• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DNA的滾環(huán)擴(kuò)增合成研究

    2017-11-01 18:11:07劉淑貞張志慶王秀鳳張國(guó)棟劉婷婷張洪芝
    物理化學(xué)學(xué)報(bào) 2017年10期
    關(guān)鍵詞:瓊脂糖比值產(chǎn)物

    劉淑貞 張志慶 王 芳 周 亭 王秀鳳 張國(guó)棟 劉婷婷 張洪芝

    (中國(guó)石油大學(xué)(華東)理學(xué)院,山東 青島 266580)

    DNA的滾環(huán)擴(kuò)增合成研究

    劉淑貞 張志慶*王 芳 周 亭 王秀鳳 張國(guó)棟 劉婷婷 張洪芝

    (中國(guó)石油大學(xué)(華東)理學(xué)院,山東 青島 266580)

    滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)作為一種簡(jiǎn)單高效的等溫酶促反應(yīng),現(xiàn)已發(fā)展為核酸擴(kuò)增領(lǐng)域的新技術(shù),其產(chǎn)物在組裝體搭建和多功能材料的制備方面有著廣泛的應(yīng)用。本文采用瓊脂糖凝膠、紫外和透射電鏡(TEM)等手段,探究了時(shí)間、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTPs)、酶以及引物的濃度等因素對(duì)脫氧核糖核酸(DNA)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明:在反應(yīng)開始的前30 min,RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度受時(shí)間的影響比較明顯;隨著dNTPs濃度的提高,RCA產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)增長(zhǎng),濃度也不斷提高;酶和引物的濃度對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒有明顯影響,但對(duì)RCA產(chǎn)物濃度的影響較大,過量的酶致使RCA產(chǎn)物的含量顯著下降。

    滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù);核酸;dNTPs;聚合酶;引物

    1 引 言

    近年來,分子生物學(xué)和生物化學(xué)發(fā)展迅速,新的核酸擴(kuò)增技術(shù)不斷涌現(xiàn),滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling Circle Amplification,RCA)反應(yīng)作為一種簡(jiǎn)單高效的等溫酶促反應(yīng)發(fā)展迅速,現(xiàn)已成為核酸擴(kuò)增技術(shù)的新寵1。在RCA反應(yīng)中,聚合酶連續(xù)不斷地將核苷酸添加到環(huán)狀模板的引物上,形成一條含有幾十、幾百甚至上千個(gè)相互串聯(lián)重復(fù)單元的單鏈 DNA。不同于聚合酶鏈?zhǔn)?Polymerase Chain Reaction,PCR)反應(yīng)需要昂貴精密的設(shè)備和熱穩(wěn)定性的聚合酶2,RCA反應(yīng)可以在恒溫條件下的溶液中,固相支持物上,甚至一個(gè)復(fù)雜的生物環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)3。

    滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)作為一種強(qiáng)大的核酸擴(kuò)增工具,其產(chǎn)物在許多方面都有著廣泛的應(yīng)用。如Mao等4利用長(zhǎng)度不同的RCA產(chǎn)物與金納米顆粒進(jìn)行組裝,得到不同長(zhǎng)度的金納米線;Willner等5將RCA產(chǎn)物作為酶有序裝配雜交復(fù)合材料的骨架,表現(xiàn)出強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)衍生性功能;在DNA折紙術(shù)6中,利用長(zhǎng)度合適的RCA產(chǎn)物作為骨架鏈,添加互補(bǔ)短鏈作為腳手架鏈,制備具有不同形貌的組裝體7,8?;赗CA產(chǎn)物搭建的組裝體含有眾多的重復(fù)單元,這種獨(dú)特的組裝體可攜帶大量的用于檢測(cè)和治療的物質(zhì),例如熒光素、生物素、抗體、納米粒等;同時(shí)也可以通過環(huán)狀模板的設(shè)計(jì),將RCA產(chǎn)物設(shè)計(jì)成含有適配子、DNA酶、墊片、內(nèi)切位點(diǎn)等功能化序列,制備多功能材料用于生物識(shí)別、藥物遞送、生物傳感等9?20。現(xiàn)在,滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)又在DNA納米粒子(DeNAno):新型多價(jià)親和試劑21方面嶄露頭角,這更加拓寬了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用。

    控制RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度和濃度對(duì)于后續(xù)的組裝和應(yīng)用至關(guān)重要,但是鮮見較系統(tǒng)的研究各種合成條件對(duì)RCA產(chǎn)物影響的報(bào)道。因此,本文系統(tǒng)考察了時(shí)間、dNTPs的濃度、酶的濃度以及引物的濃度等因素對(duì)RCA產(chǎn)物長(zhǎng)度和濃度的影響,并利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外和TEM等手段對(duì)RCA產(chǎn)物進(jìn)行表征。

    表1 核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in RCA reactions.

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 試 劑

    實(shí)驗(yàn)所用核苷酸序列(序列見表 1)及dNTPs(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)均購(gòu)自大連

    Takara 生物技術(shù)公司(序列見表 1),保存在?20 °C;phi29 DNA 聚合酶,購(gòu)買于 Thermo Fisher Scientific,保存于?20 °C;瓊脂糖、TAE緩沖溶液、6 × 上樣緩沖液和DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶(DNA Ladder,0.2?10 kb, 21 bands)均購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)。本文中用水皆為高純水。

    2.2 合成及表征方法2.2.1 滾環(huán)擴(kuò)增合成

    取一定量的環(huán)狀DNA1模板于離心管中,加入一定量的引物DNA2和dNTPs,用混勻儀混勻15 s;再加入一定量的phi29 DNA聚合酶及緩沖溶液和一定量的水,混勻,在30 °C下反應(yīng)一段時(shí)間,65 °C下終止反應(yīng)。

    2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳表征

    配置1 × TAE緩沖溶液,至于水平電泳槽中,用于跑膠。取 2 μL DNA ladder加入 2 μL 6 × 上樣緩沖液和6 μL H2O混勻,再各取8 μL RCA產(chǎn)物和2 μL 6 × 上樣緩沖液混勻,在0.6%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行上樣,300 V恒壓下進(jìn)行電泳,在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察和拍攝。本文瓊脂糖凝膠電泳所用ladder皆與圖1a中一致。

    2.2.3 吸收光譜表征

    首先對(duì)微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop,杭州奧勝 Nano-100)進(jìn)行空白校準(zhǔn),然后取2 μL RCA產(chǎn)物置于Nanodrop上進(jìn)行測(cè)試,保存數(shù)據(jù)和圖片,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    圖1 時(shí)間對(duì)RCA產(chǎn)物的影響Fig.1 Effect of reaction time on RCA product.(a, b) the agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different time. bp indicates the number of bases.

    2.2.4 透射電鏡表征

    取10 μL RCA產(chǎn)物置于銅網(wǎng)上沉積一段時(shí)間,1%醋酸雙氧鈾染色,使用日本電子 JEM-2100高分辨透射電鏡進(jìn)行表征和分析。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 時(shí)間的影響

    首先考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì) RCA產(chǎn)物的影響,從圖1a和1b上可明顯的發(fā)現(xiàn),反應(yīng)開始的前半個(gè)小時(shí),RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度受時(shí)間的影響比較顯著,之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度不再有明顯改變。早期的RCA研究者,Eric T Kool等發(fā)現(xiàn)時(shí)間對(duì)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度有著一定的影響22,而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之非常類似。膠譜圖1a上RCA產(chǎn)物的亮度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變亮,說明最開始反應(yīng)階段不僅產(chǎn)物的長(zhǎng)度比較短,而且濃度也比較低。反應(yīng)過程中,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)物的長(zhǎng)度不斷增長(zhǎng),濃度也逐漸增加,直至反應(yīng)達(dá)到平衡22。在反應(yīng)的過程中,長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)的體系中有白色絮狀沉淀物析出,因?yàn)樵诜磻?yīng)初期,RCA產(chǎn)物首先形成一種無定形結(jié)構(gòu),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,RCA產(chǎn)物在基質(zhì)表面形成一些類晶結(jié)構(gòu),RCA產(chǎn)物繼續(xù)在這些類晶結(jié)構(gòu)的表面上進(jìn)行組裝形成花瓣結(jié)構(gòu),逐漸形成花狀球形結(jié)構(gòu)。RCA產(chǎn)物可以通過鏈內(nèi)和鏈間的雜交(DNA納米花的組裝不依賴于傳統(tǒng)的Watson-Crick堿基配對(duì))進(jìn)行交聯(lián)形成緊密的結(jié)構(gòu),在局部累積形成DNA納米花23。用TEM對(duì)30 min的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行掃描,觀察到有很多粘連的球狀物,尺寸在300 nm左右(如圖2a和2b)。

    3.2 dNTPs的影響

    在RCA體系中加入不同濃度的dNTPs,發(fā)現(xiàn)dNTPs的濃度對(duì)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度有著非常顯著的影響。從膠譜圖3a上可以明顯觀察到,隨著dNTPs濃度的增加,RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度不斷增長(zhǎng);當(dāng)dNTPs的濃度增加到一定值時(shí)(環(huán)狀DNA1模板:dNTPs摩爾濃度比為1 : 250),RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度則不再明顯增長(zhǎng),再增加dNTPs的濃度對(duì)RCA產(chǎn)物長(zhǎng)度的影響已經(jīng)不大,這可能是由phi29 DNA聚合酶的聚合擴(kuò)增能力決定的24。

    如圖3c所示,RCA產(chǎn)物的濃度隨dNTPs濃度的提高而不斷提高,而且隨著dNTPs濃度的提高,體系紫外吸收峰的位置逐漸左移靠近 260 nm(圖3b)。OD260與OD280吸光度的比值越接近1.8(OD為光密度),代表DNA的純度越高,超過或低于 1.8都代表有別的污染物;而 OD260與OD230吸光度的比值一般在 1.8?2.2之間,表明DNA純度較好25?27。圖 3d所示,Nanodrop分析給出的 OD260/280的比值逐漸接近 1.8,OD 260/230的吸光度比值逐漸接近 2.0,說明隨著dNTPs濃度的增加,體系中RCA產(chǎn)物的含量逐漸提高,至環(huán)狀DNA1模板與dNTPs的摩爾濃度比為1 : 500時(shí),體系中RCA產(chǎn)物的含量達(dá)到最高。在dNTPs濃度較低時(shí),RCA反應(yīng)啟動(dòng)的數(shù)量受限,隨著dNTPs濃度的提高,RCA反應(yīng)啟動(dòng)的數(shù)量增加,體系中RCA產(chǎn)物的含量不斷增加,直至體系中環(huán)、引物和酶被充分利用。

    3.3 酶的影響

    聚合酶在整個(gè)RCA反應(yīng)中有著非常重要的作用,只有在聚合酶的作用下,才能啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)。而在 RCA反應(yīng)體系中,使用聚合酶的種類不同,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的影響也不盡相同28。隨著滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展,新型的聚合酶不斷地被發(fā)現(xiàn)使用。本文選用的phi29 DNA聚合酶,具有強(qiáng)大的鏈取代能力和高效的持續(xù)擴(kuò)增能力,可以克服拓?fù)浼s束并有效地形成單鏈DNA29。

    圖2 RCA產(chǎn)物的TEM圖Fig.2 TEM images of the RCA product.(a, b) TEM images of the RCA product at 30 min.

    圖3 dNTPs摩爾濃度對(duì)RCA產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of dNTPs molar concentration on RCA product.(a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of dNTPs; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of dNTPs; (c) The concentration of RCA product at different concentrations of dNTPs; (d) Comparison of analytical data for OD260/280 and OD260/230 at different concentrations of dNTPs. OD ratio represents the absorbance ratio.

    圖4 phi29 DNA聚合酶對(duì)RCA產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of phi29 DNA polymerase on RCA product.(a) The agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase;(b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of phi29 DNA polymerase;(c) Comparison of analytical data for OD260/280 and 260/230 at different concentrations of phi29 DNA polymerase.U indicates enzyme activity concentration.

    實(shí)驗(yàn)中加入不同濃度的phi29 DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng),考察酶的活性濃度對(duì)RCA產(chǎn)物長(zhǎng)度和濃度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)phi29 DNA聚合酶對(duì)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度并沒明顯的影響(圖4a),但對(duì)RCA產(chǎn)物的濃度影響顯著(圖4b),隨著酶濃度的提高,RCA產(chǎn)物的濃度先增大后減小。同時(shí),Nanodrop分析給出的OD260/280和OD260/230吸光度比值顯示(圖 4c),隨著酶濃度的提高,體系中 OD260/280的比值先接近1.8隨后降低,OD260/230的比值先接近2.0隨后降低,說明隨著酶濃度的增加,過量的酶影響了RCA產(chǎn)物的相對(duì)含量。酶濃度的增加(體系中蛋白含量逐漸增加),在環(huán)、引物和dNTPs的起始量相同的條件下,酶的加入量越多,在反應(yīng)最終結(jié)束時(shí),RCA產(chǎn)物的相對(duì)含量越低。而這對(duì)后續(xù)RCA產(chǎn)物的提純不利,因此在RCA反應(yīng)順利進(jìn)行的前提下可以降低酶的濃度,這樣既可保證體系的產(chǎn)率,又降低了經(jīng)濟(jì)成本。

    3.4 引物的影響

    為了考察引物對(duì)RCA產(chǎn)物的影響,設(shè)計(jì)相同反應(yīng)時(shí)間下引物濃度不同的實(shí)驗(yàn)。膠譜圖5a所示,RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度不隨引物濃度的改變而改變,產(chǎn)物的濃度隨引物濃度的提高而增加。由于引物的濃度決定了酶的附著位點(diǎn),也決定了RCA反應(yīng)引發(fā)的數(shù)量,繼而決定了RCA產(chǎn)物的濃度。圖5b所示,當(dāng)環(huán)狀DNA1模板與引物摩爾濃度比為1 : 1時(shí),RCA產(chǎn)物的濃度達(dá)到最高,再增加引物濃度RCA產(chǎn)物的濃度反而有所下降。Nanodrop分析給出的OD260/280和OD260/230吸光度的比值隨引物的增加而逐漸增大(圖 5c),至環(huán)狀 DNA1模板與引物摩爾濃度比為1 : 1時(shí),OD260/280的比值達(dá)到1.8左右,再增加引物反而影響了RCA產(chǎn)物的含量。因?yàn)殡S著引物的增加,酶的附著位點(diǎn)增多,引發(fā)的RCA反應(yīng)增多,體系中RCA產(chǎn)物的相對(duì)含量增加;同時(shí),附著位點(diǎn)的增加導(dǎo)致dNTPs的消耗量增加,游離的dNTPs等其它物質(zhì)的濃度降低,RCA產(chǎn)物的相對(duì)含量也不斷提高,但引物過多時(shí),反而由于多余的引物不能引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)而游離在體系中,致使體系中RCA產(chǎn)物的相對(duì)含量降低。

    4 結(jié) 論

    滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)是一種非常強(qiáng)大的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),不管在生物學(xué)應(yīng)用方面還是自組裝方面都有著非常廣泛的應(yīng)用,合理地控制RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度,可有助于我們估算出RCA產(chǎn)物重復(fù)單元的數(shù)量,通過化學(xué)計(jì)量的手段較為精確的計(jì)算出需要添加的互補(bǔ)鏈的數(shù)量,以提高組裝的效率。本文通過以上幾個(gè)考察因素的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)的前半個(gè)小時(shí),時(shí)間對(duì)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度影響顯著,半小時(shí)之后隨著時(shí)間的增加變化不再明顯。dNTPs的濃度對(duì)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度影響較大,增加dNTPs的濃度,RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度會(huì)不斷增長(zhǎng),至環(huán)狀模板:dNTPs的摩爾濃度比為1 : 250時(shí),RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度則不再發(fā)生改變。酶和引物濃度對(duì)RCA產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒有明顯的影響,而時(shí)間、dNTPs濃度、引物濃度和酶濃度對(duì)RCA產(chǎn)物的濃度和含量都有一定的影響,特別是dNTPs的濃度越高RCA產(chǎn)物的濃度和含量越高。因此,可以通過控制反應(yīng)的時(shí)間和dNTPs的濃度獲得所需長(zhǎng)度的RCA產(chǎn)物,通過合理調(diào)控酶和引物的濃度控制產(chǎn)物的濃度和含量,進(jìn)行組裝體的搭建和功能性的材料的制備,這既有利于后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行又降低了費(fèi)用。

    圖5 引物對(duì)RCA產(chǎn)物的影響Fig.5 Effect of the primer concentration on RCA product.(a) An agarose gel (0.6%) electrophoresis of RCA product at different concentrations of primer; (b) The UV-Vis spectra of RCA product at different concentrations of primer; (c) Comparison of analytical data for 260/280 and 260/230 at different concentrations of primer.

    (1) Ali, M. M.; Li, F.; Zhang, Z. Q.; Zhang, K. X.; Kang, D.; Ankrum, J.A.; Le, X. C.; Zhao, W. A. Chem. Soc. Rev. 2014, 43, 3324.doi: 10.1039/c3cs60439j

    (2) Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97 (24), 10243.doi: 10.1007/s00253-013-5290-2

    (3) Konry, T.; Smolina, I.; Yarmush, J. M.; Irimia, D.; Yarmush, M. L.Small 2011, 7 (3), 395. doi: 10.1002/smll.201001620

    (4) Deng, Z. X.; Tian, Y.; Lee, S. H.; Ribbe, A. E.; Mao. C. D. Angew.Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3582. doi: 10.1002/anie.200463096

    (5) Wilner, O. I.; Shimron, S.; Weizmann, Y.; Wang, Z. G.; Willner, I.Nano Lett. 2009, 9 (5), 2040. doi: 10.1021/nl900302z

    (6) Hamblin, G. D.; Carneiro, K. M. M.; Fakhoury, J. F.; Bujold, K. E.;Sleiman, H. F. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134 (6), 2888.doi: 10.1021/ja2107492

    (7) Ouyang, X. Y.; Li, J.; Liu, H. J.; Zhao, B.; Yan, J.; Ma, Y. Z.; Xiao,S. J.; Song, S. P.; Huang, Q.; Jie Chao, J.; Fan, C. H. Small 2013, 9(18), 3082. doi: 10.1002/smll.201300458

    (8) Yan, J.; Hu, C. Y.; Wang, P.; Liu, R.; Zuo, X. L.; Liu, X. W.; Song,S. P.; Fan, C. H.; He, D. N.; Sun, G. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6 (22), 20372. doi: 10.1021/am505913d

    (9) Linck, L.; Rei?, E.; Bier, F.; Resch-Genger, U. Anal. Methods 2012,4, 1215. doi: 10.1039/c2ay05760c

    (10) Xue, Q. W.; Wang, Z. G.; Wang, L.; Jiang, W. Bioconjug.Chem. 2012, 23 (4), 734. doi: 10.1021/bc200537g

    (11) Akter, F.; Mie, M.; Grimm, S.; Nygren, P. ?.; Kobatake, E.Anal. Chem. 2012, 84 (11), 5040. doi: 10.1021/ac300708r

    (12) Zhu, Y.; Wang, H. J.; Wang, L.; Zhu, J.; Jiang, W. ACS Appl.Mater. Interfaces 2016, 8 (4), 2573.doi: 10.1021/acsami.5b10285

    (13) Zhao, W. A.; Cui, C. H.; Bose, S.; Guo, D.; Shen, C.; Wong,W. P.; Halvorsen, K.; Farokhzad, O. C.; Teo, G. S. L.; Philips,J.; Dorfman, D. M.; Karnik, R.; Karp, J. M. Proc. Natl. Acad.Sci. (USA) 2012, 109, 19626. doi: 10.1073/pnas.1211234109

    (14) Chen, G.; Liu, D.; He, C. B.; Gannett, T. R.; Lin, W. B.;Weizmann, Y. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137 (11), 3844.doi: 10.1021/ja512665z

    (15) Zhang, Z. Q.; Ali, M. M.; Eckert, M. A.; Kang, D. K.; Chen,Y. Y.; Sender, L. S.; Fruman, D. A.; Zhao, W. A.Biomaterials 2013, 34, 9728.doi: 10.1016/j.biomaterials.2013.08.079

    (16) Zhao, W. A.; Gao, Y.; Kandadai, S. A.; Brook, M. A.; Li, Y.F. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2409.doi: 10.1002/anie.200600061

    (17) Wu, Z. S.; Zhou, H.; Zhang, S. B.; Shen, G. L.; Yu, R. Q.Anal. Chem. 2010, 82 (6), 2282. doi: 10.1021/ac902400n

    (18) Kim, J. H.; Jang, M.; Kim, Y. J.; Ahn, H. J. J. Med. Chem.2015, 58 (19), 7863. doi: 10.1021/acs.jmedchem.5b01126

    (19) Ye, T.; Chen, J. Y.; Liu, Y. F.; Ji, X. H.; Zhou, G. H.; He, Z.K. ACS Appl. Mater. Interfaces 2014, 6 (18), 16091.doi: 10.1021/am504035a

    (20) Chen, A. Y.; Ma, S. Y.; Zhou, Y.; Chai, Y. Q.; Yuan, R. Anal.Chem. 2016, 88 (6), 3203.doi: 10.1021/acs.analchem.5b04578

    (21) Ruff, L. E.; Marciniak, J. Y.; Sanchez, A. B.; Esener, S. C.;Messmer, B. T. Nanotechnol. Rev. 2014, 3, 569.doi: 10.1515/ntrev-2014-0010

    (22) Liu, D. Y.; Daubendiek, S. L.; Zillman, M. A.; Ryan, K.; Kool,E. T. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118 (7), 1587.doi: 10.1021/ja952786k

    (23) Zhu, G. Z.; Hu, R.; Zhao, Z. L.; Chen, Z.; Zhang, X. B.; Tan,W. H. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135 (44), 16438.doi: 10.1021/ja406115e

    (24) Lieberman, K. R.; Cherf, G. M.; Doody, M. J.; Olasagasti, F.;Kolodji, Y.; Akeson, M. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132 (50),17961. doi: 10.1021/ja1087612

    (25) Lu, J.; Chen, Y. H.; Liu, D. M.; Ren, W.; Lu, Y. Q.; Shi, Y.;Piper, J.; Paulsen, I.; Jin. D. Y. Anal. Chem. 2015, 87, 10406.doi: 10.1021/acs.analchem.5b02523

    (26) Chen, X. Q.; Ye, Y.; Cheng, H.; Jiang, Y. W.; Wu, Y. J. Agric.Food Chem. 2009, 57, 5795. doi: 10.1021/jf9007696

    (27) Bajaj, A.; Kondaiah, P.; Bhattacharya, S. Biomacromolecules 2008, 9, 991. doi: 10.1021/bm700930y

    (28) Mohsen, M. G.; Kool. E. T. Acc. Chem. Res. 2016, 49 (11),2540. doi: 10.1021/acs.accounts.6b00417

    (29) Lin, C. X.; Wang, X.; Liu, Y.; Seeman, N. C.; Yan, H. J. Am.Chem. Soc. 2007, 129, 14475. doi: 10.1021/ja0760980

    Study on the Synthesis of DNA via Rolling Circle Amplification

    LIU Shu-Zhen ZHANG Zhi-Qing*WANG Fang ZHOU Ting WANG Xiu-Feng ZHANG Gou-Dong LIU Ting-Ting ZHANG Hong-Zhi
    (School of Science, China University of Petroleum (East China), Qingdao 266580, Shandong Province, P. R. China)

    Rolling circle amplification (RCA) is a simple and efficient isothermal enzymatic reaction,which has developed as a novel technology in the field of nucleic acid amplification. Its product has a wide range of applications in the assembly and preparation of multi-functional materials. Here, we report the effects of reaction time and the concentrations of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs),polymerase, and primer on the product of RCA. The RCA product was characterized by methods including agarose gel electrophoresis, ultraviolet spectroscopy, and transmission electron microscopy (TEM). The results showed that the length of the RCA product was significantly affected by the reaction time,especially when the reaction time was less than 30 min. With an increase of dNTPs concentrations, the concentration and chain length of the RCA product increased. However, while the concentrations of enzyme and primer had little effect on the length of the RCA product, they had a large effect on its concentration. It is worth noting that the content of the RCA product decreased significantly in the presence of excess enzyme concentration.

    Rolling circle amplification; Nucleic acid; dNTPs; Polymerase; Primer

    March 29, 2017; Revised: May 2, 2017; Published online: May 10, 2017.

    O648

    10.3866/PKU.WHXB201750105 www.whxb.pku.edu.cn

    *Corresponding author. Email: zhangzq@upc.edu.cn; Tel: +86-532-86984568.

    The project was supported by the Scientific Research Foundation for Returned Overseas Chinese Scholars (2014010615), National Natural Science Foundation of China (21603276, 21303267), Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2016BL14), and Fundamental Research Funds for the Central Universities, China.

    教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(2014010615), 國(guó)家自然科學(xué)青年基金(21603276, 21303267), 山東省自然科學(xué)基金(ZR2016BL14), 中央高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目

    ? Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica

    猜你喜歡
    瓊脂糖比值產(chǎn)物
    低共熔溶劑在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用
    基于膠原-瓊脂糖的組織工程表皮替代物構(gòu)建研究
    《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》青年編委會(huì)
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    比值遙感蝕變信息提取及閾值確定(插圖)
    河北遙感(2017年2期)2017-08-07 14:49:00
    瓊脂糖以及高分辨率瓊脂糖制備方法研究進(jìn)展*
    廣州化工(2016年11期)2016-09-02 00:42:59
    不同應(yīng)變率比值計(jì)算方法在甲狀腺惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用
    雙電機(jī)比值聯(lián)動(dòng)控制系統(tǒng)
    遠(yuǎn)志水解產(chǎn)物的分離及鑒定
    免费观看人在逋| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产高清视频在线播放一区| 精品国内亚洲2022精品成人| 可以在线观看的亚洲视频| 免费高清视频大片| 日韩欧美国产一区二区入口| xxxwww97欧美| 亚洲av电影在线进入| 美女免费视频网站| 手机成人av网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99riav亚洲国产免费| 国产精品av久久久久免费| 亚洲,欧美精品.| 日本与韩国留学比较| 国产伦精品一区二区三区四那| x7x7x7水蜜桃| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久这里只有精品19| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费av不卡在线播放| 老司机福利观看| 日韩欧美免费精品| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕久久专区| 国产亚洲欧美98| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 一级毛片精品| e午夜精品久久久久久久| 性色avwww在线观看| 香蕉丝袜av| 97超视频在线观看视频| 午夜免费成人在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av天堂中文字幕网| 国产av麻豆久久久久久久| 国产淫片久久久久久久久 | 舔av片在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 校园春色视频在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 久久天堂一区二区三区四区| 国产野战对白在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 精品人妻1区二区| 九九在线视频观看精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 怎么达到女性高潮| 国产成人欧美在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 99riav亚洲国产免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久中文字幕人妻熟女| 变态另类丝袜制服| 美女黄网站色视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av成人精品一区久久| 国产日本99.免费观看| 日韩高清综合在线| 亚洲黑人精品在线| 久久久久久国产a免费观看| 一进一出好大好爽视频| 国产野战对白在线观看| 午夜视频精品福利| 精品国产亚洲在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久久久久久中文| 国产精品野战在线观看| 亚洲黑人精品在线| 成人一区二区视频在线观看| aaaaa片日本免费| 毛片女人毛片| 一本久久中文字幕| 精品久久久久久久末码| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美午夜高清在线| 免费看a级黄色片| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美成人性av电影在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 日韩大尺度精品在线看网址| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美一级毛片孕妇| 国产视频内射| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久性生活片| 亚洲人成电影免费在线| 欧美在线一区亚洲| 18禁观看日本| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久香蕉精品热| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜日韩欧美国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产色片| 禁无遮挡网站| 我要搜黄色片| 亚洲中文av在线| 久久久久久久久久黄片| 国产精品一及| 国产不卡一卡二| 丁香欧美五月| 久久人人精品亚洲av| 色在线成人网| 日韩欧美精品v在线| 国产高清激情床上av| 午夜免费成人在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 熟女电影av网| 女同久久另类99精品国产91| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一区二区三区高清视频在线| 身体一侧抽搐| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产乱人视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲成人久久性| 999精品在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产三级在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲av美国av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 九色成人免费人妻av| 色综合站精品国产| 国产高清有码在线观看视频| 欧美在线一区亚洲| a在线观看视频网站| 香蕉国产在线看| 久久久国产成人免费| 美女高潮的动态| 免费在线观看成人毛片| 少妇的丰满在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美一级毛片孕妇| 欧美中文综合在线视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美乱码精品一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 一区二区三区国产精品乱码| 一本精品99久久精品77| 久久国产精品人妻蜜桃| 色综合婷婷激情| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 不卡av一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91老司机精品| 国产美女午夜福利| 男女午夜视频在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产成人精品无人区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久国内视频| 后天国语完整版免费观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产一区二区三区视频了| www.自偷自拍.com| 国产三级在线视频| 成人三级黄色视频| 99re在线观看精品视频| 黄色女人牲交| 床上黄色一级片| 免费大片18禁| 一进一出好大好爽视频| www.自偷自拍.com| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜福利免费观看在线| 视频区欧美日本亚洲| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精华一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 两性夫妻黄色片| 在线免费观看不下载黄p国产 | 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 嫩草影院精品99| 宅男免费午夜| 久久中文看片网| 村上凉子中文字幕在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产成人精品无人区| 国产三级黄色录像| 成在线人永久免费视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91久久精品国产一区二区成人 | 亚洲真实伦在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品色激情综合| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品av久久久久免费| 欧美在线一区亚洲| 真人一进一出gif抽搐免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美国产日韩亚洲一区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成年版毛片免费区| 两个人的视频大全免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲国产精品999在线| 免费av毛片视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩欧美三级三区| 十八禁网站免费在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美在线一区亚洲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 人妻久久中文字幕网| 成人一区二区视频在线观看| av福利片在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 婷婷六月久久综合丁香| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲av熟女| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 中文资源天堂在线| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利在线在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 男女之事视频高清在线观看| 麻豆国产av国片精品| 久久草成人影院| 怎么达到女性高潮| 色老头精品视频在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲自拍偷在线| 久久精品国产清高在天天线| 欧美日韩乱码在线| 高清毛片免费观看视频网站| 成人三级做爰电影| 一级毛片高清免费大全| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久99热这里只有精品18| 日本 欧美在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产三级在线视频| 香蕉丝袜av| 亚洲成av人片免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 午夜激情福利司机影院| 午夜成年电影在线免费观看| 韩国av一区二区三区四区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 少妇丰满av| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | av天堂在线播放| 亚洲av成人av| 18美女黄网站色大片免费观看| x7x7x7水蜜桃| 免费在线观看日本一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 91av网一区二区| 久久久国产精品麻豆| 最近在线观看免费完整版| 亚洲国产精品久久男人天堂| 91九色精品人成在线观看| 午夜福利高清视频| 五月玫瑰六月丁香| 免费搜索国产男女视频| 色av中文字幕| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 中亚洲国语对白在线视频| 久久草成人影院| 国产免费男女视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲中文av在线| 精品欧美国产一区二区三| 久久伊人香网站| 757午夜福利合集在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲激情在线av| 久久久成人免费电影| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲成av人片免费观看| 成人18禁在线播放| 欧美高清成人免费视频www| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人影院久久av| 黄色丝袜av网址大全| 欧美精品啪啪一区二区三区| 91av网一区二区| 嫩草影院精品99| 国产日本99.免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲美女视频黄频| 免费搜索国产男女视频| 成人三级做爰电影| 久久久久免费精品人妻一区二区| av中文乱码字幕在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产麻豆成人av免费视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 在线观看66精品国产| 最新中文字幕久久久久 | 成人性生交大片免费视频hd| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品一区二区精品视频观看| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品女同一区二区软件 | 禁无遮挡网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品亚洲美女久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99精品欧美一区二区三区四区| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国产不卡一卡二| 亚洲精华国产精华精| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品av视频在线免费观看| 十八禁人妻一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩精品青青久久久久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲av片天天在线观看| 午夜免费成人在线视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 很黄的视频免费| 欧美日本视频| 欧美又色又爽又黄视频| 偷拍熟女少妇极品色| 中出人妻视频一区二区| 成人国产综合亚洲| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品永久免费网站| 精品福利观看| 国产av不卡久久| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩欧美在线乱码| 亚洲自拍偷在线| 成人午夜高清在线视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美三级亚洲精品| 国产午夜精品久久久久久| 国产97色在线日韩免费| 精品福利观看| 97超视频在线观看视频| bbb黄色大片| 搞女人的毛片| 久久99热这里只有精品18| 黄色片一级片一级黄色片| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美成人性av电影在线观看| 久久伊人香网站| 两个人的视频大全免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产视频内射| av福利片在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日本熟妇午夜| 亚洲av免费在线观看| 99久久国产精品久久久| 757午夜福利合集在线观看| 在线永久观看黄色视频| 精品一区二区三区视频在线 | 中文字幕av在线有码专区| 99re在线观看精品视频| 久久久国产成人免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 亚洲欧美激情综合另类| 精品福利观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 俄罗斯特黄特色一大片| 伦理电影免费视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲成av人片在线播放无| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产真实乱freesex| 国产精品国产高清国产av| 久久久水蜜桃国产精品网| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品福利观看| or卡值多少钱| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜福利18| 久久九九热精品免费| 搞女人的毛片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲成人久久性| 天天躁日日操中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产免费av片在线观看野外av| aaaaa片日本免费| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久大精品| 天堂影院成人在线观看| 午夜影院日韩av| 久久久国产成人免费| 亚洲最大成人中文| 天堂√8在线中文| 国产高清videossex| 久久草成人影院| 精品国产亚洲在线| 51午夜福利影视在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产av在哪里看| 久久九九热精品免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 天堂动漫精品| 人妻久久中文字幕网| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美在线一区亚洲| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产成年人精品一区二区| 少妇的丰满在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久国内视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 日韩欧美在线二视频| 国产男靠女视频免费网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美黄色淫秽网站| 日本 欧美在线| 亚洲av片天天在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 两性夫妻黄色片| 国产激情偷乱视频一区二区| 最新中文字幕久久久久 | 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 91久久精品国产一区二区成人 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人性生交大片免费视频hd| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久人人精品亚洲av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩欧美在线乱码| 久久久久久久久久黄片| 久久久色成人| 一二三四在线观看免费中文在| 深夜精品福利| 中出人妻视频一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 叶爱在线成人免费视频播放| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 18禁观看日本| 午夜亚洲福利在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 日本五十路高清| 国产欧美日韩一区二区精品| 特级一级黄色大片| 亚洲熟妇熟女久久| 国产v大片淫在线免费观看| 97碰自拍视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美色视频一区免费| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产一区二区在线av高清观看| av黄色大香蕉| 悠悠久久av| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产主播在线观看一区二区| 久久久久性生活片| 国产精品一区二区精品视频观看| 偷拍熟女少妇极品色| 91老司机精品| 欧美黄色片欧美黄色片| x7x7x7水蜜桃| 一级黄色大片毛片| 国产午夜精品久久久久久| 中文在线观看免费www的网站| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 午夜福利免费观看在线| 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品一区av在线观看| 麻豆av在线久日| 又黄又粗又硬又大视频| 日韩欧美三级三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一区二区三区激情视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲av成人av| 99久久成人亚洲精品观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 青草久久国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美极品一区二区三区四区| 成年版毛片免费区| 美女黄网站色视频| 久久久久久国产a免费观看| 在线免费观看的www视频| 丰满的人妻完整版| 日日干狠狠操夜夜爽| 后天国语完整版免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品在线美女| 国产黄色小视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 国产高清激情床上av| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一区二区三区高清视频在线| 在线观看午夜福利视频| 搡老熟女国产l中国老女人| a级毛片a级免费在线| av黄色大香蕉| 久久这里只有精品中国| 亚洲成a人片在线一区二区| 91字幕亚洲| 国产成人系列免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品 国内视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久精品影院6| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久色成人| 香蕉久久夜色| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品久久久久久久久久久久久| 黄色女人牲交| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产欧美一区二区综合| 黄色日韩在线| 又大又爽又粗| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 中文字幕久久专区| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲片人在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产av在哪里看| 午夜免费激情av| 熟女电影av网| 国产精品精品国产色婷婷| netflix在线观看网站| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 麻豆国产av国片精品| 成人av一区二区三区在线看| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黄频高清免费视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲午夜理论影院| 精华霜和精华液先用哪个| www.精华液| 香蕉av资源在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲片人在线观看| 国产亚洲欧美98| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费在线观看成人毛片| 日本五十路高清| 亚洲欧美日韩高清专用|