。在第48 h，模型組大鼠熱痛覺(jué)痛過(guò)敏現(xiàn)象逐漸得到恢復(fù)（見(jiàn)圖6）。

圖5 造模后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠50% PWT的比較(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01，與 Vehicle 組相比Fig.5 The PWT of rats in two groups at each time point after model establishment (n=12,±SEM)* P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

圖6 造模后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠PWL相比較(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與 Vehicle組相比Fig.6 The PWL of rats in two groups at each point after modelestablishment(n=12,±SEM)* P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with Vehicle group.

6.實(shí)驗(yàn)三中吲哚美辛對(duì)痛風(fēng)大鼠鎮(zhèn)痛療效觀察

由圖7可知，造模前三組大鼠50% PWT無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在造模后第4 h，MSU + Veh組和MSU + Indo組大鼠50% PWT出現(xiàn)明顯下降，提示造模成功(P ＜ 0.01)。分別于模后6 h和22 h腹腔給予吲哚美辛治療后， MSU + Indo組大鼠50% PWT在模后8 h和24 h相比于MSU + Veh組出現(xiàn)顯著上升(P ＜ 0.05或P ＜ 0.01)。這一結(jié)果提示吲哚美辛對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠具有良好鎮(zhèn)痛作用。

圖7 吲哚美辛對(duì)痛風(fēng)模型大鼠鎮(zhèn)痛作用研究(n=6,±SEM)A：模型制備，吲哚美辛給藥和PWT測(cè)定時(shí)間點(diǎn)示意圖；B：吲哚美辛對(duì)模型大鼠PWT的影響**P ＜ 0.01，與 Control組相比；#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，與MSU + Veh組相比Fig.7 The analgesic effect of indomethacin on the rat gout model(n=6,±SEM)**P ＜ 0.01, compared with Control group; # P ＜ 0.05,# # P ＜ 0.01, compared with MSU + Veh group.

討 論

隨著急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐漸升高[14]，因此急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制和治療方法逐漸成為人們所關(guān)注的問(wèn)題。制備合適的動(dòng)物模型對(duì)于探索急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生機(jī)制具有重要意義。長(zhǎng)期以來(lái)，Coderre和Wall提出的大鼠踝關(guān)節(jié)背側(cè)穿刺法一直是經(jīng)典的痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎造模方法[8,9]。然而近期呂軍等人的研究指出，按照Coderre和Wall方法進(jìn)行踝關(guān)節(jié)穿刺會(huì)導(dǎo)致大鼠關(guān)節(jié)軟骨面的損傷，部分脫落的關(guān)節(jié)軟骨會(huì)殘留在踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，導(dǎo)致周?chē)そM織充血水腫，形成創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾[10]。此外，Coderre方法中使用200 μl MSU注射踝關(guān)節(jié)腔，這一劑量也遠(yuǎn)超大鼠踝關(guān)節(jié)實(shí)際容積，從而容易使MSU彌散到足部其他部位。呂軍等人在研究中進(jìn)一步提出了一種改良的踝關(guān)節(jié)穿刺方法，即將注射器在大鼠踝關(guān)節(jié)后側(cè)沿跟腱內(nèi)側(cè)30°刺入關(guān)節(jié)腔，注射50 μl試劑[10]。這種改良方法相比傳統(tǒng)方法操作更加簡(jiǎn)單，并且對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷小，試劑分布更集中于踝關(guān)節(jié)腔，從而能夠顯著提高模型制備的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。然而在這項(xiàng)研究中，作者只是利用該改良方法對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)腔注射了一定劑量的生理鹽水，而并未對(duì)注射MSU后是否可以成功建立大鼠急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型以及模型大鼠表現(xiàn)的炎癥、疼痛指標(biāo)進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)。

在本項(xiàng)研究中，我們采用了呂軍等人提出的這種改良方法，并進(jìn)一步向大鼠踝關(guān)節(jié)腔注射50μl MSU，嘗試建立大鼠急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型。我們的研究發(fā)現(xiàn)，利用該方法建立MSU模型，方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好。所有MSU注射大鼠均表現(xiàn)出明顯的踝關(guān)節(jié)腫脹。此外，急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎發(fā)作期的主要病理學(xué)變化之一是關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，利用該方法制備大鼠急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型，模型大鼠的踝關(guān)節(jié)滑膜組織可出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，因此這一病理變化與急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的主要病理變化相符。

此外，我們又對(duì)利用該方法所建立的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型表現(xiàn)出的疼痛行為進(jìn)行了詳細(xì)研究。我們發(fā)現(xiàn)在大鼠踝關(guān)節(jié)注射MSU 2小時(shí)后，大鼠開(kāi)始出現(xiàn)明顯的縮爪、抬爪和舔爪等自發(fā)性疼痛行為，并且這種自發(fā)性疼痛行為可一直持續(xù)到MSU注射后的第24小時(shí)。除了自發(fā)性疼痛行為之外，我們還對(duì)MSU組大鼠表現(xiàn)的機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象進(jìn)行了觀察。我們發(fā)現(xiàn)在踝關(guān)節(jié)注射MSU 2小時(shí)后，MSU組大鼠開(kāi)始出現(xiàn)機(jī)械縮爪閾值的顯著降低。而在MSU注射4小時(shí)后，MSU組大鼠的熱痛敏潛伏期亦開(kāi)始出現(xiàn)顯著下降。這種機(jī)械痛覺(jué)和熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象可以一直持續(xù)到MSU注射后的第24小時(shí)。

此外，我們還檢測(cè)了吲哚美辛對(duì)該模型大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。眾所周知，吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，具有良好抗炎和鎮(zhèn)痛作用，臨床上常用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療。在實(shí)驗(yàn)中我們采用吲哚美辛對(duì)該痛風(fēng)模型大鼠進(jìn)行治療后，發(fā)現(xiàn)吲哚美辛能夠有效緩解大鼠疼痛癥狀。我們推測(cè)吲哚美辛的這一鎮(zhèn)痛作用與其有效抑制炎癥部位環(huán)氧合酶活性從而減少了前列腺素的合成密切相關(guān)。這一結(jié)果證明抗炎鎮(zhèn)痛藥物可以對(duì)該方法制備的大鼠急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型發(fā)揮有效鎮(zhèn)痛作用。而這與臨床上吲哚美辛對(duì)痛風(fēng)病人的治療效果一致。

綜上所述，本研究采用的改良方法制備的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，能夠有效引發(fā)大鼠出現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)部位炎癥和疼痛癥狀，并且經(jīng)典的抗炎鎮(zhèn)痛藥物可對(duì)該模型發(fā)揮有效鎮(zhèn)痛療效。因此這一改良方法適用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備，并可用于篩選和研發(fā)有效治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物，值得進(jìn)一步推廣。

[1]Mccarty DJ, Hollander JL. Identification of urate crystals in gouty synovial fl uid.Ann Intern Med, 1961,54:452 ～ 460.

[2]Roddy E, Doherty M. Gout. Epidemiology of gout.Arthritis Research & Therapy, 2010, 12:1 ～ 11.

[3]Yao L, Dong W, Lu F, et al. An Improved Acute Gouty Arthritis Rat Model and Therapeutic Effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae on Acute Gouty Arthritis Based on the Protein-Chip Methods. Am J Chin Med, 2012,40:121 ～ 134.

[4]Sabina EP, Nagar S, Rasool M. A Role of Piperine on Monosodium Urate Crystal-Induced Inflammation-An Experimental Model of Gouty Arthritis. In fl ammation,2011, 34:184 ～ 192.

[5]Miao Z, Guo W, Lu S, et al. Hypothermia induced by adenosine 5' -monophosphate attenuates early stage injury in an acute gouty arthritis rat model. Rheumatol Int, 2013, 33:2085 ～ 2092.

[6]曹燕亞, 郭瑞新. 尿酸鹽致大鼠痛風(fēng)模型的制備. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2011:32 ～ 33.

[7]黃火高, 孫運(yùn)峰, 胡明,等. 大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的建立及特點(diǎn). 軍事醫(yī)學(xué), 2005, 29:538 ～ 542.

[8]Coderre TJ, Wall PD. Ankle joint urate arthritis (AJUA)in rats: an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund' s adjuvant. Pain, 1987, 28:379 ～393.

[9]Coderre TJ, Wall PD. Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents. Pharmacol Biochem Behav,1988, 29:461 ～ 466.

[10]呂軍, 方和金, 吳濤. 一種改進(jìn)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備方法. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24:17 ～21.

[11]Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.J Neurosci Methods, 1994, 53:55 ～ 63.

[12]Silva MA, Trevisan G, Klafke JZ, et al. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Aloe saponaria Haw on thermal injury in rats. J Ethnopharmacol, 2013,146:393 ～ 401.

[13]賀端端, 郭向陽(yáng). cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)大鼠骨癌痛的產(chǎn)生和維持. 中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2015,21(1):10 ～ 14.

[14]Miao Z, Li C, Chen Y, et al. Dietary and lifestyle changes associated with high prevalence of hyperuricemia and gout in the Shandong coastal cities of Eastern China.J Rheumatol, 2008, 35:1859 ～ 1864.

STUDY OF A MODIFIED ACUTE GOUTY ARTHRITIS RAT MODEL AND THE EVALUATION OF INFLAMMATION AND PAIN*

CHAI Wen-Xin1, SHI He-Huan1, JIN Wen-Li1, TAI Yan2, LIU Bo-Yi1△, FANG Jian-Qiao1△
(1Department of Neurobiology and Acupuncture Research, The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;2Laboratory and Equipment Administration, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective:A modified method was used to establish acute gouty arthritis (AGA) rat model. The major symptoms, including ankle joint in fl ammation and pain of AGA rats as well as the analgesic effect of indomethacin were evaluated.Methods:Twenty-four male SD rats were randomly divided into Vehicle group and MSU group (n = 12) in Experiment #1. Rats of MSU group were injected with 1.25 mg/50 μl monosodiumurate in the rear side of left ankle in 30-40°angle, following the interior side of Achilles tendon. Rats of Vehicle group were injected with the same volume of phosphate buffered saline. The ankle swelling of these two groups was measured before model establishment and 2, 4, 8, 24 and 48 h thereafter. Animal behavioral assay was further used to evaluate the nocifensive behavior, which included ongoing pain score, mechanical paw withdrawal threshold (PWT) and thermal paw withdrawal latency (PWL).Twelve male SD rats were randomly divided into MSU group and Vehicle group in Experiment #2 .The pathological changes of ankle synovial tissue were evaluated at 24 h after model establishment. Eighteen male SD rats were randomly divided into MSU group, Vehicle group and Treatment group (n = 6) in Experiment #3. After the successful establishment of the model, the therapeutic effect of indomethacin on PWT was further evaluated 4, 8, 24 h thereafter.Results:2 h after the model establishment, the MSU group showed obvious ankle joint swelling compared with Vehicle group in Experiment #1. The swelling lasted up to 48 h. The MSU group showed obvious ongoing pain behavior and the PWT began to decline significantly 2 h after model establishment(P ＜ 0.05). PWL also exhibited signi fi cant decline (P ＜ 0.05), 4 h after the model establishment. These pain-related behaviors remained until 24 h after the model establishment (P ＜ 0.01). MSU group showed extensive in fl ammatory cell in fi ltration in Experiment #2. Furthermore, indomethacin signi fi cantly alleviated the mechanical hyperalgesia of the MSU rats (P ＜ 0.05) in Experiment #3.Conclusions:The modi fi ed model of AGA is simple and shows good reproducibility. It induces obvious ankle swelling and pain-related behavior in tested rats, which are the major clinical manifestations of AGA. Therefore, our results suggest that this modi fi ed method can be used to establish animal models of AGA and can be further used for screening of potential analgesic drugs.

Acute Gout Arthritis; Paw Withdrawal Threshold；Paw Withdrawal Latency；In fl ammation；Pain；Indomethacin

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.10.003

國(guó)家自然科學(xué)基金（81603676）；浙江省自然科學(xué)基金“杰出青年基金”（LR17H270001）；浙江省中山醫(yī)院“新星人才”（2016XXRC02）；浙江省“錢(qián)江人才計(jì)劃”資助項(xiàng)目；浙江省一流學(xué)科中醫(yī)學(xué)研究生創(chuàng)新計(jì)劃（2017202）；浙江省新苗人才計(jì)劃（2017R410011）

△ 通訊作者 劉伯一boyi.liu@foxmail.com；方劍喬fangjianqiao7532@163.com