頭穴透刺對MCAO/R大鼠缺血腦組織NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)的影響*

吳明娟，孫曉偉，盧金榮，沙麗麗，張 雪，趙 巖，李 銳，程康陸，萬 琎

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150036;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

頭穴透刺對MCAO/R大鼠缺血腦組織NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)的影響*

吳明娟1，孫曉偉2△，盧金榮3，沙麗麗1，張 雪1，趙 巖1，李 銳1，程康陸1，萬 琎1

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150036;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

目的:探討頭穴透刺對腦缺血再灌注大鼠核轉(zhuǎn)錄因子 -κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)表達(dá)的影響。方法:70只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和頭針組。線栓大鼠右側(cè)大腦中動脈制備局灶性大腦中動脈缺血再灌注(MCAO/R)動物模型。頭針組大鼠采用透刺法針刺右側(cè)百會、曲鬢穴。神經(jīng)功能評分檢測各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損程度;免疫組化法檢測缺血腦組織NF-κB、TNF-α蛋白的定性表達(dá)情況;Western blot和ELISA法分別檢測缺血腦組織NF-κB、TNF-α蛋白的定量表達(dá)情況。結(jié)果:頭針組大鼠神經(jīng)功能缺損程度較模型組減輕，再灌注3天、7天，mNSS評分與同期模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。模型組和頭針組大鼠不同時間點缺血腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白含量均較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05);但頭針組大鼠缺血腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白含量均較同時間點模型組明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:頭穴透刺可明顯改善腦缺血再灌注后大鼠的神經(jīng)功能缺損，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機制可能與抑制腦缺血再灌注后缺血腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)、降低缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

頭穴透刺;百會;曲鬢;腦缺血再灌注損傷;核轉(zhuǎn)錄因子-κB;腫瘤壞死因子-α

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是一個較為復(fù)雜的過程，包括腦組織異常代謝、能量供應(yīng)障礙、自由基生成、腦組織炎性反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)。其中腦組織炎癥級聯(lián)反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機制之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路與炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)［1］。因此，本研究以此為切入點，通過復(fù)制大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血2 h再灌注模型，旨在觀察頭穴透刺對大鼠腦缺血再灌注后炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用的NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)的影響，從而探討頭穴透刺對腦缺血再灌注損傷的可能神經(jīng)保護(hù)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

取清潔級雄性 SD大鼠70只，體質(zhì)量(250±30)g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物許可證:SCXK(黑)2013-0027，隨機分成3組，分別為假手術(shù)組(10只)、模型組(30只)和頭針組(30只)。模型組與頭針組再根據(jù)缺血2 h再灌注后的時間不同分為3個亞組(再灌注后1天、再灌注后3天、再灌注后7 天:IR1 d、IR3 d、IR7 d)，每個亞組10 只大鼠。

1.2 模型的建立

模型組與頭針組采用改良的 Zea Longa線栓法［2］，制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血2 h再灌注模型(栓塞2 h后拔出栓子，恢復(fù)血流供應(yīng)，實現(xiàn)再灌注);假手術(shù)組僅將線栓插入12 mm，并不中斷大腦中動脈的血流。

1.3 各組干預(yù)方法

大鼠清醒后的頭針組予以百會透曲鬢針刺治療，穴位選擇參考《實驗動物穴位圖譜》，取患側(cè)百會穴及曲鬢穴，進(jìn)針深度約為0.8寸，給予每分鐘200轉(zhuǎn)以上速度進(jìn)行捻轉(zhuǎn)，持續(xù)捻轉(zhuǎn)5 min，每間隔5 min捻轉(zhuǎn)1次，留針時間為30 min。為確保假手術(shù)組和模型組大鼠與頭針組大鼠的飼養(yǎng)條件相同，兩組大鼠每天也要在頭針組治療時間抓取并固定1次(30 min/次)。

1.4 行為學(xué)檢測

各組大鼠采用mNSS評分［3］，在腦缺血2 h再灌注后1天、3天、7天進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分的測定，mNSS評分共18分，分值越高神經(jīng)功能缺損程度越重。

1.5 免疫組化檢測

各組5只大鼠在再灌注后相應(yīng)時間點，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，主動脈依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，斷頭取腦后，制成4 um的石蠟切片。將石蠟切片進(jìn)行脫蠟，脫水，抗原修復(fù)，雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉內(nèi)源性抗原，加入一抗(兔抗NF-κB 抗體1∶500、兔抗 TNF-α 抗體1∶500)4°孵育過夜，次日二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素染核，酒精梯度透明，封片，鏡檢。

1.6 Western blot檢測

各組5只大鼠在再灌注后相應(yīng)時間點，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭取腦。將腦組織進(jìn)行蛋白抽提，BCA法蛋白定量。根據(jù)NF-κB蛋白的分子量，配置12%和8%的分離膠，濃縮膠濃度為5%。NF-κB蛋白的上樣量是每孔10 ug。SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)，3%BSA-TBST中室溫封閉30 min，一抗(兔抗NF-κB抗體1∶500)4°孵育過夜，二抗［羊抗兔IgG(H+L)HRP，1∶10000］，室溫輕搖40 min。ECL 加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光，顯影2 min，定影，膠片掃描。

1.7 ELISA 檢測

各組大鼠在再灌注后相應(yīng)時間點，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，于心尖搏動處抽取適量血液，室溫靜置30 min，離心取上清液，參照TNF-α ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行TNF-α蛋白含量的定量檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組大鼠mNSS評分測定結(jié)果

假手術(shù)組大鼠沒有表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損。模型組和頭針組大鼠在造模后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，與假手術(shù)組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。模型組大鼠隨著再灌注時間的延長，神經(jīng)功能缺損有所恢復(fù):其中再灌注1天，mNSS評分最高;再灌注3天，mNSS評分有所減低;至再灌注7天，mNSS評分持續(xù)降低。而頭針組大鼠神經(jīng)功能缺損程度均較模型組減輕，mNSS評分均較同期模型組降低，且隨著針刺治療次數(shù)的增多和治療時間的延長，在再灌注3天、7天，mNSS評分與同期模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠mNSS評分比較(±s，分)

表1 不同時間點各組大鼠mNSS評分比較(±s，分)

注:與假手術(shù)組比較，☆P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手術(shù)組組別 例數(shù)10 0 0 0模型組 10 9.8 ±1.1☆ 8.9 ±1.2☆ 8.1 ±1.1☆頭針組 10 9.5 ±1.0☆ 7.8 ±1.0☆△ 6.8 ±0.9☆△

2.2 不同時間點各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB免疫組化染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)僅見少量NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)。模型組NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)增加，主要表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿及胞膜中，其中再灌注3天表達(dá)增加最為明顯。頭針組也可見NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)，但各時間點較模型組表達(dá)均明顯減少(P＜0.05)。見封三彩圖1、表2。

表2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，☆P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d組別 例數(shù)假手術(shù)組5 25.77 ±1.25 25.38 ±0.79 26.06 ±1.12模型組 5 42.31 ±1.68☆ 64.38 ±1.62☆ 50.41 ±1.12☆頭針組 5 38.34 ±0.68☆△52.52 ±1.72☆△ 35.85 ±1.61☆△

2.3 不同時間點各組大鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α免疫組化染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)僅見少量TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)。模型組TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)增加，主要表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿及胞膜中，其中再灌注3天表達(dá)增加最為明顯。頭針組也可見TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)，但各時間點較模型組表達(dá)均明顯減少(P＜0.05)。見封三彩圖2、表3。

表3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

表3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，☆P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手術(shù)組組別 例數(shù)5 22.41 ±0.49 23.12 ±0.68 22.19 ±0.51模型組 5 39.67 ±1.13☆ 62.98 ±1.59☆ 53.65 ±1.98☆頭針組 5 34.98 ±1.86☆△48.66 ±2.21☆△ 36.23 ±1.82☆△

2.4 不同時間點各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)腦組織中NF-κB蛋白含量較低，僅為0.41±0.001。模型組大鼠在再灌注1天，缺血側(cè)腦組織中NF-κB蛋白含量即出現(xiàn)明顯增加;至再灌注3天達(dá)高峰，隨后含量有所減低，再灌注7 d時其含量降為0.79±0.003，但仍明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。而頭針組大鼠在再灌注后各時間點缺血側(cè)腦組織中NF-κB蛋白含量均較同期模型組明顯降低(P ＜0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB蛋白條帶及相對含量比較

表4 各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB表達(dá)相對蛋白含量比較(±s)

表4 各組大鼠缺血側(cè)腦組織NF-κB表達(dá)相對蛋白含量比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，☆P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手術(shù)組組別 例數(shù)5 0.41 ±0.001 0.41 ±0.001 0.41 ±0.001模型組 5 0.66 ±0.005☆ 0.99 ±0.001☆ 0.79 ±0.003☆頭針組 5 0.60 ±0.003☆△0.82 ±0.002☆△ 0.56 ±0.006☆△

2.5 不同時間點各組大鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α的ELISA檢測結(jié)果

假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)腦組織中TNF-α蛋白含量較低，且不同時間點TNF-α蛋白含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。模型組大鼠在再灌注1天，缺血側(cè)腦組織中TNF-α蛋白含量即出現(xiàn)明顯增加;至再灌注3天達(dá)高峰，隨后含量有所減低，再灌注7天時其含量降為4.06 ±0.29，但仍明顯高于假手術(shù)組(P ＜0.05)。而頭針組大鼠在再灌注后各時間點缺血側(cè)腦組織中TNF-α蛋白含量均較同期模型組明顯降低(P＜0.05)。見表 5。

表5 各組大鼠血清中TNF-α含量比較(±s，ng/L)

表5 各組大鼠血清中TNF-α含量比較(±s，ng/L)

注:與假手術(shù)組比較，☆P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

1 d 3 d 7 d假手術(shù)組組別 例數(shù)10 2.41 ±0.43 2.44 ±0.21 2.41 ±0.19模型組 10 5.24±0.68☆ 6.78±0.71☆ 4.06±0.29☆頭針組 10 3.93 ±0.55△☆ 5.08 ±0.18△☆ 2.99 ±0.65△☆

3 討論

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指缺血的腦組織經(jīng)血液再灌注后，腦組織的損傷較缺血前更加嚴(yán)重的現(xiàn)象［4］。腦缺血再灌注損傷的病理生理進(jìn)程極其復(fù)雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥級聯(lián)反應(yīng)是CIRI的重要機制之一。而NF-κB信號通路與炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生最密切相關(guān)［5］。腦缺血再灌注后腦組織細(xì)胞受內(nèi)毒素、氧自由基及炎癥相關(guān)因子等多種因素刺激后，激活NF-κB信號通路，被激活的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)［6］，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的 NF-κB能調(diào)控諸如 TNF-a、IL-1β等炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)，從而介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生［7］。因此，NF-κB是缺血再灌注損傷過程中的重要介質(zhì)之一，早期阻斷NF-κB的表達(dá)是防治腦缺血再灌注損傷的有效途徑之一。

TNF-a是一種多效能的炎性細(xì)胞因子，人體正常情況下，血漿中僅有少量TNF-a表達(dá)，以助機體提高免疫能力，促進(jìn)組織修復(fù)和愈合。腦缺血發(fā)生后早期即出現(xiàn)TNF-a表達(dá)增加，通過促進(jìn)相關(guān)的黏附分子和趨化因子表達(dá)，一方面誘導(dǎo)損傷局部的炎性細(xì)胞浸潤，引起局部的炎性反應(yīng)，另一方面這些黏附分子和趨化因子反過來又可以激活NF-κB，從而使NF-κB活化在組織間不斷擴散，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)［8］，加重CIRI。

本實驗通過復(fù)制MCAO/R大鼠模型，應(yīng)用免疫組化、Western blot和ELISA等檢測方法，探討頭穴透刺對大鼠腦缺血再灌注后炎癥級聯(lián)反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用的NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):腦缺血再灌注后在缺血側(cè)腦組織中存在明顯的NF-κB、TNF-a陽性細(xì)胞反應(yīng)性增多和蛋白表達(dá)上調(diào)，表明腦缺血、損傷及炎癥等因素確實可激活NF-κB信號通路;上調(diào)的NF-κB、TNF-a可導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展。而早期的百會透曲鬢頭針干預(yù)能夠降低腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損，對腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。同時早期的百會透曲鬢頭針干預(yù)能夠降低缺血側(cè)腦組織中NF-κB、TNF-a陽性細(xì)胞數(shù)和蛋白表達(dá)，表明百會透曲鬢頭針療法可能是通過抑制NF-κB的激活、降低TNF-a的表達(dá)，減輕腦缺血再灌注后NF-κB信號通路激活導(dǎo)致的相關(guān)級聯(lián)損傷。因此，筆者推測百會透曲鬢頭針療法可能通過抑制腦缺血再灌注后缺血腦組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)，從而降低缺血再灌注后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，繼而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)的作用，為臨床防治缺血性腦血管病提供了新的臨床思路。

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Effect of GV20-GB7 Scalp-acupuncture on the Protein Expressions of NF-κB and TNF-α in MCAO/R Rats

WU Ming-juan1，SUN Xiao-wei2△，LU Jin-rong3，SHA Li-li1，ZHANG Xue1，ZHAO Yan1，LI Rui1，CHENG Kang-lu1，WAN Jin1
(1.Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Science，Harbin 150036，China;2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the effect of GV20-GB7 scalp-acupuncture on the expression of nuclear factor-κβ(NF-κβ)and tumor nerosis factor-α(TNF-α)in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.Methods:70 SD rats(male)were randomly divided into the sham group，the model group，and the scalpacupuncture group.The models were established by MACAO/R method.Therapy of needling GV20-GB7 at the trouble side was applied in the scalp-acupuncture group.Neurological function scores were used to measure the degree of neurological impairment at different time point in the groups.The qualitative and the quantitative protein expressions of NF-κB and TNF-a were detected by immunohistochemistry，Western blot and ELISA methods.Results:The degree of neurologic defect was alleviated significantly in the scalp-acupuncture group than that in the model group，and there was significant difference between the two groups in terms of mNSS score on 3rd and 7th day of the reperfusion(P ＜0.05).The contents of NF-κB and TNF-a were obviously increased in the model group and the scalp-acupuncture group，which were both higher than those in the sham operation group(P ＜0.05)，but they were much lower in the scalp-acupuncture group than those in thecontrol group at the same time point(P ＜0.05).Conclusion:GV20-GB7 scalp-acupuncture can obviously improve nerve function in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury，it has protective effect on nerve，which mechanism may be related to the inhibition of protein expressions of NF-κB and TNF-a and inflammation reduction.

Point-to-point scalp acupuncture;GV20;GB7;Cerebral ischemia/reperfusion injury;NF-κB;TNF-a

R246.6

A

1005-0779(2017)10-0064-04

黑龍江省自然科學(xué)基金，編號:H2016045;黑龍江省博士后資助項目，編號:LHB-Z12248。

吳明娟(1964-)，女，副主任醫(yī)師，研究方向:針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與機理研究。

△通訊作者:孫曉偉(1979-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在站博士后研究人員，研究方向:針灸治療神經(jīng)及精神系統(tǒng)疾病的臨床與機理研究。

2017-04-31