夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對ASCI大鼠脊髓組織NMDA受體亞單位NR1蛋白表達的影響*

李曉寧，吳 磊，覃業(yè)校，梁雪松，單筱淳，梅繼林，李 諾

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對ASCI大鼠脊髓組織NMDA受體亞單位NR1蛋白表達的影響*

李曉寧1，吳 磊2，覃業(yè)校1，梁雪松2，單筱淳2，梅繼林2，李 諾2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

目的:觀察夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對急性脊髓損傷大鼠肢體運動功能評分及脊髓組織中N-甲基-D-天冬氨酸受體亞單位NR1蛋白表達的影響，探討夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍治療ASCI的作用機制。方法:將72只雌性Wistar大鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型組(ASCI)和夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍組(EA+MP)，又分為1天、3天、7天和14天4個亞組，每個亞組6只。NYU打擊器制備急性脊髓損傷大鼠模型。Sham組進行手術，不造模，術后常規(guī)飼養(yǎng);ASCI組造模后常規(guī)飼養(yǎng);EA+MP組造模后30 min，給予大鼠一次性注射甲基強的松龍30 mg/kg，術后3 h給予大鼠夾脊電針治療，每次30 min，每日1次。采用BBB評分觀察ASCI大鼠肢體運動功能，免疫組化法檢測各組大鼠脊髓組織NMDA-NR1蛋白表達。結(jié)果:與Sham組比較，ASCI組大鼠BBB評分顯著降低(P＜0.05);與ASCI組比較，經(jīng)夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍治療3天后，EA+MP組BBB評分顯著升高(P＜0.05)。與Sham組比較，ASCI組大鼠脊髓組織NMDA-NR1平均光密度值升高(P＜0.05);治療3天后，與ASCI組相比，EA+MP組大鼠脊髓組織NMDA-NR1平均光密度值降低(P＜0.05)。結(jié)論:急性脊髓損傷后大鼠脊髓組織NMDA-NR1明顯增高，夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍治療后NMDA-NR1顯著下調(diào)，可能是其改善ASCI大鼠肢體運動功能的機制之一。

急性脊髓損傷;夾脊電針;甲基強的松龍;N-甲基-D-天冬氨酸受體

繼發(fā)性損傷是急性脊髓損傷(ASCI)主要發(fā)病機制之一［1］，繼發(fā)性損傷因其作用時間持久、作用機制復雜，往往造成更嚴重的脊髓損傷。興奮性氨基酸毒性作用是ASCI繼發(fā)性損傷的重要機制之一［2］，ASCI后微環(huán)境中興奮性氨基酸大量聚集，谷氨酸作為遞質(zhì)釋放后激活N-甲基-D-天冬氨酸受體亞單位NR1(NMDA-NR1)，從而導致神經(jīng)細胞受損［3］。

ASCI目前臨床尚缺乏有效的治療手段，可供選擇的手術治療對嚴重的癱瘓沒有明顯的效果，藥物治療能夠針對患者不同的癥狀分別營養(yǎng)神經(jīng)、改善肌痙攣等，而神經(jīng)干細胞治療尚難以在臨床廣泛開展。臨床及實驗研究表明［4-7］，夾脊電針是治療脊髓損傷的有效方法之一，針刺夾脊穴能夠疏通督脈經(jīng)氣，而夾脊電針所形成的電場，能夠促進脊髓損傷后神經(jīng)細胞軸突再生。本研究擬從抑制ASCI后微環(huán)境中興奮性氨基酸及其受體的角度，觀察夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍治療對ASCI大鼠脊髓組織NMDA-NR1蛋白表達的影響，探討其治療ASCI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

將72只體質(zhì)量為(200±10)g的健康清潔級雌性Wistar大鼠(購自遼寧長生生物技術有限公司，動物飼養(yǎng)許可證號2015-0001)，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組(Sham)、模型組(ASCI)和夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍組(EA+MP)，每組又分為1天、3天、7天和14天4個亞組，每個亞組6只。按照課題組前期研究方法［8］，將符合模型制備成功標準的大鼠入組，保持室溫恒定，大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食水。實驗過程中對實驗大鼠的處置遵照《關于善待實驗動物的指導性意見》［9］中的相關規(guī)定。

1.2 試劑及儀器

山羊血清(SL2-10，中國，北京索萊寶科技有限公司);NMDA-NR1(BA0612，美國，博士德生物工程有限公司);生物素化山羊抗兔IgG(A0277，中國，上海碧云天生物技術有限公司);注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(H20030727，中國，國藥);NYU打擊器(Impactor Model-Ⅲ029，USA);電子脈沖治療儀(KWD-808-Ⅱ，中國，常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司);一次性無菌針灸針(0.35 mm×13 mm，中國，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 模型制備

實驗大鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，待大鼠完全麻醉后，固定于自制手術臺上，背部備皮常規(guī)消毒，以大鼠T10棘突為中點，后背正中行約3 cm的縱行切口，距離T10上下各約1.5 cm，用手術刀沿棘突兩旁切開皮下筋膜及肌肉組織，充分暴露T9～11棘突，用眼科手術鑷鈍性分離椎板和棘突上附著的肌肉組織，用眼科手術剪迅速剪斷T9～11棘突，將T10后部椎板去除，重復暴露脊髓組織，手術過程中注意觀察大鼠反應及脊髓形態(tài)，防止損傷脊髓。用NYU脊髓損傷打擊器制備 ASCI模型［8，10］:將大鼠四肢和脊柱用相應的固定裝置完全固定后，設置打擊器參數(shù)，高度為50 mm，打擊棒重量為10 g，迅速造成該段的急性脊髓中度損傷(50勢能)，打擊成功后打擊器會發(fā)出警報聲，電腦描記出相應的撞擊曲線，移開打擊棒可見大鼠硬脊膜充血。然后用生理鹽水沖洗傷口，分層縫合傷口，注意大鼠術后保暖，并從術后第2天開始每天輕柔擠壓大鼠膀胱2次，以協(xié)助大鼠排尿，防止形成尿潴留。

1.4 干預方法

1.4.1 假手術組(Sham) 僅進行手術，不造模，術后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.2 模型組(ASCI) 造模后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.3 夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍組(EA+MP)

按照課題組前期研究方法［8］，模型制備成功后給予夾脊電針和甲基強的松龍腹腔注射聯(lián)合治療，具體操作如下:甲基強的松龍治療:術后30 min時，給予實驗大鼠一次性注射甲基強的松龍(1.2 mg/ml)，按30 mg/kg劑量給予大鼠腹腔注射。夾脊電針治療:于模型制備成功后3 h給予實驗大鼠夾脊電針治療，將大鼠固定于自制鼠板上，選擇T9、T11節(jié)段夾脊穴，用0.35 mm×13 mm規(guī)格一次性無菌針灸針，直刺進針約4～5 mm，然后同側(cè)夾脊穴分別接電針儀，上正下負，選擇密波，頻率為100 Hz，電流大小以大鼠耐受為度，刺激時長為30 min/次·日-1，每日1次。

1.5 大鼠BBB運功功能評分

BBB評分［11］是目前使用最為廣泛的脊髓損傷大鼠肢體運動功能評分方法之一，在實驗操作過程中，選擇3名經(jīng)過培訓的實驗人員，每天早晨相同時間段將大鼠放置在固定大小的平臺上，3位實驗人員同時觀察各組大鼠的髖、膝、踝3個關節(jié)的活動情況，及大鼠活動時的協(xié)調(diào)性，分別給出分數(shù)，求其平均值，得出該實驗大鼠肢體運動功能評分分數(shù)。

1.6 免疫組化法檢測脊髓組織中NMDA-NR1蛋白表達

大鼠治療后，用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，大鼠完全麻醉后迅速斷頭處死，取出以損傷點為中心的一段長度約為4 cm的脊髓組織，置于4%多聚甲醛緩沖液中固定，4℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽涫炃衅?，層? μm。免疫組化:取制備好的石蠟切片，經(jīng)過梯度酒精脫蠟至水，微波爐中對組織進行抗原修復10 min，分別加入一抗和二抗孵育，PBS完全漂洗后分別加入辣根酶標記，并進行DAB顯色，每張組織切片選取5個高倍鏡下視野(400×)采集圖像，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對有陽性表達的組織切片圖像進行平均光密度(density mean)測定并計算每張切片的平均值，記錄各組數(shù)據(jù)進行分析。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 實驗結(jié)果

2.1 夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對ASCI大鼠肢體運動功能評分的影響

BBB評分結(jié)果顯示，假手術組(Sham)大鼠肢體運動功能評分正常，模型組(ASCI)大鼠肢體運動功能評分較假手術組(Sham)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。治療3天后，夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍組(EA+MP)大鼠肢體運動功能評分升高，與模型組(ASCI)比較差異顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠運動功能評分比較(±s，6只鼠/組)

表1 各組大鼠運動功能評分比較(±s，6只鼠/組)

注:與 Sham 組比較，#P ＜0.05;與 ASCI組比較，*P ＜0.05

1 d 3 d 7 d 14 d Sham 組 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00 21.00 ±0.00組別ASCI組 1.08 ±0.22# 1.12 ±0.15# 2.36 ±0.27# 4.25 ±1.02#EA+MP 組 1.26 ±0.15# 3.66 ±1.52#*6.74 ±0.72#* 12.05 ±1.62#*

2.2 夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對 ASCI大鼠NMDA-NR1蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，NMDA-NR1主要表達于胞漿。模型組(ASCI)NMDA-NR1平均光密度值升高，且3天時達到高峰，此后逐漸下降，術后各時間點與假手術組(Sham)比較差異顯著(P＜0.05)。治療3天后，與模型組(ASCI)相比，夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍組(EA+MP)NMDA-NR1平均光密度值降低，差異顯著(P＜0.05)。見表2、封三彩圖1。

表2 各組大鼠NMDA-NR1的表達(IOD/AREA 10-3，±s)

表2 各組大鼠NMDA-NR1的表達(IOD/AREA 10-3，±s)

注:與 Sham 組比較，#P ＜0.05;與 ASCI組比較，*P ＜0.05

6 2.39 ±0.79 2.28 ±0.71 2.26 ±1.25 2.09 ±0.76 ASCI組 6 7.73 ±1.02#20.38 ±3.82#16.78 ±2.94# 9.14 ±1.27#EA+MP 組 6 7.29 ±1.91#13.95 ±2.99#*6.47 ±2.43#* 2.47 ±1.90#*1 d 3 d 7 d 14 d Sham組組別 n

3 討論

急性脊髓損傷屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學“痿證”范疇，可由督脈受損所致，督脈為人體陽氣之海，督脈受損則陰陽和氣血失調(diào)，陽氣和氣血無法到達肢體遠端，日久而致肢體萎軟無力。督脈附近有足太陽膀胱經(jīng)，該經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，對調(diào)節(jié)人體氣血盛衰具有重要作用，夾脊穴內(nèi)夾督脈，外循膀胱，針刺可以通調(diào)一身之陽氣和氣血。夾脊電針則是在針刺夾脊穴的基礎上通以脈沖電流，在受損脊髓節(jié)段形成電場，使神經(jīng)細胞的軸突沿著電場方向再生。本課題組前期研究已證實夾脊電針治療脊髓損傷的有效性［12］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，夾脊電針治療能夠提高脊髓損傷患者治療前后ASIA和改良的Barthel指數(shù)量表評分，降低Ashworth指數(shù)量表評分，從而改善脊髓損傷患者日常生活活動能力，并改善肌痙攣。

神經(jīng)細胞微環(huán)境中適量濃度的興奮性氨基酸對維持細胞正常的生理功能起著重要作用，谷氨酸(Glu)即是一種常見的興奮性氨基酸。在正常情況下，谷氨酸釋放后能夠激活其受體NMDAR，NMDA受體具有調(diào)節(jié)突觸傳遞、突觸可塑性及長時程突觸增強形成［13］的功能，其對鈣離子高度通透，因此推測該受體在谷氨酸引起的興奮性毒性作用中具有重要地位。當脊髓損傷后，組織缺血缺氧，突觸間隙中谷氨酸濃度升高，谷氨酸激活NMDA受體增加細胞膜的通透性，并且能夠通過使細胞外的Ca2+大量內(nèi)流，激活其下游一系列蛋白酶，引起神經(jīng)細胞腫脹和壞死，使脊髓損傷進一步加重。王建設等［14］研究發(fā)現(xiàn)，ASCI后大鼠脊髓背角淺層存在NR-1高表達，可能參與了ASCI后多種病理過程的發(fā)生、發(fā)展。曹曉建等［15］發(fā)現(xiàn)，NR-1在正常大鼠組織中幾乎不表達，而在ASCI大鼠中大量表達。由此可見，NMDA-NR1的異常表達參與了脊髓繼發(fā)性損傷的發(fā)生，夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍治療脊髓損傷臨床療效確切，其是否通過調(diào)控脊髓損傷后NMDA-NR1的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用尚有待闡明，本研究結(jié)果顯示，Sham組可見少量NMDA-NR1表達;ASCI組NMDA-NR1蛋白表達較Sham組增加，差異顯著(P＜0.05)，造模后3天達到表達高峰，此后開始逐漸下降，可能是由于內(nèi)源性保護機制被激活。EA+MP組治療3天后，NMDA-NR1蛋白表達明顯低于ASCI組(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，脊髓損傷后NMDA-NR1蛋白表達增加，而給予EA+MP治療后可以抑制脊髓損傷后NMDA-NR1蛋白表達，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，促進肢體運動功能恢復，這一結(jié)果與BBB評分相一致。

綜上所述，夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍治療可以顯著抑制因急性脊髓損傷導致的NMDA-NR1蛋白過度表達，從而減輕微環(huán)境中興奮性氨基酸毒性，這可能是其改善ASCI大鼠肢體運動功能的作用機制之一。

［1］孫祥耀，海涌.脊髓損傷非手術治療的研究進展［J］.中國骨與關節(jié)雜志，2016，5(6):437-443

［2］王詩軍，李鈺婷，李淳德.脊髓繼發(fā)性損傷后細胞因子的表達及其對細胞凋亡的作用［J］.中國骨與關節(jié)雜志，2016，5(6):432-437

［3］趙然，宋春陽，王會新，等.丹參與脊髓損傷后神經(jīng)元自我修復機制的實驗研究［J］.中國藥物與臨床，2016，16(9):1280-1282

［4］李曉寧，吳磊，梅繼林，等.夾脊電針聯(lián)合甲強龍對急性脊髓損傷大鼠肢體運動功能及尼氏小體影響的實驗研究［J］.針灸臨床雜志，2016，32(12):61-91

［5］李佳諾，孫忠人，郭玉懷，等.電針對脊髓損傷大鼠相關因素影響的實驗研究進展［J］.針灸臨床雜志，2016，32(5):81-84

［6］李曉寧，梁雪松，遲蕾，等.夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍對大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡表達的實驗研究［J］.中醫(yī)藥信息，2017，34(1):92-95

［7］呂威，李志剛，姚海江，等.針灸治療脊髓損傷的臨床研究進展［J］.中國康復理論與實踐，2015，21(12):1411-1414

［8］李曉寧，吳磊，遲蕾，等.不同治療周期夾脊電針對急性脊髓損傷大鼠運動功能及細胞凋亡的影響［J］.針刺研究，2016，41(6):492-496

［9］科學技術部.關于發(fā)布《關于善待實驗動物的指導性意見》的通知［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007，12(4):35-36

［10］Alvarez-Mejia L，Morales J.Functional recovery in spinal cord injured rats using polypyrrole/iodine implants and treadmill training［J］.J Mater Sci Mater Med，2015，26(7):209

［11］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight drop device versus transection［J］.Exp Neurol，1996，139(2):244-56

［12］霍會霞.頭電針配合夾脊電針治療脊髓損傷后下肢運動功能障礙的臨床觀察［D］.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學，2014

［13］Perez-Otano I，Ehlers MD.Learning from NMDA receptor trafficking:clues to the development and maturation of glutamatergic synapses［J］.Neurosignals，2004，13(4):175-189

［14］王建設，叢靜，謝永剛.脊髓損傷后慢性中樞性疼痛大鼠脊髓背角淺層組織NR-1 表達及意義［J］.山東醫(yī)藥，2016，56(18):40-41

［15］曹曉建，湯長華，羅永湘.神經(jīng)生長因子對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元N-甲基D-天門冬氨酸受體的影響［J］.南京醫(yī)科大學學報，2002，22(1):1-3

Protein Expression of NMDA-NR1 in Spinal Cord Tissue of ASCI Rats Intervened by Jiaji Electro-acupuncture Combined with Methylprednisolone

LI Xiao-ning1，WU Lei2，QIN Ye-xiao1，LIANG Xue-song2，SHAN Xiao-chun2，MEI Ji-lin2，LI Nuo2
(1.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150001，China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To observe the effect of Jiaji electro-acupuncture combined with Methylprednisolone on the scores of limb motor function and the expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR1(NMDAR-NR1)of spinal cord tissue in ASCI(acute spinal cord injury)rats，and to explore the mechanism of this therapy for ASCT.Methods:72 Wistar rats(male)were randomly divided into the sham group(group A，n=24)，the model group(group B，n=24)，and Jiaji electro-acupuncture combined with Methylprednisolone group(group C，n=24);each group was subdivided into four subgroups according to 1 d，3 d，7 d and 14 d，with 6 rats in each group.ASCI models were established with NYU striker.The rats in group A were applied with sham operation without modeling followed by conventional breeding;the rats in group B were modeled followed by conventional breeding;whereas，the rats in group C were given one-time injection of Methylprednisolone(30 mg/kg)30min after modeling，Jiaji electro-acupuncture was applied 3h after the surgery(30 min/time，once per day).The limb motor function was observed by evaluating the scores of BBB，and the expression of NMDA-NR1 was detected by immunohistochemistry.Results:In term of scores of BBB，it was significantly reduced in group B than that in group A(P ＜0.05);however，it was remarkably increased after three-day treatment in group C compared to that in group B(P ＜0.05).In terms of NMDA-NR1 expression，it was significantly increased in group B compared to that in group A(P ＜0.05);but it was obviously decreased after three-day treatment in group C compared to that in group B(P ＜0.05).Conclusion:NMDA-NR1 may significantly increased in ASCI rats，and the therapy of Jiaji electro-acupuncture combined with Methylprednisolone can down-regulate NMDA-NR1，which may be one of its mechanisms to improve limb motor function in ASCI rats.

Acute spinal cord injury;Jiaji electro-acupuncture;Methylprednisolone;NMDAR

R246.2

A

1005-0779(2017)10-0060-04

國家自然科學基金項目，編號:81373715;哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目科技創(chuàng)新人才類(優(yōu)秀學科帶頭人B類)項目，編號:2016RAXYJ090。

李曉寧(1969-)，女，教授，博士研究生導師，研究方向:針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

2017-05-15